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Das Phänomen der adulten Neurogenese existiert auch bei Säugetieren während der gesamten Ontogenese. In den letzten Jahren wurden viele physiologische und pathologische Faktoren bestimmt, die einen Einfluss auf die adulte Neurogenese haben. Ein bedeutender Einfluss auf die adulte Neurogenese übt dabei der 5-HT-Spiegel aus. 5-HT reguliert nicht nur während der embryonalen Entwicklung die Zellproliferation, Migration und Differenzierung, sondern ist auch ein wichtiger Faktor bei der adulten Neurogenese. Dabei wirkt 5-HT über den 5-HT1A-Rezeptor positiv auf die Stammzellproliferation und die adulte Neurogenese. Durch eine Therapie mit Antidepressiva kommt es ebenfalls zu einer 5-HT-Erhöhung im Extrazellularraum, dessen anregende Wirkung auf die Proliferation adulter Stammzellen im Gehirn nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus spielt 5-HT auch eine große Rolle bei neurophysiologischen Vorgängen im ZNS, die im Zusammenhang mit Emotionen, Lernen und Motorik stehen. Eine wichtige Grundlage der Depressionsforschung ist die Monoamin-Mangel-Hypothese, welche niedrige 5-HT-Spiegel als Ursache der Depression ansieht. In dieser Arbeit sollte der Einfluss eines existenten lebenslang erhöhten extrazellulären 5-HT-Spiegel auf die Neurogenese und vor allem auf die Differenzierungsrichtung neu gebildeter Zellen untersucht werden. Als Modell wurde eine transgene Mauslinie verwendet, bei der durch Knockout des 5-HTT ein permanent erhöhter extrazellulärer 5-HT-Spiegel vorliegt. Die Stammzellproliferation konnte eindeutig durch eine Markierung sich teilender Zellen mit BrdU nachgewiesen werden. Kolokalisationsstudien mit Hilfe von Immunofluoreszenzfärbungen und der anschließenden Darstellung mit dem Konfokalen Lasermikroskop konnten die Neubildung von Neuronen und Gliazellen und deren Migration an ihren funktionellen Ort darstellen. Es konnte kein signifikanter Unterschied in der Anzahl von im Hippocampus neu gebildeten Neuronen und Astrozyten zwischen Wildtyp- und 5-HTT-KO-Mäusen nachgewiesen werden. Auch die Lokalisation der neu entstandenen und 48 Tage nach BrdU-Applikation nachgewiesenen Zellen war bei den Wildtyp- und 5-HTT-KO-Tieren annähernd gleich. Die überwiegende Zahl mit 70% befand sich in der SGZ, 10 - 15% waren in der KZS lokalisiert und ein kleiner Teil befand sich im Hilus. Wir sind erst am Anfang des Verständnisses der exakten molekularen Mechanismen in der neuroendokrinen Interaktion zwischen Neuronen und deren Transmitter, vor allem dem an zentraler Stelle stehenden 5-HT. Neue Techniken, die nicht nur die morphologische, sondern auch die funktionelle Darstellung der neuronalen und neurophysiologische Tätigkeit liefern, werden in Zukunft neue Erkenntnisse bringen.
Zusammenfassung Im Zuge der Säugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gewährleistet. Während der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, während der adulte Körper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterhält. Als kennzeichnend für die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tatsächlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschränkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine hämatopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Präimplantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich präferentiell in den fötalen hämatopoetischen Geweben befinden. Für humane hämatopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese hämatopoetische Vorläufer in hämatopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chimärer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und hämatopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen lässt sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der frühen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden können. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegenüber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab.
For the differentiation of a embryonic stem cells (ESCs) to neuronal cells (NCs) a complex and coordinated gene regulation program is needed. One important control element for neuronal differentiation is the repressor element 1 silencing transcription factor (REST) complex, which represses neuronal gene expression in non-neuronal cells. Crucial effector proteins of the REST complex are small phosphatases such as the CTDSPs (C-terminal domain small phosphatases) that regulate polymerase II activity by dephosphorylating the C-terminal domain of the polymerase, thereby repressing target genes. The stepwise inactivation of REST, including the CTDSPs, leads to the induction of a neuron-specific gene program, which ultimately induces the formation of neurons. The spatio-temporal control of REST and its effector components is therefore a crucial step for neurogenesis.
In zebrafish it was shown that the REST-associated CTDSP2 is negatively regulated by the micro RNA (miR) -26b. Interestingly, the miR-26b is encoded in an intron of the primary transcript of CTDSP2. This gives the fundament of an intrinsic regulatory negative feedback loop, which is essential for the proceeding of neurogenesis. This feedback loop is active during neurogenesis, but inactive in non-neuronal cells. The reason for this is that the maturation of the precursor miR (pre-miR) to the mature miR-26 is arrested in non neuronal cells, but not in neurons. As only mature miRs are actively repressing genes, the regulation of miR-26 processing is an essential step in neurogenesis.
In this study, the molecular basis of miR-26 processing regulation in the context of neurogenesis was addressed. The mature miR is processed from two larger precursors: First the primary transcript is cleaved by the enzyme DROSHA in the nucleus to form the pre-miR. The pre-miR is exported from the nucleus and processed further through the enzyme DICER to yield the mature miR. The mature miR can regulate gene expression in association with the RNA-induced silencing complex (RISC).
Multiple different scenarios in which miR processing was regulated were proposed and experimentally tested. Microinjection studies using Xenopus leavis oocytes showed that slowdown or blockage of the nucleo-cytoplasmic transport are not the reason for delayed pre-miR-26 processing. Moreover, in vitro and in vivo miR-processing assays showed that maturation is most likely regulated through a in trans acting factor, which blocks processing in non neuronal cells.
Through RNA affinity chromatographic assays using zebrafish and murine lysates I was able to isolate and identify proteins that interact specifically with pre-miR-26 and could by this influence its biogenesis. Potential candidates are FMRP/FXR1/2, ZNF346 and Eral1, whose functional characterisation in the context of miR-biogenesis could now be addressed.
The second part of my thesis was executed in close colaboration with the laboratory of Prof. Albrecht Müller. The principal question was addressed how miR-26 influences neuronal gene expression and which genes are primarily affected. This research question could be addressed by using a cell culture model system, which mimics ex vivo the differentiation of ESCs to NCs via neuronal progenitor.
For the functional analysis of miR-26 knock out cell lines were generated by the CRISPR/Cas9 technology. miR-26 deficient ESC keep their pluripotent state and are able to develop NPC, but show major impairment in differentiating to NCs. Through RNA deep sequencing the miR-26 induced transcriptome differences could be analysed.
On the level of mRNAs it could be shown, that the expression of neuronal gene is downregulated in miR-26 deficient NCs. Interestingly, the deletion of miR-26 leads to selectively decreased levels of miRs, which on one hand regulate the REST complex and on the other hand are under transcriptional control by REST themself. This data and the discovery that induction of miR-26 leads to enrichment of other REST regulating miRs indicates that miR-26 initiates neurogenesis through stepwise inactivation of the REST complex.
Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Veränderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgeklärt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus Mäuse-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse überprüft und für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert bestätigt und durch in situ Hybridisierung ganzer Mäuseembryonen und Paraffinschnitte näher untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression während der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage für funktionelle Studien dieser erst kürzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. Während C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorläufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, später aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie für ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der Nähe des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Darüber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet für: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegenüber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie veränderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Darüber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster häufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-Mäusen für die Somitogenese ansatzweise bestätigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten für neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung.