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Es wird angenommen, dass die invasiven Stadien parasitärer Helminthen zur Organfindung und zur Weiterentwicklung auf die Sensierung spezifischer Wirts-Signale angewiesen sind, wobei die molekulare Natur dieser Signale bislang weitgehend ungeklärt ist. Vorangegangene Untersuchungen am Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis, dem Erreger der alveolären Echinokokkose, hatten bereits ergeben, dass dessen Metacestoden-Larvenstadium zur Weiterentwicklung kleine, lösliche Wirtsmoleküle benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein axenisches (Wirtszell-freies) Kultursystem für das Metacestoden-Stadium entwickelt, mittels dessen sich diese Fragestellungen in vitro angehen lassen. Mit Hilfe dieses Kultursystems konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die drei Wirts-Hormone/Zytokine, Insulin, epidermal growth factor (EGF) und bone morphogeneic protein 2 (BMP2), einen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von E. multilocularis haben. Während für Insulin und EGF Wachstums-stimulierende Effekte gezeigt werden konnten, förderte BMP2 die Differenzierung des Metacestoden zum nächsten Larvenstadium, dem Protoscolex. In Modellorganismen wie Säugern, Drosophila und Caenorhabditis elegans verlaufen die durch Insulin- und EGF-ähnlichen Zytokine induzierten Signalmechanismen über die sogenannte mitogen activated protein (MAP)-Kinase-Kaskade. Um zu untersuchen, ob die externe Zugabe von Wirts-Insulin bzw. -EGF in einer Stimulierung der MAPK-Kaskade des Parasiten führt, wurden in dieser Arbeit zunächst die Komponenten dieses Signalweges bei E. multilocularis auf molekulargenetischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die Arbeiten umfassten Studien zu kleinen GTPasen des Parasiten (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal), zu einem Orthologen der Kinase Raf (EmRaf), sowie Orthologen der Kinasen MEK (EmMKK) und ERK (EmERK). Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in E. multilocularis Teil einer MAP-Kinase-Kaskade sind. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Faktoren stromabwärts eines EGF-Rezeptor-Orthologen (EmER) des Parasiten fungieren, welches ebenfalls in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Damit wurden die Voraussetzungen geschaffen, den Einfluss exogen zugegebenen Insulins bzw. EGFs auf die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade im Parasiten zu untersuchen. Erste Analysen zeigten bereits, dass die zentrale Komponente dieser Kaskade, EmERK, durch die genannten Wirts-Zytokine aktiviert wird. Dies legt nahe, dass Wirt-Parasit-Kommunikationsmechanismen über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen der alveolären Echinokokkose spielen. Aufbauend auf dem axenischen Kultursystem ist es in dieser Arbeit auch erstmals gelungen, Primärzellkulturen für E. multilocularis anzulegen und die Parasitenzellen zur in vitro Neubildung von Metacestoden-Vesikeln anzuregen. Erste Experimente zur genetischen Manipulation dieser Primärzellen konnten erfolgreich durchgeführt werden. Aufbauend auf der hier vorgestellten Methodik sollte es in künftigen Untersuchungen möglich sein, stabil transfizierte Echinococcus-Zellen zu generieren und diese zur Herstellung vollständig transgener Parasiten-Stadien zu nutzen. Dies würde die zur Untersuchung der E. multilocularis-Entwicklung und der Wirt-Parasit-Interaktionsmechanismen bei einer Infektion zur Verfügung stehenden Methoden entscheidend erweitern und könnte u.a. zur weiteren biochemischen Analyse der in dieser Arbeit dargestellten Signalmechanismen des Parasiten herangezogen werden.
Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a life-threatening disease with limited options of chemotherapeutic treatment. Anti-AE chemotherapy is currently based on a single class of drugs, the benzimidazoles. Although acting parasitocidic in vitro, benzimidazoles are merely parasitostatic during in vivo treatment of AE and cause severe site effects. In the case of operable lesions, the resection of parasite tissue needs to be supported by a prolonged chemotherapy. Thus, the current treatment options for AE are inadequate and require alternatives. In the present work, the flatworm signaling pathways were analyzed to establish potential targets for novel therapeutic approaches. I focused on factors that are involved in development and proliferation of E. multilocularis using molecular, biochemical and cell biological methods. Among the analysed factors were three MAP kinases of the parasite, EmMPK1, an Erk-1/2 orthologue, EmMPK2, a p38 orthologue and EmMPK3, an Erk7/8 orthologue. Further, I identified and characterized EmMKK2, a MEK1/2 orthologue of the parasite, which, together with the known kinases EmRaf and EmMPK1, forms an Erk1/2-like MAPK module. Moreover, I was able to demonstrate several influences of host growth factors such as EGF (epidermal growth factor) and insulin on worm signaling mechanisms and larval growth, including the phosphorylation of Elp, an ezrin-radixin-moesin like protein, EmMPK1, EmMPK3 and increased mitotic activity of Echinococcus cells. In addition, several substances were examined for their efficacy against the parasite including (i) general tyrosine kinase inhibitors (PP2, leflunamide), (ii) compounds designed to inhibit the activity of receptor tyrosine kinases, (iii) anti-neoplastic agents (miltefosine, perifosine), (iv) serine/threonine kinase inhibitors that have been designed to block the Erk1/2 MAPK cascade and (v) inhibitors of p38 MAPKs. In these studies, EmMPK2 proved to be a promising drug target for the following reasons. Amino acid sequence analysis disclosed several differences to human p38 MAPKs, which is likely to be the reason for the observed enhanced basal activity of recombinant EmMPK2 towards myelin basic protein in comparison to human recombinant p38 MAPK-α. In addition, the prominent auto-phosphorylation activity of the recombinant EmMPK2 protein together with the absence of an interaction with the Echinococcus MKKs suggest a different mechanism of regulation compared to the human enzyme. EmMPK2 activity could be effectively inhibited in vitro and in cultivated metacestode vesicles by treatment with SB202190 and ML3403, two ATP-competitive pyridinyl imidazole inhibitors of p38 MAPKs, in a concentration-dependent manner. Moreover, both compounds, in particular ML3403, caused parasite vesicle inactivation at concentrations which did not affect cultured mammalian cells. Likewise, during the cultivation of Echinococcus primary cells, the presence of ML3403 prevented the generation of new vesicles. Targeting members of the EGF signaling pathway, particulary of the Erk1/2-like MAPK cascade, with Raf and MEK inhibitors prevented the phosphorylation of EmMPK1 in metacestodes cultivated in vitro. However, although parasite growth was prevented under these conditions, the structural integrity of the metacestode vesicles maintained during long-term cultivation in the presence of the MAPK cascade inhibitors. Similar results were obtained when studying the effects of other drugs mentioned above. Taken together, several targets could be identified that reacted with high sensitivity to the presence of inhibitory substances, but did not cause the parasite’s death with one exception, the pyridinyl imidazoles. Based on the presented data, I suggest pyridinyl imidazoles as a novel class of anti-Echinococcus drugs and imply EmMPK2 as survival signal mediating factor, the inhibition of which could be used for the treatment of AE.
Protein kinases as targets for the development of novel drugs against alveolar echinococcosis
(2015)
The metacestode larval stage of the fox tapeworm Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), one of the most lethal zoonosis of the northern hemisphere. The development of metacestode vesicles by asexual multiplication and the almost unrestricted infiltrative growth within the host organs is ensured from a population of undifferentiated, proliferative cells, so-called germinative cells. AE treatment options include surgery, if possible, as well as Benzimidazole-based chemotherapy (BZ). Given that the cellular targets of BZs, the -tubulins, are highly conserved between cestodes and humans, the chemotherapy is associated with considerable side-effects. Therefore, BZ can only be applied in parasitostatic doses and has to be given lifelong. Furthermore, the current anti-AE chemotherapy is ineffective in eliminating the germinative cell population of the parasite, which leads to remission of parasite growth as soon as therapy is discontinued.
This work focuses on protein kinases involved in the proliferation and development of the parasite with the intention of developing novel anti-AE therapies. Polo-like kinases (Plks) are important regulators of the eukaryotic cell cycle and are involved in the regulation and formation of the mitotic spindles during the M-phase of the cell cycle. Plks have already been shown to be associated with deregulated cellular growth in human cancers and have been investigated as novel drug targets in the flatworm parasite Schistosoma mansoni. In the first part of this work, the characterisation of a novel and druggable parasite enzyme, EmPlk1, which is homologous to the polo-like kinase 1 (Plk1) of humans and S. mansoni (SmPlk1), is presented. Through in situ hybridisation, it could be demonstrated that emplk1 is specifically expressed in the Echinococcus germinative cells. Upon heterologous expression in the Xenopus oocyte system, EmPlk1 induced germinal vesicle breakdown, thus indicating that it is an active kinase. Furthermore, BI 2536, a compound originally designed to inhibit the human ortholog of EmPlk1, inhibited the EmPlk1 activity at a concentration of 25 nM. In vitro treatment of parasite vesicles with similar concentrations of BI 2536 led to the elimination of the germinative cells from Echinococcus larvae, thus preventing the growth and further development of the parasite. In in vitro cultivation systems for parasite primary cells, BI 2536 effectively inhibited the formation of new metacestode vesicles from germinative cells. Thus, BI 2536 has profound anti-parasitic activities in vitro at concentrations well within the range of plasma levels measured after the administration of safe dosages to patients (50 nM after 24 h). This implies that EmPlk1 is a promising new drug target for the development of novel anti-AE drugs that would specifically affect the parasite’s stem cell population, namely the only parasite cells capable of proliferation. In addition to the chemotherapeutic aspects of this work, the inhibitor BI 2536 could be further used to study the function of stem cells in this model organism, utilising a method of injection of parasite stem cells into metacestode vesicles, for instance, as has been developed in this work.
In the second part of this work, a novel receptor tyrosine kinase, the Venus flytrap kinase receptor (EmVKR) of E. multilocularis has been characterised. Members of this class of single-pass transmembrane receptors have recently been discovered in the related trematode S. mansoni and are associated with the growth and differentiation of sporocyst germinal cells and ovocytes. The ortholog receptor in EmVKR is characterised by an unusual domain composition of an extracellular Venus flytrap module (VFT), which shows significant similarity to GABA receptors, such as the GABAB receptor (γ-amino butyric acid type B) and is linked through a single transmembrane domain to an intracellular tyrosine kinase domain with similarities to the kinase domains of human insulin receptors. Based upon the size (5112bp) of emvkr and nucleotide sequence specificities, efforts have been made to isolate the gene from cell culture samples to study the ligand for the activation of this receptor type in Xenopus oocytes. To date, this type of receptor has only been described in invertebrates, thus making it an attractive target for drug screening. In a first trial, the ATP competitive inhibitor AG 1024 was tested in our in vitro cell culture.
In conclusion, the EmVKR represents a novel receptor tyrosine kinase in E. multilocularis. Further efforts have to be made to identify the activating ligand of the receptor and its cellular function, which might strengthen the case for EmVKR as a potential drug target. The successful depletion of stem cells in the metacestode vesicle by the Plk1 inhibitor BI 2536 gives rise to optimising the chemical component for EmPlk1 as a new potential drug target. Furthermore, this inhibitor opens a new cell culture technique with high potential to study the cellular behaviour and influencing factors of stem cells in vitro.
Parasitic helminths share a large degree of common genetic heritage with their various hosts. This includes cell-cell-communication mechanisms mediated by small peptide cytokines and lipophilic/steroid hormones. These cytokines are candidate molecules for host-parasite cross-communication in helminth diseases. In this work the function of two evolutionary conserved signaling pathways in the model cestode Echinococcus multilocularis has been studied. First, signaling mechanisms mediated through fibroblast growth factors (FGF) and their cognate receptors (FGFR) which influence a multitude of biological functions, like homeostasis and differentiation, were studied. I herein investigated the role of EmFR which is the only FGFR homolog in E. multilocularis. Functional analyses using the Xenopus oocyte expression system clearly indicate that EmFR can sense both acidic and basic FGF of human origin, resulting in an activation of the EmFR tyrosine kinase domain. In vitro experiments demonstrate that mammalian FGF significantly stimulates proliferation and development of E. multilocularis metacestode vesicles and primary cells. Furthermore, DNA synthesis and the parasite’s Erk-like MAPK cascade module was stimulated in the presence of exogenously added mammalian FGF. By using the FGFR inhibitor BIBF1120 the activity of EmFR in the Xenopus oocyte system was effectively blocked. Addition of BIBF1120 to in vitro cultivated Echinococcus larval material led to detrimental effects concerning the generation of metacestode vesicles from parasite stem cells, the proliferation and survival of metacestode vesicles, and the dedifferentiation of protoscoleces towards the metacestode. In conclusion, these data demonstrate the presence of a functional EmFR-mediated signaling pathway in E. multilocularis that is able to interact with host-derived cytokines and that plays an important role in larval parasite development. Secondly, the role of nuclear hormone receptor (NHR) signaling was addressed. Lipophilic and steroid hormone signaling contributes to the regulation of metazoan development. By means of in silico analyses I demonstrate that E. multilocularis expresses a set of 17 NHRs that broadly overlaps with that of the related flatworms Schistosoma mansoni and S. japonicum, but also contains several NHR encoding genes that are unique to this parasite. One of these, EmNHR1, is homolog to the DAF-12/HR-96 subfamily of NHRs which regulate cholesterol homeostasis in metazoans. Modified yeast-two hybrid analyses revealed that host serum contains a ligand which induces homodimerization of the EmNHR1 ligand-binding domain. Also, a HNF4-like homolog, EmHNF4, was characterized. Human HNF4 plays an important role in liver development. RT-PCR experiments showed that both isoforms of the EmHNF4 encoding gene are expressed stage-dependently suggesting distinct functions of the two isoforms in the parasite. Moreover, specific regulatory mechanisms on the convergence of NHR signaling and TGF-β/BMP signaling pathways in E. multilocularis have been identified. On the one hand, EmNHR1 directly interacted with the EmSmadC and on the other hand EmHNF4b interacted with EmSmadD, EmSmadE which are all downstream signaling components of the TGF-β/BMP signaling pathway. This suggests cross-communication in order to regulate target gene expression. With these results, further studies on the role of NHR signaling in the cestode will be facilitated. Also, the first serum-free in vitro cultivation system for E. multilocularis was established using PanserinTM401 as medium. Serum-free co-cultivation with RH-feeder cells and an axenic cultivation method have been established. With the help of this serum-free cultivation system investigations on the role of specific peptide hormones, like FGFs, or lipophilic/steroid hormones, like cholesterol, for the development of helminths will be much easier.
Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine tödliche Infektionserkrankung, die durch den parasitären Plattwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird. Genomanalysen von E. multilocularis ergaben ein Gen, das laut Vorhersage für eine DyP-Typ Peroxidase codiere. Ziel dieser Arbeit ist die biologische Funktion des codierten Enzyms besser zu verstehen und Hinweise auf eine mögliche Rolle in der Abwehr von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu erlangen.
Das Gen wurde heterolog in E. Coli exprimiert und molekulare Charakteristika des Gens mit bioinformatischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Quantitative RT-PCR Untersuchungen gaben Aufschluss über das Transkriptprofil von emipox in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von E. mulitlocularis. Mittels Whole-Mount In Situ-Hybridisierung (WMISH) wurden die Transkripte zudem lokalisiert und ihre Beziehung zum Stammzellsystem von E. multilocularis näher untersucht.
Die Zugehörigkeit von EmIPOX zur Gruppe der DyP-Typ Peroxidasen wurde bestätigt. Homologe beim Menschen kommen nicht vor. Es konnte nachgewiesen werden, dass Transkripte von emipox auch, aber keinesfalls ausschließlich, in Stammzellen vorliegen. Überdurchschnittlich viele Transkripte liegen im aktivierten Protoscolex und im Metacestoden ex vivo aus einer infizierten Wirtsleber vor. Untersuchungen zur Enzymaktivität von EmIPOX zeigten neben einer Peroxidase- auch eine Katalaseaktivität.
Die vorliegende Arbeit ist die erste Charakterisierung einer DyP-Typ Peroxidase bei Tieren. Sie legt nahe, dass EmIPOX eine Rolle in der Entgiftung von ROS in E. multilocularis spielt und stellt den Charakter von EmIPOX als potenzieller pharmakologischer Zielstruktur heraus.
Die alveoläre Echinokokkose (AE), verursacht durch das Metacestoden- Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), ist eine lebensbedrohliche Zoonose der nördlichen Hemisphäre mit eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten. Bei der Suche nach neuen Therapeutika haben Mitogen-activated Proteinkinase (MAPK) -Kaskaden als pharmakologische Zielstrukturen aufgrund ihrer essentiellen Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung ein großes Potenzial. In der vorliegenden Arbeit wurden durch BLAST- und reziproke BLAST-Analysen elf potenzielle MAPK Kinase Kinasen (MAP3K), fünf potenzielle MAPK Kinasen (MAP2K) und sechs potenzielle MAPK im E. multilocularis-Genom identifiziert, die teils hoch konserviert sind und in nahezu allen Entwicklungsstadien des Parasiten exprimiert werden. Diese Erkenntnisse lassen auf ein komplexes MAPK-Signaltransduktions- system in E. multilocularis mit großer Bedeutung für den Parasiten schließen. Transkriptomdatenanalysen und Whole Mount in Situ Hybridisierung (WMISH) zeigten, dass emmkkk1 (EmuJ_000389600) als einzige MAP3K neben der Expression in postmitotischen Zellen in besonderem Maße in proliferativen Stammzellen des Parasiten exprimiert wird und somit eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen spielen könnte. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) -Wechselwirkungsassays wurden Interaktionen von mehreren upstream- (EmGRB2) und downstream- wirkenden Signalkaskadekomponenten des JNK (EmMKK3, EmMPK3) und ERK (EmMKK3, EmMPK4) -Signalwegs gefunden. Daraus lässt sich schließen, dass EmMKKK1, analog zu seinem humanen Homolog HsM3K1, eine zentrale Rolle bei der Echinococcus-Wachstumsregulation durch Rezeptortyrosinkinasen und vielfältige weitere Funktionen im Parasiten besitzt. Anhand von Erkenntnissen an Platyhelminthes kann daher von einem großen Potenzial dieser neu charakterisierten Signalwege als chemotherapeutische Angriffspunkte ausgegangen werden, wenngleich erste RNA-Interferenz (RNAi)- und Inhibitorstudien an emmkkk1, emmpk1 und emmpk4 keine durchschlagenden Effekte auf das Überleben von Primärzellkulturen und die Bildung von Metacestodenvesikeln zeigten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit EmMKKK1 und neuen ERK- und JNK-Signalwegen zentrale Komponenten der komplexen MAPK-Signalkaskaden in E. multilocularis identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich einen großen Beitrag zur enormen Regenerationsfähigkeit der Echinococcus-Stammzellen leisten und vom Wirt abgeleitete Signale wie Insulin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) über EmGRB2 in Proliferationsnetzwerke des Parasiten integrieren. Arzneimittel-Screening-Assays, die auf diese Signalwege abzielen, könnten daher zu alternativen Arzneimitteln führen, die alleine oder in Kombination mit einer bestehenden Chemotherapie (Benzimidazol) die Prognose von für AE-Patienten verbessern könnten.
Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet.
Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt.
Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen.
Alveolar and cystic echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis and Echinococcus
granulosus respectively, are severe zoonotic diseases with limited treatment
options. The sole curative treatment is the surgical removal of the complete parasite
material. Due to late diagnosis, chemotherapeutic treatment often is the only treatment
option. Treatment is based on benzimidazoles, which merely act parasitostatic
and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs are urgently
needed.
Evolutionarily conserved signalling pathways are known to be involved in hostparasite
cross-communication, parasite development and survival. Moreover, they
represent potential targets for chemotherapeutic drugs. In this context the roles of
the serotonin- and cAMP-signalling pathways in Echinococcus were studied.
Genes encoding serotonin receptors, a serotonin transporter and enzymes involved in
serotonin biosynthesis could be identified in the E. multilocularis and E. granulosus
genomes indicating that these parasites are capable of synthesizing and perceiving
serotonin signals. Also the influence of exogenous serotonin on parasite development
was studied. Serotonin significantly increased metacestode vesicle formation
from primary cells and re-differentiation of protoscoleces. Inhibition of serotonin
transport with citalopram significantly reduced metacestode vesicle formation from
primary cells and caused death of protoscoleces and metacestodes. Furthermore, it
could be shown that serotonin increased phosphorylation of protein kinase A substrates.
Taken together, these results show that serotonin and serotonin transport
are essential for Echinococcus development and survival. Consequently, components
of the serotonin pathway represent potential drug targets.
In this work the cAMP-signalling pathway was researched with focus on G-protein
coupled receptors and adenylate cyclases. 76 G-protein coupled receptors, including
members of all major families were identified in the E. multilocularis genome.
Four genes homologous to adenylate cyclase IX were identified in the E. multilocularis
genome and three in the E. granulosus genome. While glucagon caused
no significant effects, the adenylate cyclase activator forskolin and the adenylate
cyclase inhibitor 2’, 5’ didesoxyadenosine influenced metacestode vesicle formation
from primary cells, re-differentiation of protoscoleces and survival of metacestodes.
It was further shown that forskolin increases phosphorylation of protein kinase A
substrates, indicating that forskolin activates the cAMP-pathway also in cestodes.
These results indicate that the cAMP signalling pathway plays an important role in
Echinococcus development and survival.
To complement this work, the influence of different media and additives on E. granulosus protoscoleces was investigated. Anaerobic conditions and the presence of FBS
prolonged protoscolex survival while different media influenced protoscolex activation
and development.
Taken together, this work provided important insights into developmental processes
in Echinococcus and potential drug targets for echinococcosis chemotherapy.
Alveolar echinococcosis (AE), a severe and life-threatening disease is caused by the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis. Currently, the options of chemotherapeutic treatment are very limited and are based on benzimidazole compounds, which act merely parasitostatic in vivo and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs and targets are urgently needed. In the present work the role of two evolutionarily conserved signalling pathways in E. multilocularis, namely the insulin signalling cascade and Abl kinases, has been studied in regard to host-parasite interaction and the possible use in anti-AE chemotherapy.