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Das zeitgleiche Auftreten eines ischämischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien können als über die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solitärem ischämischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein könnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv präsentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entzündungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrität erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter Östrogen-Applikation (E2) durchgeführt, um die mögliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entzündungsmediatoren (INF) führte gegenüber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. Überwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrität, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung“ oder ein „Reperfusionsschaden“ vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegenüber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden“. Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Homöostase des ZNS würde in vivo beeinträchtigt, Katecholamine sowie Entzündungsmediatoren könnten ungehindert das bereits durch die Ischämie geschädigte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem Verständnis der molekularen BHS-Veränderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem ischämischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zukünftig pathogenetische Hintergründe weiter erforschen zu können. Darauf aufbauend könnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden.
Ziel dieser Arbeit war der Nachweis eines neuroprotektiven Effektes von STVNA auf cerebEND Zellen der Maus in einem in vitro Modell des Schlaganfalls. Mit dem Verfahren zur Herstellung von STVNA konnte ein reines und im Vergleich zu Isosteviol in Wasser gut lösliches Produkt hergestellt werden, das die Anforderungen an eine Versuchssubstanz in einem in vitro Modell voll erfüllen konnte. Als in vitro Modell wurde das bereits bewährte Verfahren der OGD gewähl. CerebEND Zellen der Maus wurden für 4 h OGD ausgesetzt und anschließend für 4 h und 24 h mit 0, 1, 5, 10 und 20 mg/l STVNA behandelt. Direkt, 4 h und 24 h nach 4 h OGD wurden die jeweiligen Zellen geerntet und mittels Western Blot und qRT-PCR ausgewertet. Es wurden eine erhöhte Expression der Tight-Junction-Proteine Claudin-5 und Occludin, sowie ein stabilisierendes Expressionsverhalten der Transmembranproteine Integrin a 1 und Integrin a v nach Behandlung mit STVNA nachgewiesen. Ebenso wurde eine verminderte Expression des Glukosetransporters GLUT 1 beobachtet. Eine Volumenreduktion der cerebEND Zellen durch STVNA, während 4h OGD und gleichzeitiger Behandlung mit STVNA konnte ebenfalls festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit stützen die Thesen und Ergebnisse der aktuellen Literatur, dass STVNA neuroprotektive Eigenschaften hat.
Der Schlaganfall ist eine Krankheit mit großer Bedeutung, sowohl für die Betroffenen wie auch unter volkswirtschaftlichen Gesichtspunkten. In der Erforschung neuer und besserer Therapiemethoden für den ischämischen Schlaganfall ist ein gutes in-vitro-Modell der Blut-Hirn-Schranke unerlässlich, da ein Teil der Schädigung des ZNS durch einen Zusammenbruch dieser Barriere verursacht wird.
Die hCMEC/D3-Zelllinie stellt ein solches Modell dar; mit steigender Dauer der ischämischen Stoffwechsellage zeigt sich eine Erhöhung der LDH-Konzentration als Marker für das Absterben der Zellen sowie ein Rückgang der Zellvitalität. Zudem lässt sich eine Entzündungsreaktion mit Anstieg der Marker TNF-Alpha und VEGF, sowie tendenziell auch von Interleukin 6 und Interleukin 8 beobachten, welche auch auf eine Barriereschwächung hindeutet. Aus vorherigen Versuchen bekannte Tight junctions-Proteine wie Claudin 1 und Occludin waren in D3-Zellen unter ischämischen Bedingungen nicht verändert, Claudin 5 war in der PCR vermindert exprimiert. Die für die Barriereschwächung verantwortlichen Strukturproteine müssen durch weitere Versuche identifiziert werden. Eine mögliche Erhöhung der Expression des Transkriptionsfaktors ZO-1 könnte unter diesen Bedingungen einen Mechanismus der Barriereschwächung darstellen.
Die Expression des Glukokortikoidrezeptors war in Monokultur-Versuchen mit D3-Zellen nach Ischämie erniedrigt. Dies stellt eine Gemeinsamkeit mit Versuchen mit Zelllinien tierischen Ursprungs dar; in diesen zeigten die Zellen durch Degradation des Glukokortikoidrezeptors ein fehlendes Ansprechen auf eine Glukokortikoid-Behandlung. In der Cokultur der D3-Zellen mit Gliomzellen der C6-Zelllinie zeigte sich jedoch eine Erhöhung der GR-Expression. Eine Cokultur kann den komplexen Aufbau der Blut-Hirn-Schranke, mit Beteiligung mehrerer Zelltypen, besser darstellen als Versuche mit nur einer Zelllinie. Die Erhöhung der GR-Expression in diesem humanen in-vitro-Modell der Blut-Hirn-Schranke steht im Gegensatz zu den in-vitro-Versuchen mit anderen Zelllinien. Dies könnte eine mögliche Erklärung liefern, warum die Erkenntnisse aus diesen Versuchen bisher nicht zu einer Verbesserung der Evidenz der Glukokortikoid-Therapie beim ischämischen Schlaganfall beigetragen haben. Zudem zeigt die Fluoreszenzfärbung von D3-Zellen, dass diese auch unter Ischämie auf Glukokortikoide reagieren.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bildet eine Barriere, die das ZNS vor dem Einfluss der Substanzen aus der Peripherie schützt. Die Aufrechterhaltung dieser wichtigen Struktur ist für die Homöostase und Vermeidung von Schäden im ZNS von besonderer Bedeutung. Eine häufige Ursache für die Schädigung der BHS ist der ischämische Schlaganfall. In der Hypoxie werden zahlreiche Proteine degradiert oder von den Zellkontakten delokalisiert, die für die Integrität der Zell-Zell-Kontakte eine wichtige Rolle spielen. Als Folge resultiert eine Destabilisierung der BHS mit vermehrtem Durchstrom von ZNS-schädigenden Substanzen.
Seit der Entdeckung von miRNAs (Lee et al., 1993) konnte deren Rolle vor allem in der Entstehung von Tumoren und Entzündungen nachgewiesen werden. In der Arbeitsgruppe Förster wurde eine vermehrte Expression von miRNA-132 und miRNA-212 nach OGD festgestellt. Als Zielgene von miRNA-132/212 konnten Cldn1, Tjap1, MMP9 und Jam3 detektiert werden. Die Validierungsversuche wurden an einem etablierten In-vitro-Modell der BHS bestehend aus murinen cerebralen Hirnendothelzellen (cEND-2) durchgeführt.
Zu Beginn wurden die Bedingungen zur Kultivierung der Zellen unter Hypoxie und ohne Glucose (eng. oxygen glucose deprivation, OGD) mit und ohne Astrozyten-konditioniertem Medium etabliert. Expression von diversen Genen, die bekannt sind eine Rolle in der OGD zu spielen, wurden mittels qPCR ermittelt. Dabei kam es zu signifikanten Veränderungen der Genexpression von wichtigen Genen in der BHS, die besonders in Kombination mit Astrozyten-konditioniertem Medium noch verstärkt werden konnten. So wurde die Kultivierung der Zellen für die weiteren OGD-Versuche in Astrozyten-konditioniertem Medium gewählt.
Des Weiteren wurde die Regulation von miRNA-132/212 auf die Zielgene an der BHS untersucht. Die hemmende Wirkung der miRNAs auf die Genexpression der Zielgene konnte durch Transfektion von pre-miR-132/212 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden. In der OGD konnte durch Hemmung der vermehrt exprimierten miRNA-132/212 ein Anstieg der Zielgene beobachtet werden. Damit konnten sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebenen Cldn1, Tjap1, Jam3 und MMP9 als Zielgene bestätigt werden. Zusätzlich wurden als funktionelle Tests eine TEER-Messung für den Widerstand und eine Permeabilitätsmessung durchgeführt. Beide Tests bestätigten die Destabilisierung der BHS nach Transfektion von miRNA-132/212.
Als therapeutische Implikation könnte durch Inhibition von miRNA-132/212 bei einer Minderperfusion des Gehirns die Barriere stabilisiert werden, was eine neue Möglichkeit in der Therapie des akuten Schlaganfalls bietet.
Ziel dieser Arbeit ist es, anhand dreier quantitativer, systematischer Übersichtsarbeiten (Cochrane Reviews) die Möglichkeiten und Grenzen der EBM zu beleuchten. Dabei wird exemplarisch die Verwendung von hyperbarem Sauerstoff zur Therapie von chronischen Wunden, eines akuten ischämischen Schlaganfalls, sowie von Migräne- und Clusterkopfschmerzen untersucht.