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Erscheinungsjahr
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Dokumenttyp
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Schlagworte
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Die Bedeutung der cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinase für die Hemmung der Plättchenaktivierung und -aggregation ist gut beschrieben. Zahlreiche fundamentale Plättchenantworten wie die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, die Exposition von Adhäsionsrezeptoren und die Aktinpolymerisation können durch die Cyclonukleotid vermittelte Kinasenaktivierung fast vollständig gehemmt werden. Die Vielfalt der cGMP bindenden Proteine und deren synergistische Interaktion mit cAMP vermittelten Signalwegen deuten auf eine Reihe von cGMP Zielproteinen hin. Vor kurzem wurde die zentrale Bedeutung einer Gi-Protein Stimulation für die Plättchenaktivierung und –aggregation gezeigt. In dieser Dissertation wurde daher der Frage nachgegangen, ob Signalmoleküle, die an Gi-Protein vermittelten Effekten beteiligt sind, einen Angriffspunkt für cAMP/cGMP-abhängige Proteinkinasen darstellen. Zu diesem Zweck wurden die Effekte erhöhter cGMP Spiegel und die selektive Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase auf die adrenerge und purinerge Rezeptor vermittelte Erniedrigung stimulierter cAMP Konzentrationen untersucht. In unseren Versuchen konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine Erhöhung der intrazellulären cGMP Konzentration Gi-Protein vermittelte Signale hemmt. Dieses erfolgt nicht auf Grund einer cGMP stimulierten Aktivierung von cyclonukleotidabbauenden Phosphodiesterasen, sondern auf Grund einer Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase. In Anbetracht der essentiellen Bedeutung der Gi-Protein Stimulation für die Plättchenaktivierung stellt dies einen wichtigen Mechanismus dar, wie das aus dem Endothel freigesetzte NO über cGMP die Thrombozytenfunktion hemmt. Klinisch bedeutsame Substanzen wie Clopidogrel oder Ticlopidin imitieren diesen in vivo Effekt des NO, indem sie extrazellulär über eine Rezeptorhemmung Gi-Protein Stimulation verhindern. (Aktas et al., Biochem Pharmacol 2002; 64: 433-439) Dipyridamol und im Besonderen die Kombination von Dipyridamol und niedrig dosierter Acetylsalicylsäure sind in der Sekundärprävention des Schlaganfalles sehr gut wirksam. Jedoch sind die hierfür zu Grunde liegenden biochemischen Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt. Da für das Dipyridamol eine in vitro Hemmung der cGMP-spezifischen Phosphodiesterase 5 (PDE 5) nachgewiesen ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob Dipyridamol in therapeutisch relevanten Konzentrationen die NO/cGMP vermittelte Effekte auf die Plättchenfunktion unter ex vivo Bedingungen verstärkt. Die Phosphorylierung von VASP (VAsodilator-Stimulated Phosphoprotein) diente dabei als Meßparameter NO/cGMP Signale in Thrombozyten mit Hilfe von Antikörpern und Western Blot Technik zu quantifizieren. Die Sekretion von Serotonin aus Thrombozyten und die Aktivität der Thromboxansynthase wurden durch die fluorimetrische Bestimmung derivatisierten Serotonins bzw. des Synthaseprodukts Malondialdehyd quantifiziert. Endotheliale Faktoren wie NO oder PG-I2 erhöhen cGMP bzw. cAMP, die zu einer Plättchenhemmung und gleichzeitigen VASP Phosphorylierung führen. In in vitro Versuchen potenzierte Dipyridamol in einer therapeutisch relevanten Konzentration (3,5 µmol/l) nur die cGMP vermittelte, aber nicht die cAMP vermittelte VASP Phosphorylierung. Darüber hinaus konnte Dipyridamol (3,5 µmol/l) die Hemmung von Plättchenfunktionen wie der Serotoninsekretion und die Aktivität der Thromboxansynthase durch einen NO Donor klar verstärken. Schließlich steigerte Dipyridamol die NO vermittelte VASP Phosphorylierung auch in Thrombozyten von Probanden, die vorher Dipyridamol eingenommen hatten. Unter therapeutisch relevanten Bedingungen verstärkt also Dipyridamol NO/cGMP Signalwege und damit die Hemmung von Thrombozyten. Dieser Befund bekräftigt die Vorstellung, dass die Verstärkung endothelialer NO/cGMP Effekte auf Thrombozyten eine wichtige Komponente der Dipyridamol Wirkung unter in vivo Bedingungen darstellt. (Aktas et al., Stroke 2003; 34(3): 764-769) Die Stimulation von Thrombozyten führt u.a. zu einer Sekretion von Plättchenaktivatoren wie Thrombin, Thromboxan A2, ADP oder Serotonin aus dem Zellinnern. Durch diesen Prozess der Degranulierung können nun weitere Thrombozyten aktiviert werden. Die Sekretion stellt somit einen wichtigen, verstärkenden Schritt in der Aktivierung von Thrombozyten während der Hämostase dar. Diese Arbeit zeigt, dass in Thrombozyten eine Gi-Protein Aktivierung nicht nur wie bisher angenommen eine initiale Sekretion durch Gq verstärkt und aufrecht erhält, sondern der eigentliche Stimulus ist, der die Degranulierung von Thrombozyten auslöst. Die Stimulation Gq vermittelter Signalwege ist nur insofern erforderlich, als diese das Auslösen der Sekretion durch eine Aktivierung von Gi-Proteinen ermöglichen. Die Stimulierung beider G-Proteine ist daher essentiell für die thrombozytäre Sekretion. Zudem konnte die Phospholipase D als ein neuer Effektor des P2Y12 nachgewiesen werden, deren Stimulierung wahrscheinlich zur Degranulierung von Thrombozyten führt. Dieser Mechanismus könnte der Entscheidende sein, der der essentiellen Rolle des Gi-Proteins bei der Stimulation der Sekretion und der Aktivierung von Thrombozyten zu Grunde liegt und könnte ein neues Licht auf die Wirkweise des Clopidogrels und des Ticlopidins werfen, die irreversibel an den P2Y12 Rezeptor binden. (Aktas et al., Manuskript in Vorbereitung)
Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier.