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For the quality assurance of substances for pharmaceutical use, a variety of analytical techniques are available to address specific analytical problems. In this field of application, liquid chromatography (LC) stands out as the gold standard in the pharmaceutical industry. Various detectors can be employed, which are e.g. based on UV/Vis spectroscopy for the examination of molecules with a chromophore, or mass spectrometry (MS) for structural elucidation of analytes. For the separation of enantiomers, the use of capillary electrophoresis (CE) may be more favorable due to the high separation efficiency and easy-to-use and comparatively inexpensive chiral selectors, in contrast to chiral columns for LC, which are usually very expensive and limited to a restricted number of analytes. For structure elucidation in impurity profiling, one- and multidimensional 1H NMR spectroscopy is a valuable tool as long as the analyte molecule has got nuclei that can be detected, which applies for the magnitude of organic pharmaceutical substances.
For the evaluation of the amount of mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) in various paraffin samples from different suppliers, a straightforward method based on 1H NMR spectroscopy was elaborated. The MOAH/MOSH ratio was used to indicate the amount of MOAH of paraffins and to evaluate the extent of refining. In addition, a representative paraffin sample was measured without sample solvent at high temperatures (about 340 K) to avoid the interfering residual solvent signals in the spectral regions of interest. The results of both methods were in good accordance.
Moreover, the 1H NMR results were complemented with the UV measurements from the purity testing of paraffins according to the DAB 8. Correlations of the NMR and UV spectroscopic data indicated a linear relationship of both methods for the determination of MOAH in paraffins.
Finally, the 1H NMR data was evaluated by principal component analysis (PCA) to explore differences within the paraffin samples and the spectral regions in the 1H NMR spectrum which are responsible for the formation of groups. It could be found that most variation is due to the MOSH of the paraffins. The PCA model was capable of differentiating between soft, liquid and solid paraffins on the one hand and between natural and synthetic liquid paraffins on the other hand.
The impurity profiling of L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (A2PMg) was performed by means of one- and two-dimensional NMR spectroscopy. Several ethylated impurities could be detected, which were likely to be formed during synthesis of A2PMg. The structures of two of the ethylated impurities were identified as ascorbic acid 2-phosphate ethyl ester and ethanol, (residual solvent from synthesis). NMR spectroscopic studies of the fractions obtained from preparative HPLC of A2PMg revealed two additional impurities, which were identified as phosphorylated derivatives of ascorbic acid, ascorbic acid 3,5-phosphate and ascorbic acid 5-phosphate.
Solid state mechanochemistry as an alternative approach for stress testing was applied on the drug substances S-Ibuprofen (Ibu) and Clopidogrel (CLP) using a ball mill, in order to study their degradation profile:
First, the isomerization of S-Ibu was investigated, which was stressed in the solid state applying several milling frequencies and durations under basic, acidic and neutral conditions. For the separation of Ibu enantiomers, a chiral CE method was developed and validated according to ICH Q2(R1). It was found that S-Ibu is overall very stable to isomerization; it shows minor conversion into the R-enantiomer under basic environment applying long milling times and high frequencies.
Last, the degradation profile of clopidogrel hydrogen sulfate (CLP) was investigated, which was stressed in the solid state under various oxidative conditions. An already existing HPLC-UV method was adjusted to sufficiently separate the degradation products, which were characterized by means of UV and MS/(MS) detection. Most of the degradation products identified were already reported to result from conventional CLP stress tests. The degradation profile of CLP was mainly influenced by the material of the milling jar and the type of catalyst used.
The stability of Trp in pure solutions and in parenteral AA formulations was evaluated with regard to typically used manufacturing processes, storage conditions and primary packaging. Therefore, thorough stability studies on Trp solutions were conducted beforehand. The applied stressing method, i.e. steam sterilization by autoclave, are chemically seen relatively mild but showed to be efficient to induce Trp degradation in the presence of oxygen. Subsequent identification, separation and characterization were challenging due to similar substance properties, numerous stereoisomers and pairs of diastereomers found amongst them. However, the identified o-aminoacetophenone compounds, Kyn and NFK, are associated with photo reactivity and have photo-oxidizing properties. Thus, best possible protection from UV-light, together with strict oxygen expulsion, are the most important criteria to impede Trp degradation after autoclaving.
The identification of Trp degradation products was assisted by the compilation of a substance library, which included manifold reported and chemically plausible Trp degradation substances. The substances were classified for priority and their early or late-stage occurrence. The large number of possible substances and stereoisomers was narrowed down with the information retrieved from LC-UV/MS experiments. However, final identification was achieved by the synthesis of proposed substances as references. The following eight substances were characterized as Trp degradation substances: Kyn, NFK and three pairs of diastereomers R,R/R,S DiOia, R,R/R,S Oia and cis/trans PIC. Fig. 33 shows the proposed degradation pathway and demonstrates the close chemical relationship, which may be an explanation for the conversion of some substances into each other during the storage period. The proposed pathway brings together the results of different Trp stability and stressing studies, respectively [89, 94, 97, 98, 103, 133]. To our knowledge, the simultaneous formation of the identified degradation substances has not been reported before and especially not under the stressing conditions applied.
The application of a traditional RP-HPLC method was compared to two developed IP-HPLC methods and a RP-HPLC methods using a modified perfluorinated column. Orthogonal analyses methods and especially the combination of UV and MS detection are necessary in order to indicate potentially undetected degradation substances. Main evaluation criteria were the separation performance, analyses time, reproducibility and feasibility. The best results upon assessment of all Trp degradation products, in both; pure Trp solutions and pharmaceutical formulations, were obtained by a traditional RP-HPLC. The optimized method was validated according to ICH guidelines Q2(R1) and meets the criteria of a stability-indicating HPLC-UV method. The validated method has a sufficient separation performance with an adequate selectivity indicating the Trp degradation substances next to each other and next to other AAs in finished pharmaceutical formulations.
The detailed knowledge of Trp degradation and the method presented may be transferred practically to the pharmaceutical industry processing Trp-containing products. In general, the findings might contribute to the quality management of such pharmaceutical products during
manufacturing and storage. Additionally, the study results provide basic information for the establishment of an impurity consideration following the ICH guidelines Q3B (R2) (impurities in new drug products) for products containing Trp. However, further development of the method applying more sophisticated detectors or more potent HPLC techniques like e.g. UHPLC and the implication of more sensitive (MS) detectors like ToF-MS would be advantageous with regard to economic and practical aspects.
Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen
(2012)
Um die Grundlagen für die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellulären Ebene aufzuklären, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entzündlichen Vorgängen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gefäß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Gedächtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgeführten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabhängige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entzündungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enthält, und Hydrocortison zeigte M1 zusätzlich einen stärkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entzündungsreiz. Die Zytotoxizität von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalfängereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabhängiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine mögliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, primären Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise für eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranständige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ansätze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren über die Testzeiträume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl über kurze (≤ 45 min) als auch über längere Zeiträume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivität der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabhängige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazelluläre NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in jüngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universitätsklinikum Zürich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 wöchiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gefäßerweiterungskapazität (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 führte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur möglichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgewählten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich höheren Verteilung ins Gehirn für die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechusäure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankengängig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den höchsten logBB-Wert und somit die höchste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu überwinden. Im Kontext einer möglichen Anwendung bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen wurde zusätzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem primären Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entzündungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverdünnungen deutliche konzentrationsabhängige Hemmeffekte um bis zu ~50 % der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beiträge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verständnis der möglichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden.
Der Gruppe der Macrogole sowie den darauf basierenden Abkömmlingen, den Macrogolfettalkoholethern, Macrogolfettsäureestern und Polysorbaten, kommt in der modernen Galenik eine wichtige Rolle zu. Dienten sie vormals nur als gewöhnliche Emulgatoren, so finden sie heutzutage vor allem im Bereich der gezielten Wirkstofffreisetzung, der Erhöhung der Bioverfügbarkeit sowie als Löslichkeitsvermittler komplexer Systeme Anwendung. Diese vielschichtigen Anwendungsgebiete erfordern, auch aufgrund der polydispersen Strukturen der Macrogole, eine reproduzierbare und aussagekräftige Analytik.
Das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) bietet zur Charakterisierung der Hilfsstoffe eine Handvoll Messgrößen, die sog. Fettkennzahlen, die eine Größenordnung vorhandener funktioneller Gruppen liefern. Zu diesen gehören Werte wie Hydroxylzahl, Iodzahl, Peroxidzahl oder Säurezahl. Diese bieten zwar einen Überblick über den Größenbereich der mittleren Kettenlängen oder einen möglichen Abbau der Strukturen, beispielsweise durch Autoxidation, jedoch geben sie keine Auskunft über die Polymerverteilung. Insbesondere diese kann jedoch, je nach Herstellungsweise, stark variieren. Außerdem ist die Methodik der Fettkennzahlenbestimmungen aufgrund der strikten Reaktionsabläufe und zahlreicher Reaktionsschritte einerseits sehr zeitaufwändig und andererseits anfällig für Fehler.
Die HPLC hat, insbesondere aufgrund der Automation, bereits seit Jahren den Status des Goldstandards in der pharmazeutischen Analytik inne. Gekoppelt mit der UV-Detektion bietet sie für zahlreiche Wirkstoffe die Möglichkeit zur schnellen, einfachen und robusten Analyse. Im Bereich der Hilfsstoffe verbreitet sich die HPLC-Analytik langsamer, da viele Hilfsstoffe keinen Chromophor aufweisen. Eine Anwendung der hochsensitiven Massenspektrometrie wäre zwar zur Detektion geeignet, würde sich für die Routineanwendung jedoch als zu komplex und kostenintensiv gestalten. Doch mit der Entwicklung der Aerosol-basierten Detektoren wie dem ELSD (evaporative light scattering detector), dem CAD (charged aerosol detector) und dem NQADTM (nano quantity aerosol detector) wurde auch für nicht-chromophore Substanzen ein Einsatz der HPLC möglich.
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Entwicklung einer HPLC-CAD-Methode, die eine möglichst große Bandbreite der Macrogole und der darauf basierenden Hilfsstoffe erfassen kann. Die Trennung erfolgte an einer C18-Trennsäule. Es wurde eine Gradienten-Methode entwickelt, die aus mehreren linearen Gradientenstufen zusammengesetzt wurde, um verschiedene Kettenlängen der Polymere besser voneinander zu trennen. Als mobile Phasen dienten Wasser und Acetonitril, denen jeweils 0.1 % Ameisensäure zugesetzt wurden.
Es konnten Macrogole im Bereich PEG 300 bis PEG 3000 mit akzeptabler Auflösung aufgetrennt werden. Diese Ergebnisse wurden für PEG 300 – 1500 mittels Massenspektrometrie verifiziert. Es konnten fünf gesättigte und zwei ungesättigte Fettsäuren, sowie zwei Fettalkohole verschiedener Kettenlängen voneinander getrennt werden. Es wurden 13 Macrogol-basierte Hilfsstoffe mit der entwickelten Methode untersucht und erfolgreich getrennt. Die Macrogolfettalkoholether, -stearate und Polysorbate wurden insoweit aufgetrennt, dass die Polymerverteilung beobachtet werden konnte.
Freie PEGs in den Hilfsstoffen wurden getrennt und identifiziert. Anhand dieser konnten unterschiedliche Herstellungsweisen zugeordnet werden. Abhängig von der mittleren Kettenlänge der verarbeiteten PEGs konnten teilweise die freien Fettsäuren bzw. -alkohole von den Estern bzw. Ethern getrennt und identifiziert werden. Im Bereich der kürzeren mittleren Kettenlängen wurden die freien Fettsäuren und -alkohole von den Estern und Ethern überlagert.
Macrogolglycerolhydroxystearat (Cremophor® RH40) wurde in seine Komponenten aufgetrennt, mit Ausnahme der linearen Monoester, die mit den freien PEGs partiell koeluierten und die Glyceroltriester, die Größenausschlusseffekte zeigten.
Die Methode wurde für Stabilitätsuntersuchungen der ungesättigten Fettsäuren, Öl- und Linolsäure, eingesetzt. Hierzu wurden diese Säuren in Lösung chemisch (Wasserstoffperoxid) und thermisch (60 °C) gestresst und in bestimmten Zeitabständen analysiert. Es zeigte sich ein zeit- und temperaturabhängiger Abbau. Die teilweise Zuordnung der Abbauprodukte erfolgte durch Bestimmung des m/z mittels Massenspektrometrie. Die Methode war geeignet, um das Ausmaß eines oxidativen Abbaus von der Hauptsubstanz zu trennen und strukturell einzuordnen.
Generell bietet die Methode eine gute Basis, die eine Vielzahl an Substanzgruppen erfassen und charakterisieren kann. Sie bietet eine Ergänzung der Fettkennzahlen, die einen verringerten Arbeitsaufwand mit sich bringt. Für spezifischere Betrachtungen (Langzeitstabilität, verwandte Substanzgruppen) stellt sie einen guten Ausgangspunkt dar.
Liquid chromatography has become the gold standard for modern quality control and purity analytics since its establishment in the 1930s. However, some analytical questions remain very challenging even today. Several molecules and impurities do not possess a suitable chromophore for the application of UV detection or cannot be retained well on regular RP columns. Possible solutions are found in derivatization procedures, but they are time consuming and can be prone to errors. In order to detect non chromophore molecules underivatized, the concept of aerosol based universal detection was established with the introduction of the evaporative light scattering detector (ELSD) in the 1970s and the charged aerosol detector (CAD) followed in 2002. These two challenging fields – polar and non chromophore molecules – are tackled in this thesis.
An overview of applications of the CAD in the literature and a comparison to its aerosol based competitors and MS is presented, emphasizing on its high sensitivity and robustness. Parameters and techniques to overcome the drawbacks of CAD, such as the use of gradient compensation or adjusted evaporation temperatures are discussed. A consideration of aspects and drawbacks of data transformation such as the integrated power function value (PFV) in the GMP environment is performed.
A method for the fatty acid analysis in polysorbate 80 that was developed on HPLC CAD was transferred to UHPLC CAD. Time and eluent savings of over 75% and 40%, respectively, as well as ways to determine the optimal CAD parameters resulted from this investigation. The evaporation temperature was determined as the most crucial setting, which has to be adjusted with care. Optimal signal to noise ratios are found at a compromise between maintaining analyte signal and reducing background noise. The incorporation of semi volatile short chain fatty acids enabled the observation of differences based on volatility of the analyte. E.g. for semi volatiles, an improved linearity by means of adjusting the PFV is achieved at values below 1.0 instead of at elevated PFVs.
Using sugars and sugar related antibiotics, a proof-of-concept was given that artificial neural networks can describe correlations between the structure and physicochemical properties of molecules and their response in CAD. Quantitative structure property relationships obtained by design of experiment approaches were able to predict the response of unseen substances and yielded insights on the response generation of the detector, which heavily relies on the formed surface area of the dried particle. Further work can substantiate upon these findings, eventually building a library of diverse eluent compositions, analytes and settings.
In order to cope with a chromatographically challenging substances, the application of ion pairing reversed phase chromatography coupled to low wavelength UV detection has been shown as a possible approach for the amino acid L asparagine. A method capable of compendial purity analysis in one single HPLC approach, thus making the utilization of the semi quantitative TLC-ninhydrin analysis obsolete, resulted from this. One cyclic dipeptide impurity (diketoasparagine) that was formerly not assessed, could be identified in several batches and added to the monograph of the Ph.Eur.
Studying ibandronate sodium with CAD and ELSD, it was found that randomly occurring spike peaks represent a major flaw of the ELSD when high sample load is present. The research with this non chromophore bisphosphonate drug furthermore shed light on possible drawbacks of mixed mode chromatography methods and ways to overcome these issues. Due to strong adsorption of the analyte onto the column, over ten injections of the highly concentrated test solution were found to be necessary to ensure reproducible peak areas. Preconditioning steps should thus be evaluated for mixed mode approaches during method development and validation.
Last, using a ternary mixed mode stationary phase coupled to CAD, a method for the impurity profiling of pamidronate disodium, also applicable to the assessment of phosphate and phosphite in four other bisphosphonate drugs, has been developed. This represents a major advantage over the Ph.Eur. impurity profiling of pamidronate, which requires two different methods, one of which is only a semi quantitative TLC approach.
Bei der Malignen Hyperthermie (MH) handelt es sich um eine autosomal-dominant vererbbare Erkrankung mit variabler Penetranz und Expressivität. Es kommt zu einem übermäßigen Calciumeinstrom in die Skelettmuskelzelle nach Triggerexposition aufgrund einer Fehlfunktion des verantwortlichen Ryanodinrezeptors (RYR1). Bei den bekannten Triggern handelt es sich um depolarisierende Muskelrelaxantien und volatile Anästhetika wie Halothan, aber auch andere Stoffe können diese Triggerfunktion ausüben. Das Phenolderivat Chlorocresol, ein in vielen Medikamenten gebräuchliches Konservierungsmittel, wird als fragliche Triggersubstanz bezüglich ihres Effektes auf die Skelettmuskulatur von MHS gegenüber MHN-Patienten im In-Vitro-Kontraktur-Test (IVCT) getestet. Zudem wurden mit der high pressure liquid chromatography (HPLC) die Serumkonzentrationen an Chlorocresol von Patienten gemessen, welche vor einer Bypassoperation eine definierte Menge eines chlorocresolhaltigen Heparinpräparates erhalten haben. Chlorocresol zeigt im IVCT eine signifikante Differenz zwischen MHN- und MHS-Patienten. Somit ließe sich dieser Stoff auch in der Diagnostik der MH einsetzen. Die Serumwerte von Chlorocresol bei Patienten, die eine definierte Dosis an chlorocresolhaltigen Heparin erhalten haben, lagen unter der Nachweisgrenze, welche wiederum deutlich unter der im IVCT gefundenen für eine Muskelkontraktur erforderlichen Mindestkonzentration an Chlorocresol lag. Folglich scheint keine Gefahr für MH-Träger, durch Gaben von üblichen Mengen an chlorocresolhaltigen Medikamenten eine MH-Krise auszulösen.
Assay and impurity profiling of the pharmaceuticals are the key routine quality control methods employed worldwide for which High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is the most widely used technique. The ability to carry out these routine laboratory procedures in low- and middle- income countries (LMICs) need the methods to be based upon simple instruments manageable with moderate levels of personnel skill and costs involved.
Simple, convenient, and cost effective reverse phase HPLC methods were developed using phosphate buffer and methanol as mobile phase with C18 column as stationary phase for the impurity profiling and assay of beta lactam antibiotics. Isocratic elution and UV detection was employed in these methods. Impurity profiling method was developed for coamoxiclav tablets and ceftriaxone bulk drug. The method for ceftriaxone included a supplementary method to quantify one of its known impurity (Impurity D of ceftriaxone). This method involved use of acetonitrile where as the two main methods were achieved on the targeted method design, described above. With the exception of impurity A of ceftriaxone, the methods developed can successfully quantify impurities to the concentration as low as ≤0.05%, which is in accordance with the current guidelines for the impurity profiling of antibiotics issued by European Medicines Agency.
As ensuring cost reduction was one of the key objectives of carrying out the method development exercise, in situ methods for the preparation of impurities were also identified and some new methods were introduced. The stability of beta lactam antibiotics and the choice of solvent were given due attention during the process of method development revealing information on the presence of new impurities. Deacetyl cefotaxime and 2-mercaptobenzathiazole were identified in this process as new impurities of ceftriaxone currently not listed under known impurities by United States Pharmacopoeia and European Pharmacopoeia. However, deacetyl cefotaxime is a known impurity of cefotaxime whereas the latter molecule is a degradation product of one of the synthesis impurities of ceftriaxone. This substance is reported to be carcinogenic and is resolved using the supplementary method developed for ceftriaxone, hence making its detection and quantification possible. A known inactive impurity of ceftriaxone (Impurity A, E-isomer of ceftriaxone) was` also shown to be produced by exposure to day light, thus warranting the light protection of the ceftriaxone solution, an information that is of critical importance in the clinical settings.
A series of experimentation was carried out on the finished products of beta lactam antibiotics sampled from Pakistan and few other countries, to identify key quality issues in the samples. Though the limited sample size and convenient sampling did not provide results that could yield a decisive figure for the country status for prevalence of substandard and falsified medical products, but the experiments have clearly indicated that the problems in drug quality do exist and beta lactam antibiotics form a class of high-risk medicine with respect to surveillance for poor-quality medicines. Isolation of unknown impurities was also carried out along with the introduction of new and modified methods for preparation of impurities of beta-lactam antibiotics.
In addition, detailed literature survey was carried out for understanding the complex problem of the poor-quality medicine, impact of poor quality antimicrobials on health care system and the magnitude of the problem at the global level. The country status of Pakistan regarding quality of medicines was recorded based upon the available documentary evidence. The current technologies and strategic options available for low- and middle-income countries in aiding fight for combating poor quality medicines was also laid down to design recommendations for Pakistan. A comprehensive review of the information technology tools used for identification and control of substandard and falsified medicines was also conducted.
The charged aerosol detector (CAD) is an aerosol-based detector employed in liquid chromatography which has become established in the field of pharmaceutical analysis due to its outstanding performance characteristics, e.g. the almost uniform response for nonvolatile analytes. Owing to its principle of detection, the response of the CAD depends on the volatility of a compound and is inherently nonlinear. However, the newly implemented instrumental settings evaporation temperature and power function value (PFV) are valuable tools to overcome some of these drawbacks and can even enhance the detector’s capabilities when adjusted properly.
This thesis aimed to evaluate the impact of the new instrumental settings on the CAD performance. Additionally, the influence of modern separation techniques for small polar compounds on the CAD was assessed and the applicability of hyphenated UV-CAD techniques explored. The optimization strategies derived from the evaluation procedures and the conjunction of the instrumental and chromatographic techniques investigated were utilized for the challenging impurity profiling of amino acids and amino acid-like drugs.
The results of the method validation procedures confirmed the broad applicability of the CAD in the pharmaceutical analysis of nonvolatile compounds, supported by satisfactory sensitivity and reproducibility for meeting the regulatory requirements with respect to the ICH guidelines Q2(R1) and Q3A(R2). The limits of applicability include the analysis of semivolatile compounds, and the method transfer between current and legacy CAD models. Further advances in the definition and standardization of allowed ranges for the instrumental settings and the establishment of general optimization procedures in the method development could lead to a more widespread use of the detection technique in compendial methods.
Die Natur eröffnet mit der strukturellen Vielfalt ihrer Sekundärmetaboliten einen nahezu unerschöpflichen Pool in der Leit- und Wirkstoffsuche nach pharmazeutisch wirksamen Substanzen. Insbesondere die Alkaloide zeichnen sich durch ihre biologischen Wirksamkeiten aus. Eine noch junge, sehr vielversprechende Substanzklasse stellen die sogenannten Naphthylisochinolin-Alkaloide dar, die bislang ausschließlich in den beiden Pflanzenfamilien der Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae gefunden wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Extrakte von Ancistrocladus congolensis (A.c.), Triphyophyllum peltatum (T.p.) und Dioncophyllum thollonii (D.t.) untersucht. Hierbei gelang die Isolation und Strukturaufklärung des bereits bekannten Korupensamin A (A.c.) sowie von sechs bislang unbekannten Alkaloiden: Ancistrocongolin A-D (A.c.), Habropetalin A (T.p.) und Dioncophyllin E (D.t.). Zu dem letztgenannten wurde ein synthetischer Zugang evaluiert. Alle neu isolierten Naturstoffe wurden einer biologischen Aktivitätstestung zugeführt. Im analytischen Bereich der Arbeit gelang die vollständige Strukturzuordnung des bereits seit mehreren Jahren bekannten Tetralons Isoshinanolon, was somit nun ein einfache Analytik für die Bestimmung der absoluten Konfiguration an die Hand gibt. Des Weiteren wurde die HPLC-CD-Kopplung als schnelle und praktikable chirale on-line-Analytik an mehreren Beispielen (Phyllin, TaClo, Murrastifolin F, Cyclorocaglamid, Thalidomid) sowohl im phytochemischen als auch synthetischen Bereich eingeführt und etabliert.
All presented studies aimed on the improvement of the quality analysis of already monographed drugs. Thereby different LC methods were applied and coupled to i.e., the UV/VIS detector, the CAD or a hyphenation of these detectors, respectively. The choice of the chromatographic system including the detector was largely dependent on the physicochemical properties of the respective analytes.
With the risk-assessment report on the API cetirizine we presented an exemplary tool, that can help to minimize the risk of the occurrence of unexpected impurities. An in- deep analysis of each step within synthesis pathway by means of reaction matrices of all compounds was performed. It is essential to understand the complete impurity profile of all reactants, solvents, and catalysts and to include them in the matrix. Finally, the API of this synthesis was checked if all impurities are identified by this tool. Of note, a shortcoming of such a targeted approach is that impurities can still occur, but they are not captured. This disadvantage can be partially compensated by non-targeted approaches if they are performed in parallel with the other studies that represent most of the impurities. However, this work also shows that even in a supposedly simple synthesis, potentially hundreds of by-products can be formed. For each of them, it must be decided individually whether their formation is probable or how their quantity can be minimized in order to obtain APIs, that are as pure as possible.
In the dapsone project it was aimed to replace the existing old Ph. Eur. TLC method with a modern RP-HPLC method. This was successful and since Ph. Eur. 10.6, the method developed in this work, became a valid monograph. Within the revision process of the monograph, the individual limits for impurities were tightened. However, this new method needs HPLC instrumentation, suitable to perform gradients. As this is not always available in all control laboratories, we also developed an alternative, more simple method using two different isocratic runs for the impurity analysis. The obtained batch results of both, the new pharmacopoeial method and the more simple one, were in a comparable order of magnitude. Furthermore, within the method development stage of the Ph. Eur. method, we could identify one unknown impurity of the impurity reference by high-resolution MS/MS analysis.
Also, in the baclofen project it was aimed to replace the existing Ph. Eur. method with the introduction of an additional impurity to be quantified. A corresponding method was developed and validated. However, due to the harmonization process of the pharmacopoeias, it is currently not used. In addition, we tried to find further, non- 116
SUMMARY
chromophoric impurities by means of the CAD. However, except for one counterion of an impurity, no further impurities were found. Also, the aforementioned new impurity could not be detected above the reporting threshold in the batches analyzed. As the only individually specified impurity A is also present at a low level, it can be concluded that the examined batches of baclofen are very pure.
The use of universal detectors, such as the CAD can be particularly interesting for compounds with no chromophore or those with only a weak chromophore. Therefore, we decided to take a closer look at the impurity profile of acarbose. Currently, acarbose and its impurities are being studied by low wavelength UV detection at 210 nm. Therefore, the question arose whether there are no other impurities in the API that do not show absorption at this wavelength. CAD, which offers consistent detection properties for all non-volatile compounds, is ideally suited for this purpose. However, it was not so easy to use the CAD together with the UV detector, for example, as a hyphenated detection technique, because the Ph. Eur. method uses phosphate buffers. However, this is non-volatile and therefore inappropriate for the CAD. Therefore, an attempt was made to replace the buffer with a volatile one. However, since this did not lead to satisfactory results and rather the self-degradation process of the stationary phase used could be observed by means of the CAD, it was decided to switch to alternative stationary phases. A column screening also revealed further difficulties with acarbose and its impurities: they show an epimerization reaction at the end of the sugar chain. However, since one wanted to have uniform peaks in the corresponding chromatograms, one had to accelerate this reaction significantly to obtain only one peak for each component. This was best achieved by using two stationary phases: PGC and Amide-HILIC. Impurity-profiling methods could be developed on each of the two phases. In addition, as expected, new impurities could be detected, albeit at a low level. Two of them could even be identified by spiking experiments as the sugar fragments maltose and maltotriose.
Taken together, it can be concluded, that this work has contributed significantly to the improvement of the quality analysis of monographed drugs. In addition to the presented general tool for the identification of potential impurities, one of the methods developed, had already been implemented to the Ph. Eur. In an effort to improve the CAD's universal detection capabilities, additional methods have also been developed. Further, new improved methods for the impurity profiling are ready to use.