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Aspekte der Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung mittels kontinuierlicher Ultrafiltration
(2013)
Die Plasmaproteine dienen dem Körper u.a. als Transportproteine. Dem Serumal-bumin kommt hierbei die größte Bedeutung zu. Aufgrund seiner Aufgabe weist es eine Reihe unterschiedlicher Bindungsstellen für eine Vielzahl unterschiedlichster Liganden auf, wobei die Bindung von Substanzen sowohl an spezifischen Stellen als auch unspezifisch erfolgen kann. Das Ausmaß dieser Bindungen hat Einfluss auf andere pharmakokinetische Parameter, wie die Bioverfügbarkeit und die Elimination eines Arzneistoffes. Treten mehrere Stoffe in Wechselwirkung mit dem Albumin, so können sich diese gegenseitig in ihrer Bindung beeinflussen. Das Ausmaß der Beeinflussung ist von der Höhe der Bindung der einzelnen Stoffe und dem zugrunde liegenden Bindungsmechanismus abhängig. Die klinische Relevanz der Beeinflussung hängt von der therapeutischen Breite und von zusätzlich auftretenden Wechselwirkungen, der Substanzen wie z.B. wechselseitige Inhibition der Stoffwechselenzyme der Substanzen ab. Für die experimentelle Bestimmung der Proteinbindung stehen eine Reihe von Me-thoden zur Verfügung, die sich im Messprinzip, dem apparativen Aufwand und der Simulation der physiologischen Bedingungen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde die kontinuierliche Ultrafiltration verwendet. Diese stellt die Bedingungen im Körper nach und ermöglicht die Bindungskinetik besser zu betrachten als andere Verfahren, da durch die Titration des Albumins mit der Arzneistofflösung die Wechselwirkung zwischen Arzneistoff und Protein über einen breiten Konzentrationsverlauf beobachtet werden. Die Methode wurde von Heinze etabliert, von Albert weiterentwickelte und jetzt opti-miert. Durch die Konstruktion neuer Messzellen sowie der Entwicklung eines neuen Puffersystems konnte sie für Substanzen zugänglich gemacht werden, die aufgrund ihrer hohen Lipophilie und ihrer starken Adsorption an die Messzellen bisher nicht messbar waren. Darüber hinaus wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt: a) Es wurde die gegenseitige Verdrängung von zwei Arzneistoffen aus der Proteinbindung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich eine Reihe basischer Arzneistoffe durch saure Arzneistoffe verdrängen ließ, so z.B. Imipramin HCl durch Phenprocoumon. Das dem Phenprocoumon strukturell sehr ähnliche Warfarin rief diese Verdrängung hingegen nicht hervor. Tryptophan, das in HPLC Experimenten die Bindung von Imipramin HCl verringerte [117], hatte im Ultrafiltrationsexperiment keinen Einfluss auf dessen Bindung. Die gegenseitige Beeinflussung zweier Stoffe kann folglich sehr unterschiedlich sein und ist schwer vorhersagbar. Des Weiteren sind die Ergebnisse solcher Bestimmungen stark von der gewählten Methode abhängig und dadurch nur schwer zu vergleichen. Aufgrund der komplexen und uneinheitlichen Wechselwirkungen der basischen und sauren Arzneistoffe in Bezug auf ihre Bindung, kann davon ausgegangen werden, dass basische Arzneistoffe eine Bindestelle an Albumin besitzen. Jedoch lässt sich aus der vorliegenden Messung nicht beurteilen, wie spezifisch basische Stoffe an Albumin binden. b) Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Derivate des Acetylcysteins, die kovalent an Cys34 binden können, unterschiedliche Veränderung im Bindungsverhalten von Albumin hervorrufen. So nahm die Bindung des Diphenhydraminhydrochlorids in Gegenwart von äquimolaren Mengen Acetylcystein und Cysteamin ab, während die Anwesenheit von Acetylcysteamin den gegenteiligen Effekt hatte. Dies zeigt, dass der Veränderung der Bindung ein komplexerer Zusammenhang als die reine Belegung des Cys34 zugrunde liegen muss. c) Unterschiede in der Proteinbindung von Ephedrin und seiner Stereoisomere konnten mittels kontinuierlicher Ultrafiltration bestätigt werden. Die Abweichungen in den Ergebnissen in Bezug auf andere Bestimmungsmethoden [130-132] zeigten erneut, wie stark die Messung der Proteinbindung von den Versuchsbedingungen abhängt. d) Für die Messung des antiinfektiven Bisnaphthalimids MT02 wurde eine Messzelle aus PVDF konstruiert, die weniger Wechselwirkungen mit adsorbierenden Arzneistoffen zeigt. Aufgrund der Unbeständigkeit der Substanz unter den Versuchsbedingungen war die Messung dennoch nicht möglich. e) Die Proteinbindung des Naphthylisochinolins GB AP05 konnte mit Hilfe der bereits erwähnten neu konstruierten Messzelle bestimmt werden. Die Bindung war deutlich höher als bei anderen Vertretern dieser Gruppe. Die Ursache hierfür könnte in der Adsorption der Substanz an die Messzellen begründet sein. Da GB AP05 stark an den Kunststoff PMMA binden kann, der aufgrund seiner Beschaffenheit vorwiegend Wasserstoffbrückenbindungen für eine Adsorption bereitstellen kann, ist eine hohe Bindung an Albumin, das eine Vielzahl von Bindestellen mit unterschiedlichen chemischen Gruppen aufweist, nicht unwahrscheinlich. f) Für eine Reihe von Fluorchinoloncarboxamiden wurde das Ausmaß ihrer Protein-bindung bestimmt. Dieses lag in fast allen Fällen bei 80 % oder höher. Die einzigen Ausnahmen, GHQ237Ox und GHQ243Ox, legen den Schluss nahe, dass eine basi-sche Seitenkette in Position 1 und das Fehlen des Fluorsubstituenten in Position 6 die Bindung reduzieren können. Da nicht alle Substanzen in der Pufferlösung gelöst werden konnten, wurde neben dem bereits durch Albert etablierten DMSO-haltigen Puffer ein Polysorbat 20 haltiger entwickelt, in dem hoch lipophile Substanzen mizellar gelöst werden können. Durch Bestimmung der Proteinbindung von Carbamazepin konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit der Mizellen keinen Einfluss auf die Bindung hat, d.h. im Umkehrschluss dass die Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung geeignet ist.