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Die muscarinischen Rezeptoren sind ein wichtiger Bestandteil des parasympathischen Nervensystems. Sie gehören zur großen Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die nach ihrer Verwandtschaft in drei große Klassen eingeteilt werden können. Die muscarinischen Rezeptoren gehören zur Klasse A, den rhodopsinähnlichen Rezeptoren. Durch die im Jahr 2000 vorgenommene Aufklärung der hochauflösenden Röntgenkristallstruktur des Rinderrhodpsins und die hohe Aminosäuresequenzähnlichkeit der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren hat man eine sehr gute Modellvorstellung über den Aufbau der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die Rezeptoren bestehen aus sieben transmembranalen Helices, die von drei intrazellulären und drei extrazellulären Loops stabilisiert werden. Bis heute konnten fünf Rezeptorsubtypen gentechnisch klassifiziert werden, die sich durch ihre Gewebeverteilung und Funktion unterscheiden. Allen Subtypen ist eine hohe Sequenzhomologie im Bereich der orthosteren Bindungsstelle gemeinsam, so dass die Entwicklung von subtyp-spezifischen orthosteren Liganden sehr schwierig ist. Außer der orthosteren Bindungsstelle konnte noch eine weitere Bindungsstelle am muscarinischen Rezeptor identifiziert werden. Diese befindet sich weiter außerhalb im Rezeptor in einem Bereich, der über die fünf Rezeptorsubtypen nicht sehr stark konserviert ist, so dass die Entwicklung von subtyp-spezifischen Liganden möglich ist. An dieser zweiten Bindungsstelle binden allostere Modulatoren. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die ohne den orthosteren Liganden keinen Effekt am Rezeptor auslösen, dafür aber die Gleichgewichtsbindung des orthosteren Liganden beeinflussen können. Der Einfluss auf die Gleichgewichtsbindung geschieht wechselseitig und kann positiv, neutral oder negativ kooperativ sein. Zusätzlich üben allostere Modulatoren einen Effekt auf die Dissoziation des orthosteren Liganden aus. Die meisten bisher gefunden allosteren Modulatoren erniedrigen die Dissoziationsgeschwindikeit des orthosteren Liganden vom Rezeptor. Die Summe dieser Eigenschaften machen die allosteren Modulatoren sehr interessant für die Arzneimitteltherapie. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese strukturell neuer allosterer Modulatoren des muscarinischen Rezeptors unter Anwendung des postulierten Pharmakophormodells. Als Ausgangspunkt sollten geländerhelicale Moleküle dienen, die strukturell abgewandelt dieses Pharmakophormodell sehr gut erfüllen. Die geländerhelicalen Moleküle ähneln in ihrem dreidimensionalen Aufbau dem Geländer einer Wendeltreppe. Sie sind durch die Brücken zwischen den aromatischen Bereichen sehr rigide Moleküle, so dass es nur wenige genau definierte Konformationen gibt. Grundsätzlich können drei Atropisomere unterschieden werden, wobei zwei zueinander enantiomer sind. Geplant war die Synthese eine Reihe von tertiären Aminen oder quartären Ammoniumsalzen. Die Synthese der Ausgangsverbindung konnte nach der Vorschrift von Kiupel erfolgen, war aber nur mit geringer Ausbeute möglich. Deshalb wurde dieser Syntheseweg nicht weiterverfolgt. Als Alternative bot sich an, auf die Brücken zwischen den aromatischen Ringen zu verzichten. Die so entstandenen Verbindungen sind weniger rigide und können sich deshalb gegebenenfalls besser an den Rezeptor anpassen. Grundsätzlich können je nach Substitutionsmuster zwei Synthesewege verfolgt werden. Beide Varianten erfüllen das postulierte Pharmakophormodell. Der Aufbau des Grundgerüstes erfolgt mittels einer nickelkatalysierten Grignard-Kupplung. Danach erfolgen eine Wohl-Ziegler-Seitenkettenbromierung und eine Verlängerung der Seitenkette im Sinne einer Alkylierung mittels Malonsäurediethylester und einer Hilfsbase. Anschließend erfolgen die Decarboxylierung und die Umsetzung zum Amid, das zum Amin reduziert werden kann. Betrachtet man die Lage der Pharmakophorelemente so variiert der Abstand der positiv geladenen Stickstoffe je nach Konformation zwischen 5 Å und 15 Å, so dass ein weiter Bereich abgedeckt werden kann. Der Abstand der aromatischen Bereiche bleibt relativ stabil. Die pharmakologische Testung der Verbindungen auf ihre allostere Potenz und Affinität zum muscarinischen Rezeptor erfolgte in der Arbeitsgruppe von Prof. Mohr in Bonn. Hierzu werden Membranhomogenate vom Herzventrikelgewebe des Hausschweines verwendet. Diese enthalten mit großer Prävalenz muscarinische M2-Rezeptoren. Es wurden Gleichgewichtsbindungs- und Dissoziationsexperimente durchgeführt. Bis jetzt sind noch nicht alle Verbindungen getestet worden. Die bisher getesteten Verbindungen weisen alle eine Affinität zum mit [3H]-N-Methylscopolamin besetzten muscarinischen M2-Rezeptor im mikro-molaren Bereich auf. Sie liegen damit im oberen Bereich der bisher synthetisierten allosteren Modulatoren. Das postulierte Pharmakophormodell konnte also mit Hilfe der synthetisierten Substanzen bestätigt werden.
The past decades have witnessed the development of new pharmaceutical compounds that modulate receptor function by targeting allosteric sites. Allosteric sites are, by definition, domains topographically distinct from the orthosteric binding pocket where the natural ligand binds. Exploring the possibilities of linking orthosteric and allosteric pharmacophores in one compound to yield ‘bitopic’ compounds is a strategy derived from the “message-address” concept by Schwyzer , first applied to GPCRs by Portoghese et al. This concept explicitly underlines the orthosteric/allosteric combination, in opposite to the more general umbrella term bivalent. The broad possibilities of bitopic ligands in the pharmaceutical field are under continuous study. Bitopic compounds are promising pharmaceutical tools for taking advantage of the allosteric binding to achieve subtype selectivity while preserving high affinity at the receptor. The development of bitopic ligands, based on the idea of combining high affinity (via orthosteric sites) with high selectivity (via allosteric sites), have led to the development of highly selective bivalent ligands for GPCRs , such as for the opioid receptors , muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), serotonin receptors, cannabinoid receptors, and gonadotropin-releasing hormone receptors. This concept has even been extended to other receptors, for examples nicotinic receptors and other proteins, such as acetylcholinesterases and the tyrosine kinase receptors TrkA and TrkC. The reasons to pursue a bitopic ligand approach are various. An improved affinity for the target GPCR and/or an improved selectivity either at the level of receptor subtype, or at the level of signaling pathway. Another advantage of bitopic ligands over purely allosteric ligands is that the former rely on the appropriate presence of endogenous agonist tone to mediate their effects, whereas a bitopic ligand would engage the orthosteric site irrespective of the presence or absence of endogenous tone. By way of introduction to the hybrid approach, a review of the concept of hybrids compounds targeting the cholinergic system is presented in section A of this thesis. Recent updates in hybrid molecule design as a strategy for selectively addressing multiple target proteins involved in Alzheimer's disease (AD) is here reported . This represents the potential and the growing interest in hybrid compound as pharmacological tools to achieve receptor subtype selectivity and/or, to study the overall functional activity of the receptor. Until now, muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) have proved to be a particularly fruitful receptor model for the development and characterization of bitopic ligands. In this thesis, several examples of new muscarinic bitopic approach are reported in the results section. A study of bipharmacophoric ligands composed of the muscarinic positive allosteric modulators (BQCAderived compounds) linked with chain of various lengths to different orthosteric building blocks is reported in the result part 1. Synthesis and examination of the potential pharmacological characteristic of Oxotremorine-BQCAd compounds and Xanomeline-BQCAd hybrid derivatives are described in results parts 2 and 4, respectively. Moreover, the bitopic concept has even been extended to other proteins, such as acetylcholinesterase. In the result part 5 an overview of the new Tacrine-Xanomeline hybrids aiming to improve the inhibitory potency of the acetylcholinesterase and simultaneously to increase the cholinergic tone, via the xanomelinic portion acting on the M1 receptor is given. A new trivalent approach is presented for the first time to deepen the study of the M1 muscarinic receptor in the result part 6. Moreover, the synthesis of a new series of iperoxo-derived alkane, bis(ammonio)alkane-type and rigidified chain ligands is given in the result part 7 together with some prospects for further research.
Da die Kontrolle der Kontraktion am Myometrium in der klinischen Praxis eine bedeutende Rolle spielt, sind Kenntnisse über die Physiologie zur Blockierung der Wehentätigkeit und Vermeidung von Frühgeburtlichkeit unverzichtbar. Der Einfuß des sympathischen Nervensystems mit Alpha und Beta-Rezeptoren ist gut untersucht, weshalb wir in der vorliegenden Arbeit eine Untersuchung zur Verteilung der muscarinischen Rezeptoren M1-M5 im schwangeren und nicht schwangeren Myometrium durchführten. Diese G-Protein gesteuerten parasympathischen Rezeptoren sind beispielsweise an Kontraktionsvorgängen in Blasen-, Magen-Darm- und Bronchialmuskulatur beteiligt und könnten so auch im Myometrium eine Rolle spielen. Mittels RT-PCR wurden 21 Myometriumbiopsien analysiert, wovon 11 Myometriumproben von Patientinnen in der 40. Schwangerschaftswoche, sowie jeweils 3 Proben von Patientinnen in der 32. Schwangerschaftswoche und von Patientinnen in der 25. Schwangerschaftswoche stammten, desweiteren eine Probe einer in der 10. Schwangerschaftswoche durch Hysterektomie abgebrochenen Schwangerschaft. Die drei letzten Proben stammten von nicht schwangeren Patientinnen nach vaginaler Hysterektomie. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl zu verschiedenen Zeitpunkten in der Schwangerschaft, als auch am nicht schwangeren Myometrium jeweils m-RNA für M2, M3 und M5 muscarinische Rezeptoren existiert. Die durch die hier angewendeten Verfahren zur Gewebepräparation, Gewinnung von RNA und Anwendung der RT-PCR vorliegenden Ergebnisse sollten auf Proteinebene bestätigt werden, die Durchführung funktioneller Studien wäre wünschenswert.
Die Subtypselektivität von Liganden für einzelne Rezeptoren, deren Aktivierung und die anschließende Signalweiterleitung sind bis heute weitestgehend ungeklärt. Die hier synthetisierten Liganden-Gruppen sollen helfen, die verschiedenen Prozesse am muskarinischen Rezeptor und seinen Subtypen zu verstehen. Die Einzelprojekte werden im Folgenden vorgestellt. 1) Um mittels FRET-Mikroskopie den Einfluss von allosteren Modulatoren, die sich von W84 bzw. Naphmethonium ableiten, in Bezug auf die Konformationsänderung aktivierter Rezeptoren untersuchen zu können, wurden die bekannten allosteren Bausteine sowie eine Reihe neuer Derivate synthetisiert. Alle untersuchten Substanzen zeigten einen hemmenden Effekt auf die mit dem Agonisten Iper-oxo vorstimulierten Rezeptoren. Das heißt, die Verbindungen ließen sich als negative allostere Modulatoren charakterisieren. 2) Da Iperoxo aufgrund seiner großen agonistischen Aktivität ein interessantes Werkzeug für die Grundlagenforschung darstellt, war es von großer Bedeutung, eine schnelle und reproduzierbare Synthese zu gewährleisten. Ausgehend von Propargylalkohol wurde in einer Mannich-Reaktion 4-Dimethylamino-but-2-en-1-ol gebildet, was mit dem zuvor hergestellten 3-Nitro-Δ2-isoxazolin zur Iperoxo-Base umgesetzt wurde. Neben einer deutlichen Ausbeutesteigerung ist nun die Reproduzierbarkeit im Gegensatz zu der von Dallanoce et al. publizierten Synthese gewährleistet. 3) Um den Einfluss der Kettenlänge der Hybride Iper-6-Phth und Iper-6-Naph auf die agonistische Aktivität und Subtypselektivität der Substanzen untersuchen zu können, wurde versucht, Hybride verschiedener Kettenlängen herzustellen. Dabei konnte Iper-4-Phth erhalten werden. 4) Weiterhin sollte der Einfluss der Alkylkette am Stickstoff-Atom auf die Wirksamkeit in Bezug auf Affinität und Zellantwort des Iperoxo-Moleküls ohne allosteren Modulator analysiert werden. Hierzu wurden die N-alkylierten Iperoxo-Derivate mit den Kettenlängen C2 bis C10 synthetisiert.. Mithilfe von Radioligand-Bindungsstudien und der dynamischen Massenumverteilung sollte die konformative Änderung des Rezeptors durch Aktivierung und die Signalweiterleitung untersucht werden. Durch Verlängerung der N-Alkylkette zeigte sich ein Wirksamkeitsverlust, d. h. die Dosis-Wirkungs-Kurven der prozentualen Zellantwort wurden im Vergleich zu denen des Iperoxos nach rechts verschoben. In Untersuchungen an der Rezeptor-Mutante CHO-hM2-Y1043.33A zeigte sich zudem, dass für den maximalen Effekt eine deutlich höhere Konzentration der Iperoxo-Derivate benötigt wird, wobei dieser Wirksamkeitsverlust im Vergleich zum Rezeptor-Wildtyp für Iperoxo selbst am stärksten ausgeprägt ist. Allerdings weisen Iperoxo und seine N-alkylierten Derivate an dieser Mutante eine höhere intrinsische Aktivität auf als die Kontrollverbindungen Oxotremorin M, C1-IP-C1 und Acetylcholin. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Iperoxo ebenso wie Oxotremorin, Acetylcholin, aber auch die kurzkettigen Iperoxo-Derivate neben dem Gi-Signalweg auch den Gs-Weg aktivieren können, wohingegen die langkettigen Derivate eine Gi-Signalwegs-Selektivität aufweisen. 5) In Analogie zu den N-alkylierten-Iperoxo-Derivaten sollten Untersuchungen mit den Antagonisten N-Alkyl-Atropin und -Scopolamin durchgeführt werden. In beiden Fällen zeigte das N-Methyl-Derivat eine höhere Affinität zum Rezeptor als der jeweilige Antagonist selbst, was auf die durch Alkylierung generierte positive Ladung zurückzuführen ist. Durch Verlängerung der Alkylketten ist jeweils eine Abnahme der Affinität zu beobachten. Die Affinität findet ebenfalls in beiden Fällen mit dem Butyl-Derivat ihr Minimum. Der anfängliche Affinitätsverlust lässt sich durch die zunehmende sterische Hinderung des Moleküls erklären, der spätere Anstieg bei einer Alkylkette länger als C4 deutet auf eine Wechselwirkung dieser langen Alkylkette mit einer weiteren (allosteren) Bindungsstelle hin. 6) Ausgehend von Iperoxo sollten dualstere Liganden entwickelt werden, die durch geeignete allostere Modulatoren selektiv nur einen Rezeptor-Subtyp adressieren und diesen durch Iperoxo aktivieren sollten. Als allostere Bausteine sollten die M4-selektiven Thienopyridine und die M1-selektiven Chinolone verwendet werden. 7) Zur Fluoreszenzmarkierung sollte Iperoxo-Base zudem mit dem Farbstoff Py-1 umgesetzt werden.
Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven Änderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Phänomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) können in fünf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen fünf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, können so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. Für ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden für den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gewählt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angefügt. Die zur Markierung mit FlAsH nötige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellulären Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bezüglich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zunächst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkstärke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabhängig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabhängig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformationsänderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen für 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare Änderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob für die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkstärke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine äußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant stärker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine stärkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine stärkere Bewegung unterhalb von Transmembrandomäne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse für EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine größere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einflüsse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen möglich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Während eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-Änderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzuklären, wurden verschiedene Ansätze gewählt: Mit kettenverlängerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine Änderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins führte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signaländerung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu ermöglichen. Ein anderer Erklärungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformationsänderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Darüber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivität mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformationsänderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias für diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bezüglich ihrer Fähigkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verlängerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformationsänderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den ursprünglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle möglich ist, ursächlich für die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war.
Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (Kir), aktuell in die 7 Unterfamilien Kir1-Kir7 eingeteilt, sind an der Regulation einer Vielzahl von Körperfunktionen, beispielsweise Herzfrequenz, Erregbarkeit von Nervenzellen, Tonus von Gefäßmuskelzellen, Hormonsekretion oder Aktivierung von Immunzellen, beteiligt. Für die Kontrolle dieser Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Leitfähigkeit dieser Kanäle beeinflusst werden kann. Die Kir3-Unterfamilie (früher GIRK für G-protein-activated-K+-channels) wird beispielsweise obligat durch die direkte Bindung der beta/gamma-Untereinheit des trimeren Gi/0-Proteins aktiviert (Karschin, 1999). Es gibt Hinweise in der Literatur, dass auch die stark einwärts gleichrichtenden Kanäle der Kir2-Familie durch G-Proteine der Gq-Familie reguliert sein können. Dabei widersprechen sich insbesondere zwei Untersuchungen zur Spezifität der Interaktion (Jones, 1996; Chuang et al., 1997). Ebenso ist der intrazelluläre Signalweg bislang nicht hinreichend geklärt. Um dies genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die Kir-Kanäle Kir2.1-Kir2.4 jeweils mit 5 verschiedenen Gq-gekoppelten Rezeptoren in Xenopus-Oozyten koexprimiert und mit der Technik der „Zwei-Elektroden-Spannungsklemme“ der Strom über die Kir-Kanäle vor und nach Rezeptoraktivierung mit dem jeweils physiologischen Rezeptoragonisten gemessen. Es zeigte sich, dass ausschließlich Kir2.3 nach Aktivierung des M1-Acetylcholinrezeptors inhibiert wird. Eine Sequenzanalyse zeigte in der Extrazellulärregion von Kir2.3 eine zu den anderen Kir2-Kanälen abweichende Aminosäuresequenz, welche durch Mutation aber als potentielle Bindestelle zur Vermittlung des inhibitorischen Effektes ausgeschlossen werden konnte. Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Koexpression von Kir2.3 und M1-Acetylcholinrezeptor in bestimmten Gehirnregionen der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit dient (Shen et al., 2007), ist es wahrscheinlich, dass derselbe Mechanismus auch in ventrikulären Kardiomyozyten existiert und dort als Schutzmechanismus vor vagaler Überstimulation fungiert.
G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest receptor family that is encoded in the human genome and represent the most druggable target structure for modern therapeutics respectively future drug development. Belonging to aminergic class A GPCRs muscarinic Acetylcholine receptors (mAChRs) are already now of clinical relevance and are also seen as promising future drug targets for treating neurodegenerative diseases like Alzheimer or Parkinson. The mAChR family consist of five subtypes showing high sequence identity for the endogenous ligand binding region and thus it is challenging until now to selectively activate a single receptor subtype. A well accepted method to study ligand binding, dynamic receptor activation and downstream signaling is the fluorescence resonance energy transfer (FRET) application. Here, there relative distance between two fluorophores in close proximity (<10 nm) can be monitored in a dynamic manner. The perquisite for that is the spectral overlap of the emission spectrum of the first fluorophore with the excitation spectrum of the second fluorophore. By inserting two fluorophores into the molecular receptor structure receptor FRET sensors can serve as a powerful tool to study dynamic receptor pharmacology.
Dualsteric Ligands consist of two different pharmacophoric entities and are regarded as a promising ligand design for future drug development. The orthosteric part interacts with high affinity with the endogenous ligand binding region whereas the allosteric part binds to a different receptor region mostly located in the extracellular vestibule. Both moieties are covalently linked. Dualsteric ligands exhibit a dynamic ligand binding. The dualsteric binding position is characterized by a simultaneous binding of the orthosteric and allosteric moiety to the receptor and thus by receptor activation. In the purely allosteric binding position no receptor activation can be monitored.
In the present work the first receptor FRET sensor for the muscarinic subtype 1 (M1) was generated and characterized. The M1-I3N-CFP sensor showed an unaltered physiological behavior as well as ligand and concentration dependent responses. The sensor was used to characterize different sets of dualsteric ligands concerning their pharmacological properties like receptor activation. It was shown that the hybrids consisting of the synthetic full agonist iperoxo and the positive allosteric modulator of BQCA type is very promising. Furthermore, it was shown for orthosteric as well as dualsteric ligands that the degree of receptor activation is highly dependent on the length of and the chemical properties of the linker moiety. For dualsteric ligands a bell-shaped activation characteristic was reported for the first time, suggesting that there is an optimal linker length for dualsteric ligands. The gained knowledge about hybrid design was then used to generate and characterize the first photo-switchable dualsteric ligand. The resulting hybrids were characterized with the M1-I3N-CFP sensor and were described as photo-inactivatable and dimmable. In addition to the ligand characterization the ligand application methodology was further developed and improved. Thus, a fragment-based screening approach for dualsteric ligands was reported in this study for the first time. With this approach it is possible to investigate dualsteric ligands in greater detail by applying either single ligand fragments alone or in a mixture of building blocks. These studies revealed the insights that the effect of dualsteric ligands on a GPCR can be rebuild by applying the single building blocks simultaneously. The fragment-based screening provides high potential for the molecular understanding of dualsteric ligands and for future screening approaches. Next, a further development of the standard procedure for measuring FRET by sensitized emission was performed. Under normal conditions single cell FRET is measured on glass coverslips. After coating the coverslips surface with a 20 nm thick gold layer an increased FRET efficiency up to 60 % could be reported. This finding was validated in different approaches und in different configurations. This FRET enhancement by plasmonic surfaces was until yet unreported in the literature for physiological systems and make FRET for future projects even more powerful.
The study deals with the area of the allosteric modulation of the muscarinic M2 receptors. The allosteric modulators have an influence on binding of orthosteric ligands (agonists and antagonists) to the classical orthosteric binding site of the muscarinic M2-receptors. The modulators are able to enhance (positive cooperativity) or decrease (negative cooperativity)the affinity of ligands to the orthosteric binding site. The allosteric binding site is located at the entrance of the receptor binding pocket. It is less conserved than the orthosteric binding site which is located in a narrow cavity created by the seven transmembrane domains. Consequently, development of subtype selective allosteric ligands is easier than subtypeselective muscarinic agonists or antagonists. Furthermore, subtype selectivity can be achieved by differently cooperative interactions between the allosteric and orthosteric ligand at different receptor subtypes. For example, the allosteric modulators that are positively cooperative with ACh at M1 receptors and neutrally cooperative at the other receptor subtypes could be beneficial for treatment of the Alzheimer’s disease. Bisquaternary analogues of the Strychnos alkaloid caracurine V are among the most potent allosteric modulators of muscarinic M2-receptors. The very rigid ring skeleton comprises the pharmacophoric elements of two positively charged nitrogens at an approximate distance of 10 surrounded by two aromatic ring systems in a distinct spatial arrangement. Owing to the close structural relationship of caracurine V salts to the strong muscle relaxants toxiferine and alcuronium, they are likely to exhibit neuromuscular blocking activity, which would limit their usefulness as research tools and make the therapeutical use impossible. Reduction of the caracurine V ring skeletons to structural features responsible for good allosteric potency could possibly lead to compounds with negligible neuromuscular blocking activity and very high affinity to the allosteric binding site at M2 receptor. Thus, the aim of this study was to synthesize and pharmacologically evaluate analogues of a novel heterocyclic ring system, which comprises the pharmacophoric elements mentioned previously. The key step of the synthesis of the desired 6,7,14,15-tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole ring system (6) involved the intermolecular double N-alkylation of the bromoethylindole (5), which was prepared from the known indolyl methylacetate (3) by reduction of the ester group to alcohol and subsequent substitution by bromine. 3 could be prepared in three steps involving N,N-dibenzylation of tryptamine followed by introduction of the dimethyl malonate moiety at C-2 of indole ring and a subsequent demethoxycarbonylation. The total synthesis of 6,7,14,15-tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]diindole ring system (6) is shown in Scheme 24. In order to examine the influence of the length of the side-chain on muscarinic activity,exchange of the ethylamine moieties of 14 by the methylamino groups was planned. This should be accomplished by dimerization of the unsubstituted 2-bromoethylindole (32), and subsequent Mannich aminomethylation of the resulting unsubstituted pentacyclic ring. The total synthesis of the 6,7,14,15-tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindole ring system(35) is shown in Scheme 25. 32 was prepared from indole-2-carboxylic acid in six steps involving reduction of the acid to the corresponding alcohol 26, benzoylation of 26 followed by nucleophilic substitution with KCN, hydrolysis of the cyanide 28 to indolyl acetic acid 29,reduction of 29 to the corresponding alcohol 30, and finally bromination of 30 to give the bromide 32. Since dimerization attempts of 32 provided only 2-vinylindole (33), the tosylate 34 was used as starting material for the intermolecular alkylation to give exclusively an isomeric pentacyclic ring system, 7,14,15-tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindole (35). The formation of the novel, asymmetric ring skeleton can be explained by the ambident nucleophilic character of the indolyl anion that can be alkylated either at nitrogen or at C-3 of indole ring. 35 was subjected to a Mannich reaction to give 2,13-dimethylaminoalkylated product 37 as well as small amounts of the 13-monosubstituted compound (36). The geometry of novel ring systems 6 was elucidated by means of NMR spectroscopy and semiempirical calculations. The diazocinodiindole ring skeleton of 6 exists in chloroform solution at room temperature in a twisted-boat conformation, as indicated by 600 MHz ROESY experiment, vicinal coupling constants within the eight-membered ring, and AM1 calculations. In order to obtain potent allosteric ligands, the new heterocycles 6 and 37 were quarternized with methyliodide to the corresponding ammonium salts 14 and 38, respectively. Additionally, the N,N -diallylsalts of 37 (compound 39) was prepared. The allosteric effect of 14, 38, and 39 on the dissociation of the orthosteric radioligand [3H]Nmethylscopolamine([3H]NMS) and their effects on [3H]NMS equilibrium binding were studied in homogenates of porcine heart ventricles. The concentration of an allosteric agent for a half-maximum effect on orthosteric ligand dissociation (EC50,diss) corresponds to a 50 % occupancy of the liganded receptors by the respective allosteric test compounds. Due to the presence of two benzyl groups on each nitrogen in the side chains of 14, its binding affinity can be best compared with that of N,N -dibenzylcaracurinium V dibromide (EC50,diss = 69 nM). Compound 14 exhibited the comparable affinity to N,N -dibenzylcaracurinium V dibromide with EC50,diss = 54 nM. This result suggested that replacement of the bulky benzyl groups of 14 by smaller substitutents will probably increase the allosteric potency, since dimethyl- and diallylcaracurinium salts showed a 5-fold increase of binding affinity relative to the dibenzyl analogue. Even though the new azocinodiindole ring system of 38 and 39, is not included in the caracurine V ring skeleton, it comprises the essentially pharmacophoric elements of allosteric potency. Due to the different spatial arrangements of the aromatic rings, as well as to different internitrogen distances in both ring systems, compound 38 and 39 exhibited 4-fold lower M2 binding affinity (EC50,diss = 35 and 48 nM, respectively) than the corresponding caracurine V analogues. This study deals with the synthesis of the first representative (Compound 6) of a novel pentacyclic ring system derived from caracurine V. The high allosteric potency of its dimethyl analogue reveals the [1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole ring system as a new promising lead structure for allosteric modulators of muscarinic M2 receptors. Future research will be focused on structural modifications of the new ring system in order to increase the affinity to the muscarinic receptors. Furthermore, the binding affinities of the new synthesized compounds to the muscle type of nicotinic ACh-receptor should reveal structural features responsible for the muscarinic/nicotinic selectivity.
G protein-coupled receptor research looks out for new technologies to elucidate the complex
processes of receptor activation, function and downstream signaling with spatiotemporal
resolution, preferably in living cells and organisms. A thriving approach consists in making use
of the unsurpassed properties of light, including its high precision in space and time, noninvasiveness
and high degree of orthogonality regarding biological processes. This is realized
by the incorporation of molecular photoswitches, which are able to effectively respond to light,
such as azobenzene, into the structure of a ligand of a given receptor. The muscarinic
acetylcholine receptors belong to class A GPCRs and have received special attention in this
regard due to their role as a prototypic pharmacological system and their therapeutic potential.
They mediate the excitatory and inhibitory effects of the neurotransmitter acetylcholine and
thus regulate diverse important biological processes, especially many neurological functions in
our brain.
In this work, the application of photopharmacological tool compounds to muscarinic receptors
is presented, consisting of pharmacophores extended with azobenzene as light-responsive
motif. Making use of the dualsteric concept, such photochromic ligands can be designed to bind
concomitantly to the orthosteric and allosteric binding site of the receptor, which is
demonstrated for BQCAAI (M1) and PAI (M2) and may lead to subtype- and functionalselective
photoswitchable ligands, suitable for further ex vivo and in vivo studies.
Moreover, photoswitchable ligands based on the synthetic agonist iperoxo were investigated
extensively with regard to their photochemical behavior and pharmacological profile, outlining
the advantages and challenges of using red-shifted molecular photoswitches, such as tetraortho-
fluoro azobenzene. For the first time on a GPCR it was examined, which impact the
different substitution pattern has on both the binding and the activity on the M1 receptor. Results
show that substituted azobenzenes in photopharmacological compounds (F4-photoiperoxo and
F4-iper-azo-iper) not just represent analogs with other photophysical properties but can exhibit
a considerably different biological profile that has to be investigated carefully.
The achievements gained in this study can give important new insights into the binding mode
and time course of activation processes, enabling precise spatial and temporal resolution of the
complex signaling pathway of muscarinic receptors. Due to their role as exemplary model
system, these findings may be useful for the investigation into other therapeutically relevant
GPCRs.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neuartige siliciumhaltige Muscarinrezeptor-Antagonisten, Dopaminrezeptor-Antagonisten, Ca2+-Kanal-Blocker sowie alpha1-Rezeptor-Antagonisten synthetisiert, welche Sila-Analoga (C/Si-Austausch) bekannter organischer Pharmaka darstellen. Die C/Si-Analoga wurden pharmakologisch charakterisiert und damit Beiträge zur Thematik der C/Si-Bioisosterie geleistet.