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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese, Charakterisierung und Untersuchung von Foldameren und ihren Untereinheiten im Rahmen des FOLDAPPI-Projekts (Foldamers against Protein-Protein Interaction). Des Weiteren wurden neuartig substituierte Chinoline dargestellt, um sie im Rahmen des SFB 630 auf ihre Hemmwirkung gegen Leishmanien und Trypanosomen zu untersuchen.
Im ersten Projekt wurde ein neuartiges Monomer entwickelt, welches die Wasserlöslichkeit der Foldamere verbessern sollte. Zu diesem Zweck wurde eine zusätzliche, hoch polare Seitenkette in den Chinolingrundkörper eingeführt. Dieses modifizierte Monomer konnte erfolgreich synthetisiert werden. Um die Verbesserung der Wasserlöslichkeit gegenüber dem zuvor verwendeten Monomer zu testen, wurde erfolgreich ein Tetramer daraus aufgebaut. Das entschützte Tetramer konnte jedoch aufgrund seiner hohen Polarität nicht ausreichend gereinigt werden, um die abschließenden Löslichkeitsuntersuchungen durchzuführen. Um dieses Problem zu umgehen, wurde von der Umsetzung in Lösung auf Reaktionen an der Festphase gewechselt, was die Reinigung der Produkte wesentlich erleichtern sollte. Dabei wurde eine vom Arbeitskreis von I. Huc neu entwickelte mikrowellengestützte Methode verwendet. Das Referenzmolekül mit den bisher verwendeten Seitenketten konnte so ohne Probleme synthetisiert und seine Löslichkeit in Wasser bestimmt werden. Beim neu entwickelten Monomer kam es allerdings beim Aufbau des Tetrameres zu einer Zersetzungsreaktion, weshalb das abschließende Ziel nicht erreicht werden konnte.
Im zweiten Projekt wurden zwei Ziele angestrebt: Zunächst sollte ein Weg gefunden werden, die Einführung der Seitenketten an den Chinolinen erst an der festen Phase vorzunehmen, wodurch viele Syntheseschritte bei der Vorbereitung der Monomere gespart werden könnten. Zusätzlich sollte eine neue Kupplungsreaktion entwickelt werden, wodurch der Entschützungsschritt des zu kuppelnden Amins an der Festphase eingespart werden kann. Dadurch würde vor allem bei großen Foldameren das Harz geschont und die Gefahr einer Degenerierung wesentlich verringert. Für die Kupplungsreaktion vorgesehen war ein azidfunktionalisiertes Monomer, das mittels Staudinger-Reaktion verknüpft werden sollte. Das entsprechende Monomer konnte erfolgreich synthetisiert werden. Auch das erste Ziel, die Einführung der Seitenkette an der Festphase, konnte erfolgreich durchgeführt werden. Leider war die Verwirklichung beider Ziele über die gleiche Syntheseroute nicht ohne weiteres möglich. Da das Monomer ohne die Seitenkette deutlich hydrophiler wurde, wäre eine Trocknungsmethode bei erhöhter Temperatur von Vorteil gewesen, um gebundenes Wasser vollständig zu entfernen. Da das Monomer allerdings auch eine Azidfunktion trägt und sich bei 130 °C explosionsartig zersetzt, war dies nicht möglich. Allerdings genügen bereits geringe Spuren von Feuchtigkeit, um die Staudinger-Reaktion zu beeinträchtigten. Deshalb konnte das zweite Projektziel nicht verwirklicht werden.
Im dritten Projekt wurde die Herstellung einer großen Foldamer-Bibliothek für die Untersuchung der Bindungsaffinität gegenüber IL-4 angestrebt. Sie sollte aus 48 Hexameren bestehen, wobei an drei Monomeren die Seitenketten variiert werden sollten, um ein breites Spektum an verschiedenen Kombinationen von Wechselwirkungen abzudecken. Dazu wurden zunächst vier verschiedene Monomere synthetisiert, welche eine aromatisch, eine unpolare, eine anionische bzw. eine kationische Seitenkette enthielten. Für die Kupplung der Foldamere wurde eine an die Synthese von Aminosäuresequenzen angelehnte Methode entwickelt und erfolgreich angewandt. So konnten alle 48 Foldamere erfolgreich synthetisiert und 46 von ihnen in ausreichenden Mengen für die Untersuchung an IL-4 gereinigt werden. Leider liegen für diese Bibliothek bisher keine abschließenden Ergebnisse über die Inhibitionseigenschaften gegenüber IL-4 vor. Strukturell sehr ähnliche Foldamere zeigten jedoch in ersten Experimenten eine Inhibition von IL-4 was eine Wirksamkeit der neu erstellten Bibliothek vermuten lässt.
Das vierte Projekt wurde im Rahmen des SFB 630 durchgeführt. Hierzu wurden einige der ursprünglich für andere Projekte hergestellten Foldamere ausgewählt, teilweise entschützt bzw. an der Nitrogruppe reduziert und anschließend auf Ihre Aktivität gegen Leishmanien und Trypanosomen getestet. Es zeigte sich, dass das verwendete Substitutionsmuster, in den gestesteten Konzentrationen nicht gegen Leishmanien und Trypanosomen wirksam ist. Es eignet sich also nicht für die Erstellung einer neuen Leitstruktur gegen diese beiden Erreger. Allerdings trat im untersuchten Konzentrationsbereich auch keine Zytotoxizität auf, was eine interessante Information für die Verwendung der Foldamere und ihrer Bausteine in biologischen Systemen darstellt.
Design of novel IL-4 antagonists employing site-specific chemical and biosynthetic glycosylation
(2021)
The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases.
For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R.
This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist.
For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability.
The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab.
Locoregional recurrence is a major reason for therapy failure after surgical resection of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). The physiological process of postoperative wound healing could potentially support the proliferation of remaining tumor cells. The aim of this study was to evaluate the influence of wound fluid (WF) on the cell cycle distribution and a potential induction of epithelial-mesenchymal transition (EMT). To verify this hypothesis, we incubated FaDu and HLaC78 cells with postoperative WF from patients after neck dissection. Cell viability in dependence of WF concentration and cisplatin was measured by flow cytometry. Cell cycle analysis was performed by flow cytometry and EMT-marker expression by rtPCR. WF showed high concentrations of interleukin (IL)-6, IL-8, IL-10, CCL2, MCP-1, EGF, angiogenin, and leptin. The cultivation of tumor cells with WF resulted in a significant increase in cell proliferation without affecting the cell cycle. In addition, there was a significant enhancement of the mesenchymal markers Snail 2 and vimentin, while the expression of the epithelial marker E-cadherin was significantly decreased. After cisplatin treatment, tumor cells incubated with WF showed a significantly higher resistance compared with the control group. The effect of cisplatin-resistance was dependent on the WF concentration. In summary, proinflammatory cytokines are predominantly found in WF. Furthermore, the results suggest that EMT can be induced by WF, which could be a possible mechanism for cisplatin resistance.