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OMB and ORG-1
(2002)
Members of the T-box gene family encode transcription factors that play key roles during embryonic development and organogenesis of invertebrates and vertebrates. The defining feature of T-box proteins is an about 200 aa large, conserved DNA binding motif, the T domain. Their importance for proper development is highlighted by the dramatic phenotypes of T-box mutant animals. My thesis was mainly focused on two Drosophila T-box genes, optomotor-blind (omb) and optomotor-blind related 1 (org-1), and included (i) a genetic analysis of org-1 and (ii) the identification of molecular determinants within OMB and ORG-1 that confer functional specificity. (i) Genetic analysis of org-1 initially based on a behavioral Drosophila mutant, C31. C31 is a X-linked, recessive mutant and was mapped to 7E-F, the cytological region of org-1. This pleiotropic mutant is manifested in walking defects, structural aberrations in the central brain, and "held-out" wings. Molecular analysis revealed that C31 contains an insertion of a 5' truncated I retrotransposon within the 3' untranslated transcript of org-1, suggesting that C31 might represent the first org-1 mutant. Based on this hypothesis, we screened 44.500 F1 female offspring of EMS mutagenized males and C31 females for the "held-out" phenotype, but failed to isolate any C31 or org-1 mutant, although this mutagenesis was functional per se. Since we could not exclude the possibility that our failure is due to an idiosyncracy of C31, we intended not to rely on C31 in further genetic experiments and followed a reverse genetic strategy . All P element lines cytologically mapping to 7E-7F were characterized for their precise insertion sites. 13 of the 19 analyzed lines had P element insertions within a hot-spot 37 kb downstream of org-1. No P element insertions within org-1 could be identified, but several P element insertions were determined on either side of org-1. The org-1 nearest insertions were used for local-hop experiments, in which we associated 6 new genes with P insertions, but failed to target org-1. The closest P elements are still 10 kb away from org-1. Subsequently, we employed org-1 flanking P elements to induce precise deletions in 7E-F spanning org-1. Two org-1 flanking P elements were brought together on a recombinant chromosome. Remobilization of P elements in cis configuration frequently results in deletions with the P element insertion sites as deficiency endpoints. In a first attempt, we expected to identify deficiencies by screening for C31 alleles. 8 new C31 alleles could be isolated. The new C31 chromosomes, however, did not carry the desired deletion. Molecular analysis indicated that C31 is not caused by aberrations in org-1, but by mutations in a distal locus. We repeated the P element remobilization and screened for the absence of P element markers. 4 lethal chromosomes could be isolated with a deletion of the org-1 locus. (ii) The consequences of ectopic org-1 were analyzed using UAS-org-1 transgenic flies and a number of different Gal4 driver lines. Misexpression of org-1 during imaginal development interfered with the normal development of many organs and resulted in flies with a plethora of phenotypes. These include a homeotic transformation of distal antenna (flagellum) into distal leg structures, a strong size reduction of the legs along their proximo-distal axis, and stunted wings. Like ectopic org-1, ectopic omb leads to dramatic changes of normal developmental pathways in Drosophila as well. dpp-Gal4/ UAS-omb flies are late pupal lethal and show an ectopic pair of wings and largely reduced eyes. GMR-Gal4 driven ectopic omb expression in the developing eye causes a degeneration of the photoreceptor cells, while GMR-Gal4/ UAS-org-1 flies have intact eyes. Hence, ectopic org-1 and omb induce profound phenotypes that are qualitatively different for these homologous genes. To begin to address the question where within OMB and ORG-1 the specificity determinants reside, we conceptionally subdivided both proteins into three domains and tested the relevance ofthese domains for functional specificity in vivo. The single domains were cloned and used as modules to assemble all possible omb-org-1 chimeric trans- genes. A method was developed to determine the relative expression strength of different UAS-transgenes, allowing to compare the various transgenic constructs for qualitative differences only, excluding different transgene quantities. Analysis of chimeric omb-org-1 transgenes with the GMR-Gal4 driver revealed that all three OMB domains contribute to functional specificity.
Viren durchliefen eine gemeinsame Evolution mit ihren Wirtsorganismen, die zu einer spezifischen Anpassung der Viren an ihren jeweiligen Wirt führte. Als Folge dessen verfügen viele Viren über ein eng begrenztes Wirtsspektrum. Gelegentlich machen Viren Veränderungen durch, die es ihnen erlauben, einen neuen Wirt zu infizieren und in ihm zu replizieren, wie dies in jüngster Vergangenheit beim humanen Immundefizienz-Virus oder beim Grippevirus geschehen ist. Spezies-übergreifende Infektionen sind für die meisten neuen und wiederauftauchenden Viruserkrankungen verantwortlich. Allerdings ist bisher wenig über die Mechanismen bekannt, die Viren auf einen bestimmten Wirt beschränken, und welche Faktoren Viren zur Überwindung der Spezies-Barriere und zur Vermehrung in einer neuen Wirtsspezies benötigen. Cytomegaloviren sind Prototypen der beta-Herpesvirus Unterfamilie und verfügen über eine ausgeprägte Spezies-Spezifität. Sie vermehren sich nur in Zellen der eigenen oder einer eng verwandten Wirtsspezies. Der molekulare Mechanismus, der dieser Spezies-Spezifität zugrunde liegt, ist noch weitgehend unbekannt und stellt deshalb das Thema dieser Arbeit dar. Initiale Beobachtungen zeigten, dass sich das Maus-Cytomegalovirus (MCMV) ausschließlich in menschlichen 293 und 911 Zellen, aber keiner anderen getesteten menschlichen Zelle vermehren ließ. Diese beiden Zelllinien sind mit Adenovirus E1-Genen transformiert, die den Transkriptions-Transaktivator E1A sowie zwei Apoptose-Inhibitoren (E1B-55k und E1B-19k) kodieren. Daher lag die Hypothese nahe, dass diese Funktionen benötigt werden, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass normale menschliche Zellen nach Infektion rapide absterben, und zwar durch eine Caspase-9-vermittelte Apoptose. Die Induktion der Apoptose durch MCMV lässt sich durch Caspase-Inhibitoren unterdrücken, wodurch die virale Replikation wiederhergestellt wird. Dies deutet auf eine Schlüsselfunktion der Caspasen für diesen Prozess hin. Durch Überexpression eines mitochondrialen Apoptose-Inhibitors, d.h. eines Bcl-2-ähnlichen Proteins, in menschlichen Zellen ließ sich die Virus-induzierte Apoptose verhindern. Diese Zellen erlaubten ebenfalls eine effiziente MCMV-Replikation. Die Bedeutung Bcl-2-ähnlicher Proteine für die Spezies-übergreifende Cytomegalovirus-Infektion wurde sowohl durch die Integration korrespondierender Gene, alsauch durch die Integration anderer Inhibitioren der Apoptose oder von Kontroll-Genen in das MCMV Genom bestätigt. Nur rekombinante Viren, die ein Bcl-2-ähnliches Protein kodieren, konnten in menschlichen Zellen vermehrt werden. Ein einziges Gen des humanen Cytomegalovirus, das einen mitochondrialen Apoptose-Inhibitor kodiert, reichte aus, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass dieselben Prinzipien für eine Replikation des Ratten-Cytomegalovirus in menschlichen Zellen gelten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Induktion der Apoptose eine Spezies-übergreifende Infektion bei den Nagetier-Cytomegaloviren einschränkt.