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Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Domänen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).
Die Kernhülle ist eine hoch spezialisierte Membran, die den eukaryotischen Zellkern umgibt. Sie besteht aus der äußeren und der inneren Kernmembran, die über die Kernporenkomplexe miteinander verbunden werden. Die Kernhülle reguliert nicht nur den Transport von Makromolekülen zwischen dem Nukleoplasma und dem Zytoplasma, sie dient auch der Verankerung des Chromatins und des Zytoskeletts. Durch diese Interaktionen hilft die Kernhülle, den Zellkern innerhalb der Zelle und die Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu positionieren, und reguliert dadurch die Expression bestimmter Gene. In höheren Eukaryoten durchlaufen sowohl die Kernhülle, als auch die Kernporenkomplexe während der Zellteilung strukturelle Veränderungen. Zu Beginn der Mitose werden sie abgebaut, um sich am Ende der Mitose in den Tochterzellen erneut zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die zum Wiederaufbau der Kernhülle führen, sind kaum geklärt. Ein geeignetes System, um bestimmte Ereignisse bei der Kernhüllenbildung zu untersuchen, liefert das zellfreie System aus Xenopus Eiern und Spermienchromatin (Lohka 1998). Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass es im Eiextrakt von Xenopus laevis mindestens zwei verschiedene Vesikelpopulationen gibt, die zur Bildung der Kernhülle beitragen. Eine der Vesikelpopulationen bindet an Chromatin, fusioniert dort und bildet eine Doppelmembran. Die andere Vesikelpopulation bindet an die bereits vorhandene Doppelmembran und sorgt für die Ausbildung der Kernporenkomplexe. Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Membranfraktionen zu isolieren und zu charakterisieren, wobei das Hauptinteresse in der porenbildenden Membranfraktion lag. Durch Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Zuckergradienten konnten die Membranvesikel in zwei verschiedene Vesikelfraktionen aufgetrennt werden. Eine Membranfraktion konnte aus der 40%igen Zuckerfraktion („40% Membranfraktion“) isoliert werden, die andere aus der 30%igen Zuckerfraktion („30% Membranfraktion“). Die verschiedenen Membranfraktionen wurden zu in vitro Kernen gegeben, in denen die Kernporen durch vorausgegangene Bildung von Annulate Lamellae depletiert worden waren. Nach Zugabe der 30% Membranfraktion konnte die Bildung von funktionalen Kernporen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die 40% Membranfraktion keine porenbildenden Eigenschaften. Unter Verwendung eines vereinfachten Systems, bestehend aus Zytosol, Spermienchromatin und den Membranen, wurde gezeigt, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und ausreichend ist, um eine kontinuierliche Doppelmembran ohne Kernporen zu bilden. Die 30% Membranfraktion besitzt keine Chromatinbindungseigenschaften und wird aktiv entlang von Mikrotubuli zu den porenlosen Kernen transportiert. Dort interagiert sie mit der chromatingebundenen 40% Membranfraktion und induziert die Porenbildung. Nach dem Vergleich der Proteinzusammensetzung der beiden Membranfraktionen, konnte das Major Vault Protein (MVP) nur in der porenbildenden Membranfraktion gefunden werden. MVP ist die Hauptstrukturkomponente der Vault-Komplexe, einem Ribonukleo-proteinpartikel, der in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden ist (Kedersha et al., 1991). Bemerkenswerterweise wird über die Funktion der Vault-Komplexe, trotz ihrer übiquitären Expression und ihrem Vorkommen in fast allen eukaryotischen Zellen, immer noch diskutiert. Um mehr über die Funktion und die Lokalisation der Vaults/MVP zu lernen, wurden die Vaults in Anlehnung an die Methode von Kedersha und Rome (1986) aus Xenopus Eiern isoliert. Zusätzlich wurde rekombinantes Xenopus MVP hergestellt, das unter anderem für die Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet wurde. Um herauszufinden, ob die Anwesenheit von MVP in der 30% Membranfraktion in direktem Zusammenhang mit deren porenbildender Eigenschaft steht, wurden gereinigte Vault-Komplexe oder rekombinantes MVP, das alleine ausreichend ist, um in sich zu den charakteristischen Vault-Strukturen zusammenzulagern, zu porenlosen Kernen gegeben. Sowohl gereinigte Vault-Komplexe, als auch rekombinantes MVP waren in der Lage in den porenlosen Kernen die Bildung von funktionalen Kernporen zu induzieren. Untersuchungen zur Lokalisation von MVP zeigten, dass MVP teilweise an der Kernhülle und den Kernporenkomplexen lokalisiert, während der Großteil an MVP zytoplasmatisch vorliegt. Dies sind die ersten Daten, die Vaults/MVP mit der Kernporenbildung in Verbindung bringen. Deshalb bietet diese Arbeit die Grundlage, um diese unerwartete Rolle der Vaults in Zukunft genauer zu charakterisieren.
Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3.
Mutationen in Genen, die für Kernhüllproteine codieren sind mit einer stetig zunehmenden Anzahl menschlicher Erkrankungen verbunden, die als Envelopathien bezeichnet werden. Erstaunlicherweise betrifft die Pathologie dieser Krankheiten spezifische Gewebe und Organe, obwohl entsprechende Proteine meist ubiquitär exprimiert werden. So führen beispielsweise Defekte in Emerin, einem Protein der inneren Kernhülle, zur X-chromosomalen Emery-
Dreifuss Muskeldystrophie (EDMD). Diese Krankheit ist durch Muskelschwäche oder –
schwund gekennzeichnet. Defekte im Kernhüllprotein MAN1 sind dagegen mit Krankheiten verbunden, die Knochen- und Hautgewebe betreffen. Interessanterweise besitzen beide
Proteine eine evolutionär hoch konservierte Domäne, die sog. LEM-Domäne. LEM-Domänen Proteine können mit der Kernlamina interagieren, ebenso mit dem sog. Barrier-to-
Autointegration Factor (BAF) sowie mit zahlreichen Transkriptionsfaktoren. Dennoch ist die
funktionelle Rolle der LEM-Domänen Proteine bis dato nicht vollständig aufgeklärt. In der vorliegenden Studie sollten daher die Funktionen von MAN1 und Emerin während der Frühentwicklung von Xenopus laevis untersucht werden.
Vorangehende Untersuchungen zeigten, dass Mikroinjektionen von XMAN1-
Antikörpern in Zwei-Zell-Stadien befruchteter Eizellen zu einem Arrest der Zellteilung in der injizierten Blastomere führten. Da dabei eine Störung der Kernhüllbildung spekuliert wurde, sollte durch Antikörper-vermittelter Inhibition von XMAN1 die Bildung von in vitro Kernen im Xenopus Eiextrakt untersucht werden. Dabei wurden Kerne beobachtet, die dekondensiertes
Chromatin zeigten, bei denen jedoch eine Fusion von Membranvesikeln zu einer durchgehenden Kernhülle nicht stattgefunden hatte. Frühere Charakterisierungen von MAN1 und Emerin zeigten unterschiedliche Expressionsmuster während der Entwicklung von X. laevis. Da XMAN1 ubiquitär exprimiert und Xemerin jedoch erstmals ab Stadium 41 nachweisbar ist, war es mittels Mikroinjektion von
Xemerin möglich zu zeigen, dass es in der Lage ist den Arrest der Zellteilung zu verhindern. Es wurde daher die These aufgestellt, dass MAN1 und Emerin während der Frühentwicklung von Xenopus überlappende Funktionen besitzen. Um diese These zu prüfen, wurde zunächst
unter Verwendung des Proximity Ligation Assays untersucht, ob beide Proteine miteinander interagieren können. Mit Hilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass Interaktionen beider Proteine innerhalb der Kernhülle lokalisieren. Die Interaktionen blieben während der Mitose bestehen und waren erst wieder zum Ende der Mitose in der Kernhülle nachweisbar. Diese Resultate deuten daher darauf hin, dass XMAN1/Xemerin-Interaktionen während der ...
Der Zellkern ist ein wichtiges Organell von eukaryotischen Zellen, der durch eine Doppelmembran vom Cytoplasma abgetrennt wird. Mit Hilfe des Zebrafischs als Modellorganismus und kultivierten Zellen verschiedener Vertebraten wurde in mehreren Teilprojekten Untersuchungen an integralen (Lamina assoziiertes Polypeptid 2, Lamin B Rezeptor) und peripheren Membranproteinen (Lamine) der in inneren Kernmembran durchgeführt. Eines der am besten untersuchten integralen Membranproteine der inneren Kernmembran ist das Lamina assoziierte Polypeptid 2 (LAP2). Durch alternatives Splicen entstehen aus einem einzigen Gen eine Reihe verschiedener Isoformen die entwicklungs- und gewebespezifisch exprimiert werden. In Säuger sind 6 verschiedene Isoformen (LAP2α, β, δ, ε, γ, ζ) bekannt, von denen alle mit Ausnahmen von LAP2α und ζ, in die innere Kernmembran integriert sind. Das LAP2α ist ausschließlich im Nukleoplasma lokalisiert und wurde bis jetzt nur bei Säugern beschrieben. Durch die Identifikation eines genomischen Klons ICRFc 7101293Q5 (RZPD) sowie vergleichende Datenbankanalysen konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LAP2-Gens ermittelt werden. Das Gen kodiert innerhalb von 19 kb (ohne regulatorische Sequenzen) 15 Exons aus denen durch alternatives Splicen 3 verschieden Isoformen hervorgehen (zLAP2 β, γ, ω). Mit Hilfe des “Radiation Hybrid mappings“ wurde das LAP2 Gen auf der “Linkage group“ 4 des Zebrafischs, zwischen den EST-Markern fc01g04 (213,97) und fb49f01 (215,69cR) lokalisiert. Aufgrund der zusätzlichen Identifikation der genomischen Sequenz des Hühner LAP2-Gens konnten die genomischen Sequenzen der LAP2 Gene von niederen Vertebraten (Zebrafisch), über die Vögel (Huhn), bis zum Säuger (Mensch) miteinander verglichen werden. Dabei zeigte sich einerseits, dass die ω Isoform des Zebrafischs nicht im Genom von Huhn und Säugern vorhanden ist: Andererseits ist die α Isoform der Säuger ebenfalls in keinem der anderen Spezies (Huhn, Zebrafisch) zu finden ist. Weiterhin konnte bei zusätzliche Proteinanalysen mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, gegen die konservierte aminoterminale Domäne der LAP2 Proteine, in 10 Tage alten Hühner Embryonen nur ein Protein mit einem vergleichbaren Molekulargewicht zum LAP2β anderer Spezies eindeutig detektiert werden. Aufgrund dieser Befunde und der Tatsache, dass die kodierenden Exonsequenzen zwischen Mensch und Huhn eine größere Ähnlichkeit zeigen als zwischen Mensch und Zebrafisch, liegt die Vermutung nahe, dass die α-Isoform eine Neuheit der Säugern darstellt. Ein weiteres integrales Membranprotein, dass erstmals beim Zebrafisch untersucht wurde, ist der Lamin B Rezeptor (zLBR). Mit Hilfe von radioaktiv markierten Sonden, konnte zwei Klone identifiziert werden die sowohl die gesamte cDNA-Sequenz (MPMGp567K10194Q3 (RZPD) als auch die gesamte genomische Sequenz (ICRFc71M10137Q5 (RZPD) beinhalten. Anhand von vergleichenden Datenbankanalysen, konnte der strukturelle Aufbau des Zebrafisch LBR-Gens ermittelt werden. Dieses kodiert innerhalb von 12 kb (ohne regulatorische Sequenzen) mit 13 Exons für ein 616 Aminosäure großes Protein. Vergleichbar mit dem LBR anderer Spezies besitzt der Zebrafisch LBR ebenfalls 8 Transmembrandomänen in seiner carboxyterminalen Domäne mit denen er in der inneren Kernmembran verankert ist. Der Aminosäurenvergleich mit anderen Spezies zeigte, dass die Aminosäurensequenz sowohl des aminoterminalen Bereichs als auch im Bereich der Transmembrandomänen hoch konserviert ist. Weiterhin wurden polyklonalen Antikörpern gegen die ersten 210 Aminosäuren des zLBRs hergestellt, die für zukünftige immunologische Analysen verwendet werden können. Ebenso wie die integralen Membranproteine spielen auch die Lamine eine wichtige Rolle bei nukleären Prozessen. Die B-Typ Lamine zeichnen sich alle durch ein konserviertes CxxMMotiv am Carboxyterminus aus. Das CxxM-Motiv wird nach posttranslational modifiziert, wodurch es lipophile Eigenschaften erlangt und somit für die anfängliche Verankerung der Lamine in der inneren Kernmembran verantwortlich ist. Bei A-Typ Laminen ist dieses Motiv nicht in der Primärsequenz enthalten oder es wird nach dem Einbau in die Kernlamina proteolytisch abgespalten. Eine Besonderheit stellt das meiotische Lamin C2 dar, welches ein Spliceprodukt des Lamin A Gens der Säuger ist. Das Lamin C2 besitzt zwar kein CxxMMotiv an seinem Aminoterminus, dafür aber ein Hexapeptid (GNAEGR) nach dem Startmethionin. Die posttranslationale Modifikation dieser Sequenz verleiht dem Protein lipoplile Eigenschaften. Anhand von funktionellen Analysen konnte durch die Überexpression GFP-Fusionsproteinen verschiedener wildtypischer Lamine und Lamin Mutanten gezeigt werden, dass die Interaktion der Lamine über das CxxM-Motiv oder das GNAEGR-Motiv mit der inneren Kernmembran, das Wachstum der Kernhülle induziert. In einem letzten Projekt konnte mit Hilfe spezifischer “antisense-“ Oligonukleotide, die als "Morpholinos" bezeichnet werden, die Expression von LAP2, LBR und den B-Typ Laminen B1 und B2 in Zebrafisch Embryonen reprimiert werden. Die Blockade der mRNA-Translation der entsprechenden Gene erfolgte in allen Fällen innerhalb der ersten 24 Stunden vollständig. Obwohl die Anzahl der beobachteten Embryonen relativ gering war, so zeigte sich bei allen Embryonen eine deutliche Entwicklungsverzögerung und unterschiedlich starke Entwicklungsstörungen. Die morphologischen Auswirkungen waren bei der Reduktion des LAP2 oder der Lamine geringer als bei der Reduktion des LBR, da in beiden Fällen maternale Proteine, wie das LA2ω oder das B-Typ Lamin LIII, nicht reduziert werden konnten.
Spermiogenesis describes the differentiation of haploid germ cells into motile, fertilization-competent spermatozoa. During this fundamental transition the species-specific sperm head is formed, which necessitates profound nuclear restructuring coincident with the assembly of sperm-specific structures and chromatin compaction. In the case of the mouse, it is characterized by reshaping of the early round spermatid nucleus into an elongated sickle-shaped sperm head. This tremendous shape change requires the transduction of cytoskeletal forces onto the nuclear envelope (NE) or even further into the nuclear interior. LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) complexes might be involved in this process, due to their general function in bridging the NE and thereby physically connecting the nucleus to the peripheral cytoskeleton.
LINC complexes consist of inner nuclear membrane integral SUN-domain proteins and outer nuclear membrane KASH-domain counterparts. SUN- and KASH-domain proteins are directly connected to each other within the perinuclear space, and are thus capable of transferring forces across the NE. To date, these protein complexes are known for their essential functions in nuclear migration, anchoring and positioning of the nucleus, and even for chromosome movements and the maintenance of cell polarity and nuclear shape.
In this study LINC complexes were investigated with regard to their potential role in sperm head formation, in order to gain further insight into the processes occurring during spermiogenesis. To this end, the behavior and function of the testis-specific SUN4 protein was studied. The SUN-domain protein SUN4, which had received limited characterization prior to this work, was found to be exclusively expressed in haploid stages during germ cell development. In these cell stages, it specifically localized to the posterior NE at regions decorated by the manchette, a spermatid-specific structure which was previously shown to be involved in nuclear shaping. Mice deficient for SUN4 exhibited severely disorganized manchette residues and gravely misshapen sperm heads. These defects resulted in a globozoospermia-like phenotype and male mice infertility. Therefore, SUN4 was not only found to be mandatory for the correct assembly and anchorage of the manchette, but also for the correct localization of SUN3 and Nesprin1, as well as of other NE components. Interaction studies revealed that SUN4 had the potential to interact with SUN3, Nesprin1, and itself, and as such is likely to build functional LINC complexes that anchor the manchette and transfer cytoskeletal forces onto the nucleus.
Taken together, the severe impact of SUN4 deficiency on the nucleocytoplasmic junction during sperm development provided direct evidence for a crucial role of SUN4 and other LINC complex components in mammalian sperm head formation and fertility.
The role of meiotic nuclear envelope components in chromosome dynamics and meiotic progression
(2013)
Meiosis is the specialised cell division which produces haploid germ cells, capable of developing into fertile gametes, from diploid progenitor cells. During meiosis, chromosomes undergo strictly regulated and strongly conserved dynamic processes, at the beginning of which the telomeres are actively tethered and intimately attached to the nuclear envelope (NE). The attached telomeres are then moved within the NE through cytoskeletal forces to cluster within a restricted region, forming the highly conserved bouquet stage. Subsequently, the bouquet is released simultaneously to the completion of the synaptonemal complex assembly tightly linking homologous chromosome pairs together. In combination these processes are essential for the successful completion of meiosis. Because the meiotic NE serves as a platform for telomere attachment and movement it can be assumed to be critically involved in these events crucial for fertility. However, the precise roles of many meiotic NE proteins in the attachment and movement of telomeres still remain elusive. Therefore, it was the aim of this thesis to investigate the functions of two mammalian meiotic NE components in telomere attachment and dynamics. The first part of this thesis is concerned with the meiosis-specific lamin C2. Lamin C2 is the only A-type lamin expressed during meiosis and has in previous studies shown to feature altered meiosis-specific properties, clearly distinguishing it from somatic lamins. Because lamin C2 is enriched at sites of telomere attachment, exhibits a high mobility within the nuclear lamina and influences NE integrity, it has been postulated that it may locally increase NE flexibility to allow efficient meiotic telomere movement. Therefore, possible functions of lamin C2 in the movement of attached telomeres were investigated in this thesis by studying the bouquet formation and release of pubertal mice specifically lacking lamin C2. This revealed that lamin C2 deficient mice show a delayed bouquet release, leading to severe defects in the synaptic pairing of homologous chromosomes, which in turn results in infertility of the males. Therefore, the efficient repositioning of attached meiotic telomeres, facilitated by lamin C2, seems essential for completing meiosis. The second part of this thesis focuses on the protein complex responsible for the attachment of meiotic telomeres to the NE and their coupling to the cytoskeleton. The so-called LINC complex is composed of SUN domain proteins in the inner nuclear membrane interacting with KASH domain proteins of the outer nuclear membrane. In previous studies it had been shown that SUN1, SUN2 and KASH5 localise to the attached meiotic telomeres. Regarding the meiotic role of SUN2, however, contradicting results have recently been discussed, showing the need for further investigations. Using an available SUN1 deficient mouse strain, this thesis was able to show that SUN2 is sufficient for telomere attachment per se although telomere attachment is impaired in SUN1 deficient mice leading to infertility. It is also demonstrated that SUN2 forms a functional LINC complex together with KASH5 to mediate this telomere attachment. This LINC complex in the absence of SUN1 is able to move attached telomeres into a bouquet-like cluster formation. Therefore, this demonstrates that SUN2 is involved in the functional attachment and movement of meiotic telomeres. In summary, this thesis has shown SUN2 and the meiotic nuclear lamina to be directly involved in or essential for the highly conserved attachment and movement of telomeres, making them critical for a successful meiosis. The meiotic NE is therefore in this thesis demonstrated to be a determinant of mammalian fertility.
Lamina-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2) in Vertebraten sind bis auf zwei Ausnahmen integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen Gens entstehen. Während die aminoterminale Domäne, die allen LAP2 Isoformen gemeinsam ist, in Interphasezellen mit Chromatin und dem DNA-Bindungsprotein BAF interagiert, beinhaltet der carboxyterminale Bereich die Lamin Bindungsdomäne und eine Transmembrandomäne. Diese beiden carboxyterminalen Domänen bewirken die Lokalisation der Proteine an die Kernhülle. In dieser Arbeit konnten drei LAP2 Isoformen von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, die alle integrale Membranproteine sind. In somatischen Zellen werden vorwiegend die beiden Isoformen LAP2γ und LAP2ß exprimiert, in frühen Entwicklungsstadien dagegen die größte Isoform, das LAP2ω. In allen bekannten funktionellen Domänen weisen die LAP2 Proteine von Xenopus eine hohe Sequenzübereinstimmung mit den LAP2 Proteinen in Säugern auf. Allerdings finden sich in Xenopus zusätzliche Isoform-spezifische Proteindomänen, die zwischen der amino-terminalen Domäne und der Lamin Bindungsdomäne eingeschoben sind. Eine dem Xenopus LAP2ω im Aufbau und in der Expression vergleichbare Isoform wurde bisher nur beim Zebrafisch nachgewiesen. Auch die somatisch exprimierten LAP2 Isoformen des Zebrafisch (ZLAP2b und ZLAP2g) entsprechen den beiden somatischen Xenopus Isoformen. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den drei LAP2 Isoformen feststellen zu können, wurden die Proteine des Zebrafischs als GFP Fusionsproteine in Xenopus A6 Zellen exprimiert. ZLAP2ω und LAP2ß wurden vorwiegend an mitotische Chromosomen gebunden, dagegen war der größte Teil des ZLAP2g im Cytoplasma verteilt. Mutanten der drei Proteine, denen jeweils die Lamin Bindungsdomäne einschließlich der Transmembrandomäne fehlte, zeigten dasselbe Verhalten. Somit scheinen diese b- und w-spezifischen Domänen Chromatin-Bindungseigenschaften zu besitzen. In Amphibien liegt das XLAP2ß in der Interphase in einem Proteinkomplex mit A- und B-Typ Laminen vor. Diese Proteinkomplexe konnten durch Immunpräzipitationen von GFP-XLAP2ß Fusionsproteinen mit GFP Antikörpern nachgewiesen werden. Die Extrakte für die Immunpräzipitationen wurden aus stabil transfizierten Xenopus A6 Zelllinien gewonnen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit in vitro Bindungsstudien mit GST- XLAP2ß Fusionsproteinen. Für die Bildung des Lamin-LAP2ß Proteinkomplexes und auch für die korrekte Lokalisation des Proteins an die Kernhülle reicht ein in Vertebraten hochkonservierter Bereich von 36 Aminosäuren in Kombination mit der Transmembrandomäne aus. Zudem scheint diese kurze carboxyterminale LAP2ß Sequenz in Xenopus, Zebrafisch und Ratte mit dem endogenen LAP2ß um Bindungsstellen in der Kernlamina zu konkurrieren. Sowohl in Amphibien- wie auch in Säugerzellen konnte in transient transfizierten Zellen eine beträchtliche Verminderung des endogenen LAP2ß beobachtet werden, ohne dass dabei die Kernmorphologie und die Verteilung anderer Kernmembranproteine beeinträchtigt wurde. Somit scheint die Lamin-Bindungsdomäne des LAP2ß in Vertebraten stark konserviert zu sein.
Die Lamina ist ein dichtes Netzwerk aus Intermediär-Filamenten, den Laminen, an der nucleoplasmatischen Seite der inneren Kernmembran. Hier interagieren Lamine sowohl mit Transmembran-Proteinen der Kernhülle als auch mit dem Chromatin. Diese Wechselwirkungen mit Interaktionspartnern verschiedener zellulärer Kompartimente macht die Lamina, neben einer Gerüststruktur mit wichtigen mechanische Aufgaben, auch zu einer zentralen Schnittstelle von Signalwegen, die eine intrazelluläre Kommunikation zwischen Nucleus und Cytoplasma ermöglichen. Die Lamina ist somit ein entscheidender Regulator der funktionellen Organisation des Chromatins und der differentiellen Genexpression. Das Expressionsmuster der Lamine während der Spermatogenese von Säugern unterscheidet erheblich von der Lamin-Expression somatischer Zellen und weist einige Besonderheiten auf. Dies schließt unter anderem die spezifische Expression der verkürzten A-Typ Lamin-Spleißvariante C2 während der meiotischen Phase der Spermatogenese ein. Diese und andere Beobachtungen deuteten bereits länger darauf hin, dass der speziellen Zusammensetzung der Lamina und vor allem dem meiosespezifischen Lamin C2 während der Gametogenese im männlichen Organismus eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Neuere Studien im Mausmodell bekräftigen diese Hypothese und leisten darüber hinaus einen entscheidenden Betrag dazu, die Funktion der Lamina während der Meiose auf molekularer Ebene präzise zu definieren. Im deutlichen Gegensatz zu den weitreichenden Kenntnissen zur Situation in Männchen lagen zu Beginn der vorliegenden Arbeit keine Daten über die Zusammensetzung der Lamina in weiblichen Keimzellen vor. Konsequenterweise existierten auch keine funktionellen Untersuchungen zur Relevanz der Lamina für die Oogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden diese reproduktionsbiologisch hoch interessanten Fragestellungen detailliert untersucht. Dabei zeigte sich unter anderem, dass Lamin C2 auch in weiblichen Keimzellen spezifisch während der Meiose exprimiert wird. Durch Studien an einer Lamin C2-defizienten Mauslinie wurde die Funktion von Lamin C2 in der Meiose in Weibchen genau untersucht. Dabei wurde eine erhebliche Beeinträchtigung der strukturellen Paarung der homologen Chromosomen und der homologen Rekombination in Lamin C2-defizienten Weibchen festgestellt. Da die genannten Prozesse Schlüsselereignisse für die korrekte Segregation der Homologen in späteren Stadien der Meiose sind, deuten die erzielten Ergebnisse auf eine erhebliche qualitative Beeinträchtigung der reifen Gameten in Lamin C2-defizienten Weibchen hin. Ein weiterer zentraler Aspekt der Arbeit war die Analyse der molekularen Eigenschaften des meiosespezifischen Lamin C2 in vitro. Diese Experimente definieren wichtige Unterschiede hinsichtlich seiner Polymerisationseigenschaften im Vergleich zu Laminen somatischer Zellen und tragen, zusammen mit anderen Studien, dadurch erheblich dazu bei, die Funktion von Lamin C2 in der Meiose im mechanistischen Sinne besser zu verstehen. Zudem deckt die vorliegende Arbeit erstmals einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Lamina-Zusammensetzung und der Qualität der Keimzellen weiblicher Säuger auf und ermöglicht dadurch zukünftige Studien zur Rolle der Lamine in der Oogenese, die möglicherweise auch für die menschliche Fertilität sehr interessant sein könnte. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Beschreibung einer trunkierten A-Typ Lamin-Spleißvariante in einer Mauslinie, die bislang als A-Typ Lamin-defizient angesehen wurde (Lmna-/-). Die durchgeführten Untersuchungen besitzen vor allem dadurch hohe Relevanz, dass die untersuchte Lmna-/- Mauslinie seit Jahren als das wichtigste Modell zur funktionellen Untersuchung der A-Typ Lamine gilt und bereits in einer Vielzahl von Publikationen eingesetzt wurde. In den hierzu durchgeführten Versuchen konnte das in der Lmna-/- Mauslinie persistierende A-Typ Lamin mittels diverser methodischer Ansätze als C-terminale Deletionsmutante definiert werden, der die Exons 8-11 der insgesamt 12 Exons des Lmna-Gens fehlen. Daher wurde diese Lamin A-Mutante als Lamin AΔ8-11 bezeichnet. Die Konsequenzen der C-terminalen Deletion für die physiologischen Eigenschaften des Lamin Adelta8-11 sowie die Auswirkungen seiner Expression in der Lmna-/- Mauslinie auf aktuelle Modellvorstellungen zur Funktion der A-Typ Lamine und zur Entstehung Lamin-assoziierter, humaner Erkrankungen (Laminopathien) werden in der Arbeit ausführlich diskutiert.
Die retrovirale Replikation in der eukaryotischen Zelle erfordert den Export Intron-enthaltender Transkripte aus dem Kern ins Cytoplasma. Bei HIV-1 wird dieser nucleocytoplasmatische Transport durch den viralen Transaktivator Rev vermittelt. Rev ist ein Shuttle-Protein, das sowohl ein Kernimportsignal (NLS) als auch ein Leucin-reiches Kernexportsignal (NES) besitzt. Nach der Bindung von Rev an eine spezifische RNA Sekundärstruktur, das sogenannte Rev Response Element (RRE) interagieren zelluläre Faktoren mit dem NES von Rev, wodurch der Kernexport vermittelt wird. Neben dem generellen Exportrezeptor CRM1 konnte auch der eukaryotische Initiationsfaktore 5A (eIF-5A) als ein Bindungspartner von Rev identifiziert werden. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, daß eIF-5A ein essentieller Faktor für den Rev-vermittelten RNA Export ist. Mikroinjektionen von eIF-5A-Antikörpern und der eIF-5A-M14 Mutante in Kerne von Xenopus Oocyten, sowie Bindungsstudien in Lösung haben gezeigt, daß eIF-5A als ein Adapterprotein fungiert, das upstream des generellen Exportrezeptors CRM1 wirkt. eIF-5A bindet dabei an das Rev-NES und vermittelt dadurch eine effiziente Bindung dieses NES an CRM1, wodurch der effiziente Export des Rev/RNA-Komplexes stattfinden kann. Da die zelluläre Funktion von eIF-5A noch unbekannt war, wurden Overlay Blot Assays auf Xenopus Oocytenkernhüllen durchgeführt, um Kernproteine zu finden, die mit eIF-5A interagieren. Dies führte zur Identifikation des Transkriptionsfaktors IIIA als einen Bindungspartner von eIF-5A. TFIIIA ist ein Exportfaktor für die Oocyten-Typ 5S rRNA in Amphibien Oocyten und besitzt wie Rev ein Leucin-reiches NES. Aufgrund einer Analyse dieses RNA Exportweges konnte nun gezeigt werden, daß eIF-5A auch in diesem spezifischen Exportweg als Adapter wirkt, der das NES des TFIIIA mit dem Exportrezeptor CRM1 verbindet und dadurch den Export des TFIIIA/5S rRNA-Komplexes vermittelt. Eine weitere zelluläre Funktion von eIF-5A konnte beim Export der CD83 mRNA in Dendritischen Zellen gefunden werden. Es konnte gezeigt werden, daß der Export der CD83 mRNA durch das RNA-bindende Protein HuR und durch den generellen Exportrezeptor CRM1 vermittelt wird. Durch den HuR Lignaden APRIL, der ein Rev-ähnliches, Leucin-reiches NES besitzt, wird dabei die Bindung an CRM1 vermittelt. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß eIF-5A an diesem RNA Export beteiligt ist. Wie auch beim Rev-vermittelten RRE RNA Export und dem TFIIIA-vermittelten 5S rRNA Export wirkt eIF-5A als ein Adapter, der das NES des HuR-Liganden APRIL mit CRM1 verbindet, wodurch der Export des CD83 mRNA/HuR/APRIL Komplexes stattfinden kann. Neben TFIIIA und verschiedenen Nucleoporinen, konnte Kernaktin als ein weiterer Bindungspartner von eIF-5A identifiziert werden. In dieser Arbeit durchgeführte Mikroinjektionsexperimente mit Antikörpern gegen Aktin sowie verschiedenen Aktin-bindende Drogen konnten zeigen, daß Kernaktin scheinbar generell in Exportprozesse involviert ist. Mit Hilfe verschiedener Aktin-bindender Proteine (Latrunculin B und Swinholide A) konnte gezeigt werden, daß eine lösliche oder oligomere Form, nicht jedoch Aktinfilamente, funktionell an Kernexportprozessen beteiligt sind. Durch die Analyse Kernaktin-bindender Proteine konnten bereits die beiden Nucleoporine CAN/Nup214 und p62, die beide an Exportprozessen beteiligt sind, als Bindungspartner identifiziert werden. Außerdem ergaben sich höchst interessante Hinweise auf die Beteiligung eines, bis jetzt noch nicht identifizierten, Kernproteins auf eine Beteiligung am Aktin-vermittelten Kernexport.