Refine
Has Fulltext
- yes (2)
Is part of the Bibliography
- yes (2)
Year of publication
- 2011 (2) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (2)
Language
- German (2) (remove)
Keywords
- amino acids (2) (remove)
Institute
Das Ziel vorliegender Arbeit war die Entwicklung einer HPLC-MS(/MS)-Methode, die im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle zur direkten Quantifizierung von Aminosäuren (AS) in Infusionslösungen angewendet werden kann. Die Zielset-zung schloss eine Validierung innerhalb der für die Zweckbestimmung vorgesehenen Grenzen ein. Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das ESI-MS/MS-Fragmentierungs-muster von 21 Aminosäuren, von 20 stabil-isotopenmarkierten Aminosäuren, die als interne Standards verwendet wurden, sowie von einigen weiteren Substanzen bestimmt. Nach Kenntnis von Precursor- und Produktionen erstellte man eine SRM-Methode zur spezifischen MS/MS-Analyse. Dabei wurden durch das jeweilige Frag-mentierungsmuster bedingte Interferenzen bei den zu untersuchenden Aminosäuren bestimmt, die bei der zu erarbeitenden HPLC-MS-Methode beachtet werden mussten. Die Methodenentwicklung zur HPLC-MS-Analytik von underivatisierten AS umfasste mit der RP-HPLC unter Verwendung eines Ionenpaarreagenzes (IP) und der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) zwei verschiedene chromatographi-sche Ansätze. Bei der Anwendung der RP-HPLC ergaben sich Probleme. Die Verwendung eines IP, im vorliegenden Fall TDFHA (Tridecafluorheptansäure), führte zu langen Equilibrierungs-, Re-Equilibrierungs- und Spülzeiten und damit bei zwar relativ kurzer HPLC-Laufzeit zu einem aber insgesamt hohen Zeitaufwand. Gleich-zeitig war die LC-MS-Anlage auf diese Anwendung fixiert, da das Ionenpaarreagenz das Gerät stark verschmutzte und dadurch andere Analysen erheblich störte. Zudem waren die Retentionszeiten der Analyten trotz langer Equilibrierungszeiten schlecht reproduzierbar, so dass eine solche Methode im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle schwer validierbar wäre. Weiterführende Untersuchungen erfolgten daher nicht. In nachfolgenden Studien mit der HILIC wurden verschiedene Einflussparameter (Anteil organischer Phase im Fließmittel, pH-Wert des Fließmittels, Temperatur der Säule, Pufferkonzentration im Fließmittel, Gradientenelution) auf die Trennung der AS an einer ZIC®-HILIC-Säule untersucht. Durch Optimierung der Parameter wurde so eine HILIC-HPLC-Methode entwickelt, bei der 21 AS und 20 ihrer isotopen-markierten Referenz-AS innerhalb von 20 min eluierten. Diejenigen AS, bei denen im Rahmen der Fragmentierungsstudien Interferenzen aufgrund gleicher bzw. ähnlicher Massen der Precursor- bzw. Produktionen aufgetreten waren, wurden chroma-tographisch getrennt. Gleichzeitig hat sich die SIM-Analyse als anwendbar erwiesen. Die Anwendung des spezifischeren SRM-Modus und damit der Tandem-Massenspektrometrie war nicht erforderlich. Im Rahmen der nachfolgenden Studien zur Validierung ergab sich, dass die entwickelte Methode über einen weiten Bereich eine lineare Abhängigkeit zwischen Konzentrations- und Messwerten zeigte. Für drei der 21 AS (NAcCys, NAcTyr, Pro) wurde die quadratische Regression mit dem Anpassungstest nach Mandel als geeig-neteres Regressionsmodell ermittelt. Bei Untersuchungen zur Wiederfindung wurde ein Einfluss der Matrix-Lösung der Infusionslösung festgestellt, der zu Abweichungen hinsichtlich des Quotienten AreaAS / AreaIS führte, so dass eine Quantifizierung innerhalb der geforderten Grenzen bei Kalibrierung über reine Standardlösungen nicht möglich war. Die Validierung wurde daher nachfolgend in der Matrixlösung durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass mit der entwickelten HILIC-HPLC-MS-Methode Aminosäuren in Infusionslösungen mit hoher Präzision und Richtigkeit bestimmt werden können. Neun der 21 untersuchten AS konnten im Bereich von 30% - 350%, zehn weitere im Bereich von 50% - 350% innerhalb der zur Gehaltsbestimmung von pharmazeutischen Formulierungen vorgeschriebenen Grenzen (Wiederfindung Einzelbestimmung: 98% -102.0%, Mittelwert einer Dreifachbestimmung: 98.5% – 101.5%) quantifiziert werden. Für His und Phe gelang allerdings keine Quantifizierung innerhalb der Akzeptanzkriterien, wobei der Grund hierfür in weiteren Studien geklärt werden müsste. Mit der entwickelten Methode ist damit eine gleichzeitige Quantifizierung verschiedener AS-Infusionslösungsformulierungen möglich, die sich bei gleicher Matrix in der Konzentration an AS unterscheiden. Beispielsweise seien hier die Formulierungen „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ genannt, die mit der validierten Methode erfassbar sind. Die Probenvorbereitung beschränkt sich dabei auf den Zusatz der IS-Formulierung zur Infusionslösung und einen Verdünnungsschritt. Die Quanti-fizierung erfolgt über eine 5-Punkt-Kalibriergerade, die aus einer AS- und IS-Standardmischung, nach Zusatz der einfach herzustellenden Elektrolyt-Matrix, erstellt wird. Die Analysenzeit der HPLC-MS-Methode beträgt einschließlich Equilibrie-rungszeit 35 min und ist damit deutlich kürzer als die 120 min, die bei der nach wie vor zur AS-Analytik allgemein gebräuchlichen Ionenaustauschchromatographie mit Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung anzusetzen sind.
Kapillarelektrophoretische Reinheitsanalytik verschiedener Arzneistoffe des Europäischen Arzneibuchs
(2011)
Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die wässrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit für die Reinheitsanalytik der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgeführt ist. Um eine Trennmethode für (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu können, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gewählt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu können (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Moleküle besser ausgeprägt und die Intensität der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarität und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminosäuren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn nötig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. Für jede DL-Aminosäure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Geräteeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgeführt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpräzision (Auflösung, Migrationszeiten, Verhältnis der korrigierten Peakflächen und Anzahl der theoretischen Böden) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden präzise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminosäuren führten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenstärke und pH-Wert konnte für alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollständig voneinander getrennt werden konnten. Während mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kostengünstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigsäure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbrüchen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine wässrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytlösung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Präzision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte.