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Die Blut-Hirn-Schranke wird hauptsächlich vom Endothel der Hirngefäße gebildet und stellt die wichtigste Barriere zwischen Blutkompartiment und Hirnparenchym dar. Hauptverantwortlich für die Barrierefunktion der Gehirnkapillaren sind die Tight Junctions, die den Interzellularspalt des Endothels verschließen und dadurch die parazelluläre Permeabilität hydrophiler Moleküle und Ionen regulieren und einen hohen elektrischen Widerstand aufbauen. Das 65 kDa Transmembranprotein Occludin ist ein zentrales Element der Tight Junctions: Eine Induktion von Occludin führt zur Erhöhung der Barriereeigenschaften, während eine Erniedrigung des Occludin-Gehaltes zu einer verstärkten Kapillardurchlässigkeit und potenziell zu einer Schädigung des Hirngewebes führt. Im klinischen Alltag werden bereits seit vierzig Jahren Kortikosteroide bei Erkrankungen mit geschädigter Blut-Hirn-Schranke erfolgreich eingesetzt. Auch experimentell konnte im hiesigen Labor durch die Arbeitsgruppe von Prof. Förster eine Transaktivierung von Occludin durch Glukokortikoide wie Dexamethason nachgewiesen werden. Die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen der Occludintransaktivierung blieben weitgehend unbekannt, insbesondere die Frage, ob die Geninduktion über direkte Zielgentransaktivierung oder über eine Protein-Protein-Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren erfolgt. Das Vorhandensein putativer Glukokortikoid-responsiver Elemente innerhalb des Occludin-Promoters war ebenso noch nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte dargestellt werden, dass für die erhöhte Occludin-Expression in Endothelzellen von Hirngefäßen durch Glukokortikoide ein funktioneller Glukokortikoid-Rezeptor als Homodimer nötig war. In den Experimenten wurden die jeweiligen Transaktivierungsniveaus des Occludin-Promoters durch einen Luciferase-Promoter-Reporter-Assay verglichen. Es wurden zum einen der Wildtyp-Glukokortikoidrezeptor, zum anderen ein mutagenisierter Rezeptor eingesetzt, dem die entscheidende Dimerisierungseigenschaft fehlt. Ohne die Ausbildung eines Rezeptor-Homodimers kann die Bindung an die Promoter-DNA nicht erfolgen. Im Vergleich zeigte sich, dass nur der Wildtyp-Glukokortikoidrezeptor zu einer erhöhten Genexpression führte, der mutagenisierte Rezeptor zeigte keine Induktion. Zudem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Bindungsstelle des Glukokortikoidrezeptors auf dem Occludin-Promoter identifiziert werden. Die Identifizierung des Glukokortikoid-responsiven Elements erfolgte durch Untersuchung der Glukokortikoid-Responsivität verschiedener Abschnitte des Occludin-Promoters. Auf zwei dieser Abschnitte fanden sich Gensequenzen, die der etablierten kanonischen Konsensussequenz und verschiedenen in der Literatur beschriebenen degenerierten Elementen entsprachen. Im Promoter-Reporter-Assay zeigte sich nur im distalen Promoterabschnitt eine erhöhte Occludin-Expression nach Glukokortikoid-Gabe. Dieses distale Element aus zwei Halbelementen (5’-ACATGTnnnnACAAAT-3’) wurde durch Immunopräzipitationsassays weiter eingegrenzt. Eine Mutagenisierung der Basenabfolge mit anschließend ausbleibender Transaktivierung und Immunopräzipitation bestätigte die Funktionalität des Glukokortikoid-responsiven Elements. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals die direkte dimerisierungsabhängige Glukokortikoidrezeptor-vermittelte Induktion von Occludin nachgewiesen und ein neues degeneriertes Glukokortikoid-responsives Element identifiziert werden, das für die Transaktivierung des Occludingens essentiell ist.
Die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist bei vielen Erkrankungen des humanen zentralen Nervensystems (ZNS) beeinträchtigt. Unter verschiedenen neuroinflammatorischen Bedingungen, wie bei zerebralen Ischämien, Traumata, Hirntumoren oder der Multiplen Sklerose (MS), kommt es zum Verlust der protektiven Schrankenfunktion. Zu den ersten Anzeichen des BHS-Zusammenbruchs zählt der Verlust der Zell-Zell-Adhäsion: der Adhärens- und Occludenskontakte. Therapeutische Maßnahmen dieser Krankheiten beinhalten Behandlungen mit Glukokortikoiden (GCs), wobei der Mechanismus und die Wirkungsweise dieser Substanzen bis heute nicht vollkommen aufgeklärt sind. In der zerebralen Hirnendothelzelllinie cEND [Forster C, Silwedel C, Golenhofen N, Burek M, Kietz S, Mankertz J & Drenckhahn D. (2005). Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J Physiol 565, 475-486] wurde eine Funktionsverbesserung der Endothelbarriere durch die Expressionerhöhung von Occludin nach GC-Behandlung bereits analysiert. Daraufhin wurden andere Kandidaten des apikalen Junktionssystems gesucht, die positiv auf GC-Gabe ansprechen. Der erste Teil der Arbeit präsentiert den positiven Einfluss der Dexamethason-Behandlung auf die Expression des Adhärenskontakt-Proteins VE- (Vascular-Endothelial) Cadherin in cEND-Zellen. Dabei wurde eine Reorganisation des Zytoskeletts, eine verstärkte Verankerung des VE-Cadherins an das Zytoskelett, sowie eine einhergehende Morphologieänderung der behandelten Zellen beobachtet. Untersuchungen der Transkriptionsaktivierung des VE-Cadherin-Promoters nach Dexamethason-Behandlung, wiesen auf einen indirekten Steroid-Effekt hin, der zu einer Erhöhung der VE-Cadherin-Proteinsynthese führte. Somit sind GCs wichtig für die Proteinsynthese und -organisation beider Kontaktproteinarten: der Adhärens- und Occludenskontakte in mikrovaskulären Hirnendothelzellen. Die Beeinträchtigung der BHS-Integrität mit Veränderungen der Occludenskontaktexpression zählt zu den frühen Ereignissen bei der Entstehung einer Inflammation des ZNS, wie beispielsweise bei der MS. Im zweiten Teil der Dissertation wurde die Herunterregulation von Occludenskontaktproteinen in der cEND-Zelllinie untersucht. Dabei wurden cEND-Zellen mit Seren von Patienten, die sich in zwei verschiedenen Stadien der MS befanden, behandelt: in der akuten Exazerbationsphase oder der Remissionsphase, und auf die Protein- und Genexpression mit und ohne Dexamethasons-Behandlung untersucht. Es konnte ein negativer Effekt auf den Barrierewiderstand und die Occludenskontaktexpression, sowie eine erhöhte MMP-9-Genexpression nach Krankheitssereninkubation gezeigt werden. Die Dexamethason-Behandlung ergab eine geringe, aber keine vollständige Rekonstitution der Barrierefunktion. Anhand dieser Studie konnte jedoch erstmals eine Erniedrigung der Protein- und mRNA-Synthese von Claudin-5 und Occludin in Remissionspatientenseren inkubierten cEND-Zellen demonstriert werden. Somit könnten diese Erkenntnisse zur Prädiagnose einer bevorstehenden Exazerbationsphase der MS eingesetzt werden. Eine Langzeit-GC-Behandlung führt zu zahlreichen Nebenwirkungen, u. a. zum Bluthochdruck, welcher aufgrund einer eingeschränkten Produktion des vasodilatativen Faktors Stickstoffmonoxid, NO, im myokardialen Endothel hervorgerufen wird. Veränderungen in der NO-Produktion, wie auch anderer Faktoren der NO-Signalkaskade in der myokardialen Endothelzelllinie MyEND unter Einfluss von Dexamethason standen im Zentrum des dritten Teils dieser Arbeit. Während keine Veränderungen in der Expression der endothelialen NO-Synthase, eNOS, nach GC-Behandlung gezeigt werden konnten, wurden repressive Einflüsse von Dexamethason auf die Enzymaktivität der eNOS in MyEND-Zellen untersucht. GC-Gabe führte zur einer herabgesetzten Synthese des essenziellen Co-Faktors der eNOS, des Tetrahydrobiopterins, BH4, sowie zu einer Herunterregulation der GTP-Cyclohydrolase-1 (GTPCH-1), des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms der BH4-Produktion. Im Gegensatz zu bisherigen Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, konnte in der vorliegenden Studie belegt werden, dass die Herunterregulation der GTPCH-1 mRNA-Level auf den Liganden-abhängigen proteasomalen Abbau des Glukokortikoid-Rezeptors (GR) zurückzuführen ist. Das 26S-Proteasom moduliert die GR-abhängige Genexpression durch Kontrolle des Umsatzes und des Recyclings des Rezeptors selbst, wodurch eine regulierte Hormonresponsivität gewährleistet wird. Die Aufhebung des Liganden-abhängigen Abbaus des GR-Proteins durch gezielte Proteasominhibition, sowie durch eine Überexpression des ubiquitinylierungsdefekten GR-Konstruktes, K426A-GR, in Dexamethason-behandelten MyEND-Zellen resultierte in einer Erhöhung der GTPCH-1-Expression, sowie einer gesteigerten eNOS-Aktivität. Die hier beschriebenen Ergebnisse erlauben einen innovativen Einblick in die Erkenntnisse zur GC-vemittelten Hypertonie. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass GC-Behandlungen von mikrovaskulären Hirnendothelzellen zu einer Stabilisierung der Endothelbarriere führen. Unter pathologischen Bedingungen, wie der MS, wird der protektive GC-Effekt durch andere Faktoren beeinträchtigt