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In dieser Arbeit ist die Synthese von funktionalisiertem Nanodiamant mit bioaktiven Substanzen, welche vor allem als Wirkstofftransporter eingesetzt werden sollen, beschrieben. Dazu werden zum einen bereits bekannte Anbindungsmöglichkeiten an Nanodiamant, wie zum Beispiel die Klick-Reaktion, sowie die Ausbildung von Amidbrücken verwendet. Zum anderen werden neuartige Funktionalisierungsmöglichkeiten wie Protein Ligation und Thioharnstoffbrücken verwendet und somit das Repertoire an bekannten Anbindungsreaktion erweitert.
Des weiteren wurde ein multifunktionales Nanodiamantsystem synthetisiert. Dieses ist in der Lage, zwei verschiedene Moleküle auf einem Partikel zu immobilisieren. Die verwendeten Methoden ermöglichen die Anbindung verschiedener Substanzen aus unterschiedlichen Molekülgruppen an Nanodiamanten und sind somit universell einsetzbar.
The aim of this thesis was the application of the functional prepolymer NCO-sP(EO-stat-PO) for the development of new biomaterials. First, the influence of the star-shaped polymers on the mechanical properties of biocements and bone adhesives was investigated. 3-armed star-shaped macromers were used as an additive for a mineral bone cement, and the influence on the mechanical properties was studied. Additionally, a previously developed bone adhesive was examined regarding cytocompatibility. The second topic was the examination of novel functionalization steps which were performed on the surface of electrospun fibers modified with NCO-sP(EO-stat-PO). This established method of functionalizing electrospun meshes was advanced regarding the modification with proteins which was then demonstrated in a biological application. Two different kinds of antibodies were immobilized on the fiber surface in a consecutive manner and the influence of these proteins on the cell behavior was investigated. The final topic involved the quantification of surface-bound peptide sequences. By functionalization of the peptides with the UV-reactive molecule 2-mercaptopyridine it was possible to quantify this compound via UV measurements by cleavage of disulfide bridges and indirectly draw conclusions about the number of immobilized peptides.
In the field of mineral biocements and bone adhesives, NCO-sP(EO-stat-PO) was able to influence the setting behavior and mechanical performance of mineral bone cements based on calcium phosphate chemistry. The addition of NCO-sP(EO-stat-PO) resulted in a pseudo-ductile fracture behavior due to the formation of a hydrogel network in the cement, which was then mineralized by nanosized hydroxyapatite crystals following cement setting. Accordingly, a commercially available aluminum silicate cement from civil engineering could be modified.
In addition, it could be shown that the use of NCO-sP(EO-stat-PO) is beneficial for adjusting specific material properties of bone adhesives. Here, the crosslinking behavior of the prepolymer in an aqueous medium was exploited to form an interpenetrating network (IPN) together with a photochemically curing poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDMA) matrix. This could be used for the development of a bone adhesive with an improved adhesion to bone in a wet environment. The developed bone adhesive was further investigated in terms of possible influences of the initiator systems. In addition, the material system was tested for cytocompatibility by using different cell lines.
Moreover, the preparation of electrospun fiber meshes via solution electrospinning consisting of poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) as a backbone polymer and NCO-sP(EO-stat-PO) as functional additive is an established method for the application of the meshes as a replacement of the native extracellular matrix (ECM). In general, these fibers reveal diameters in the nanometer range, are protein and cell repellent due to the hydrophilic properties of the prepolymer and show a specific biofunctionalization by immobilization of peptide sequences. Here, the isocyanate groups presented on the fiber surface after electrospinning were used to carry out various functionalization steps, while retaining the properties of protein and cell repellency. The modification of the electrospun fibers involved the immobilization of analogs or antagonists of tumor necrosis factor (TNF) and the indirect detection of these by interaction with a light-producing enzyme. Here, a multimodal modification of the fiber surface with RGD to mediate cell adhesion and two different antibodies could be achieved. After culturing the cell line HT1080, the pro- or anti-inflammatory response of cells could be detected by IL-8 specific ELISA measurements.
Furthermore, the quantification of molecules on the surface of electrospun fibers was investigated. It was tested whether the detection by means of super-resolution microscopy would be possible. Therefore, experiments were performed with short amino acid sequences such as RGD for quantification by fluorescence microscopy. Based on earlier results, in which a UV-spectrometrically active molecule was used to detect the quantification of RGD, it was shown that short peptides can also be quantified in a small scale on flat functional substrates (2D) such as NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogel coatings, and modified electrospun fibers produced from PLGA and NCO-sP(EO-stat-PO) (3D). In addition, a collagen sequence was used to prove that a successful quantification can be carried out as well for longer peptide chains.
These studies have revealed that NCO-sP(EO-stat-PO) can serve as a functional additive for many applications and should be considered for further studies on the development of novel biomaterials. The rapid crosslinking reaction, the resulting hydrogel formation and the biocompatibility are to be mentioned as positive properties, which makes the prepolymer interesting for future applications.
In dieser Arbeit wurde die Erstfunktionalisierung des Diamanten durch die Diels-Alder-Reaktion realisiert und anschließend ein Thiol als weiterführende Bindungsstelle etabliert. Die Thiolfunktion konnte in einer radikalischen Reaktion mit einem terminalen Alken umgesetzt werden. Als Reaktionspartner wurde ein Allylglucosid synthetisiert und mit Hilfe eines Radikalstarters an den Diamanten gebunden. Für nicht-radikalische Verknüpfungsreaktionen eines vorfunktionalisierten Diamanten mit dem Zielmolekül konnte die Diazoniumsalz-Methode genutzt werden. Die Wahl der 4 Aminobenzoesäure als Edukt der Reaktion erlaubte in einer einstufigen Reaktion die Einführung einer Carbonsäuregruppe auf der Oberfläche. Durch Umsetzung mit einem Amin (Mannosecluster) konnte eine stabile Amidbindung erzeugt werden. Die erhaltenen Saccharid-Diamant-Konjugate wurden anschließend auf deren Inhibitionsvermögen gegenüber Escherichia coli getestet. Um eine Erweiterung der Methoden zur stabilen Erstfunktionalisierung der Diamantoberfläche zu erreichen, wurde untersucht ob die aus der Fulleren-Chemie bekannte Bingel-Hirsch-Reaktion auf Nanodiamant übertragbar ist. Für die Untersuchungen am Diamanten wurden unterschiedliche Malonsäurederivate eingesetzt, welche signifikante Banden im Infrarotspektrum besitzen, um eine eindeutige Funktionalisierung nachweisen zu können.
Für Diamantpartikel basiert diese Funktionalisierungschemie auf den bereits vorhanden Oberflächengruppen, die durch die Synthese und Reinigung entstanden sind. Die stabilste Anbindung wäre eine C-C-Verknüpfung der Diamantatome auf der Oberfläche mit den organischen Reagenzien. Um diese Verknüpfung zu erreichen, wurde die Oberfläche mittels Diels-Alder-Reaktion funktionalisiert. Grundvoraussetzung hierfür ist eine Oberfläche, die über eine ausreichende Menge an C=C-Doppelbindungen verfügt. Dies wurde durch eine thermische Behandlung erreicht. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass ab einer Behandlungstemperatur von 750 °C keine funktionellen Gruppen durch die eingesetzten Analysemethoden mehr nachgewiesen werden können. Die Elementaranalyse der einzelnen Proben zeigt einen deutlichen Anstieg des Kohlenstoffgehaltes. Nach erfolgreicher thermischer Behandlung des Diamanten wurde durch die Verwendung von Cyclopentadien und Anthracen als Dien gezeigt, dass eine Funktionalisierung über eine Diels-Alder-Reaktion generell möglich ist. Daher wurde als alternatives Dien ein o-Chinodimethan eingesetzt. Hierzu wurde eine systematische Untersuchung der Umsetzung der unterschiedlichen thermisch behandelten Proben mit α,α’-Dibrom-o-xylol durchgeführt. Hierdurch wurde gezeigt, dass der Ausgangsdiamant bei mindestens 750 °C behandelt werden muss, um eine messbare Oberflächenbelegung zu erhalten. Im Anschluss wurde die Funktionalisierbarkeit der eingeführten Arylgruppen überprüft. Durch die Einführung unterschiedlicher funktioneller Gruppen ist es dann möglich, Moleküle für spezielle Anwendungen anzubinden. Durch die Anwendung der klassischen Aromatenchemie war es möglich, die aromatischen Oberflächen zu nitrieren und sulfonieren. Die Sulfonsäuregruppe konnte partiell zum Thiol reduziert werden. Durch Umsetzung dieser Thiolgruppen war es möglich, einen mannosemodifizierten sowie einen farbstoffmodifizierten Diamanten herzustellen. Da die nachträgliche Einführung von Carboxylgruppen mit hohem synthetischem Aufwand verbunden ist, wurde alternativ ein carboxyltragender Vorläufer mit dem thermisch behandelten Diamant umgesetzt. Hierbei wurde eine Oberflächenbelegung von ca. 0.8 mmol g-1 erreicht (Ausgangsdiamant thermisch behandelt bei 750 °C). Im Anschluss wurde die Säuregruppe mit einem einfach geschützten Diamin weiterfunktionalisiert. Hierbei wurden unterschiedliche Methoden zur Amidbildung getestet. Als effektivste Methode stellte sich die Synthese über ein Säurechlorid heraus. Infolgedessen war eine weitgehende Umsetzung (ca. 94 - 88 %) der Säuregruppe möglich. Eine weitere wichtige funktionelle Gruppe für die Anbindung größerer Einheiten stellen die Amine dar. Diese lassen sich einfach darstellen, z. B. durch Reduktion von Cyanogruppen. Daher wurde 2,3-Bis-(brommethyl)-5,6-dicyanopyrazin als Edukt für die Funktionalisierung eingesetzt. Nach anschließender Reduktion der Cyanogruppen wurden primäre Amine erhalten. Die so erzeugte Aminogruppe wurde mit Biotin weiter funktionalisiert. Die bisher eingesetzten o-Chinodimethane sind ausschließlich durch 1,4-Eliminierung zugänglich. Eine sinnvolle Alternative zu diesem Vorläufer ist die Verwendung eines Cyclobutenderivates. Der Vorteil liegt in einer einfacheren Reinigung des Produktdiamanten. Als Testverbindung wurde 2,4-Bis-(methylsulfonyl)-5,6-dihydro-cyclobuta-[d]-pyrimidin verwendet. Nach erfolgreicher Umsetzung mit dem Diamanten wurden die Thioethergruppen in Sulfone überführt und in 2-Position wurde das Sulfon gegen eine Aminogruppe ausgetauscht. Neben den durchgeführten Funktionalisierungsreaktionen wurde eine nasschemische Nachweismethode zur Quantifizierung von primären Aminen entwickelt. Ein Vorteil des Verfahrens ist, dass der Nachweis auf einfache Weise durchführbar ist und nur 1 – 2 mg Diamantprobe nötig sind. Die gewonnen Ergebnisse zeigen, dass durch den Nachweis verlässliche Angaben über die genaue Aminmenge erhalten werden.
In dieser Dissertation wird beschrieben, wie es durch systematische Anwendung unterschiedlicher Methoden zur Herstellung und Modifizierung von Diamant gezielt und verlässlich möglich ist, die Eigenschaften von Diamanten zu beeinflussen. Es wird gezeigt, wie durch Variation der Parameter bei dem Wachstum von Diamant Einfluss auf dessen Morphologie und Eigenschaften genommen werden kann. Des Weiteren wird ein Verfahren vorgestellt, mit dem die Oberfläche des Diamanten durch Ozon effizient oxidiert beziehungsweise reduziert werden kann. Um diese veränderte Oberflächenbelegung möglichst genau zu analysieren, wird im letzten Teil der Dissertation eine Methode zur qualitativen und quantitativen Analytik der Oberflächen von Kohlenstoffnanomaterialien beschrieben.
In dieser Arbeit wurde die Kupfer(I)-katalysierte Cycloaddition von Alkinen und Aziden ("Click-Chemie") als effiziente, vielseitige und milde Reaktion für die Funktionalisierung von Nanodiamantpartikeln etabliert. Es wurden verschiedene Alkin- oder Azid-funktionalisierte Nanodiamantsysteme hergestellt und deren Reaktivität in Click-Reaktionen anhand vielfältiger Beispiele demonstriert. Hierzu wurden neben einfachen Testverbindungen auch komplexere Substanzen (z. B. ein Mannose-Derivat, Polytriazole, Fluoreszenzfarbstoffe, ein Thiazolium-Organokatalysator) durch Triazolsynthese immobilisiert. Zusätzlich wurde eine Methode entwickelt, die die Herstellung funktionalisierter und vollständig dispergierter Nanodiamant-Primärteilchen ermöglicht, wobei gezeigt wurde, dass dieser Weg auch für die Funktionalisierung durch Click-Chemie geeignet ist. Die Analyse der Nanodiamantpartikel erfolgte u. a. durch FT-IR, TGA, Elementaranalyse, Partikelgrößen- und Zetapotentialbestimmung, NMR, HR-TEM, UV / Vis sowie Fluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie.
Einzelstrang-DNA-dispergierte und individualisierte (6,5)-chirale Kohlenstoffnanoröhren bilden als Konjugatsystem den Ausgangspunkt dieser Dissertation. Im Vordergrund stehen dabei Untersuchungen zur Biokompatibilität dieser ssDNA-SWNT-Konjugate sowie deren Verhalten nach Zellpenetration und eine Funktionalisierbarkeit zum Wirkstofftransportsystem. Das erste Projekt widmet sich in Kapitel 4 dem Studium der Konjugatstabilität unter physiologischen Bedingungen und einer Verträglichkeit gegenüber zellulären Systemen. Experimente zur Biokompatibilität werden erstmals an Nanorohrkonjugaten durchgeführt, welche nach Ultrazentrifugation im Dichtegradienten sorgfältig individualisiert vorliegen. Die umgebungssensitiven photophysikalischen Charakteristika vereinzelter (6,5)-SWNTs können zu einer Beurteilung der Konjugatintegrität in physiologischem Milieu genutzt werden. Die Stabilität von ssDNA-SWNT-Strukturen wird in Anwesenheit des Restriktionsenzyms DNase I und dem in Zellnährmedien enthaltenen protein- und nukleasereichem Serum FBS auf die Probe gestellt. In beiden Fällen kann eine ausreichende ssDNA-SWNT-Integrität attestiert werden, die eine Verwendung unter Zellkultivierungsbedingungen erlaubt. Unter Berücksichtigung verschiedener in Zellen vorliegender pH-Umgebungen werden die Konjugate ebenfalls dieser Variation ausgesetzt. Bei Vorliegen stark saurer und basischer pH-Werte kann die Integrität von ssDNA-SWNT-Konjugaten nicht gewährleistet werden, was sich durch Aggregation bemerkbar macht. Innerhalb des breiten pH-Bereichs zwischen den Werten 3 und 11 hingegen kann eine gute Stabilität bestätigt werden. Für zelluläre Anwendungen bedeutet dieser Befund keine Einschränkung, da in Kulturen lediglich neutrale bis schwach saure pH-Werte oberhalb von 4.5 zu finden sind. Nachdem die Biostabilität der ssDNA-SWNT-Konjugate gewährleistet ist, kann in Zytotoxizitätsstudien eine ex vivo-Verträglichkeit des Nanomaterials getestet werden. Erste Untersuchungen mit der Mausmakrophagenlinie J774.1 weisen wie auch ausführliche Studien gegenüber menschlichen Epithelzellen HeLa auf eine uneingeschränkte Kompatibilität in den eingesetzten Konzentrationen hin. HeLa-Zellen, die mit DGU-gereinigten Nanorohrproben behandelt werden, zeigen eine geringfügig höhere Vitalität als nach Inkubation mit einer Rohdispersion undefinierter SWNT-Bündel. Im Gesamtbild ergibt sich somit eine zufriedenstellende Biokompatibilität individualisierter ssDNA-SWNT-Konjugate, womit das in dieser Arbeit zentrale Kohlenstoffnanorohrsystem den Anforderungen für dessen biomedizinische Verwendbarkeit gerecht wird. Der Schwerpunkt weiterer Untersuchungen liegt im zweiten Projekt aus Kapitel 5 auf dem Verhalten von ssDNA-SWNT-Konjugaten nach deren Aufnahme in HeLa-Zellen. Auch hier kann die starke Sensitivität der optischen Eigenschaften individualisierter (6,5)-Kohlenstoffnanoröhren gegenüber Umgebungseinflüssen genutzt werden, um Veränderungen im Emissionsverhalten von SWNTs nach deren zellulärer Aufnahme gegenüber dem Ausgangszustand zu beobachten. Nach ausführlicher Weißlicht-, Fluoreszenz- und SWNT-Photolumineszenzmikroskopie, aus deren Resultaten eine erfolgreiche Internalisierung von ssDNA-SWNTs in HeLa-Zellen eindeutig hervorgeht, stehen PL-spektroskopische Untersuchungen der Kohlenstoffnanoröhren im Vordergrund. Durch einen Vergleich des Emissionsverhaltens der ssDNA-SWNT-Konjugate in und außerhalb von Zellen können spektrale Verschiebungen, Linienverbreiterungen und verkürzte Fluoreszenzlebensdauern nach zellulärer Aufnahme festgestellt werden. Sowohl eine Aggregation von SWNTs als auch eine Beeinflussung durch die pH-Umgebung reichen nicht für eine vollständige Erklärung des Befunds aus. Vielmehr kann die in endosomalen Kompartimenten durch das Größenverhältnis von Endosomen zu SWNTs entstehende räumliche Nähe einer großen Nanorohrmenge untereinander als Ursache für eine Veränderung der dielektrischen Umgebung und folglich des Emissionsverhaltens betrachtet werden. Durch Verwendung der Kohlenstoffnanoröhren als Marker und Sensor können ssDNA-SWNT-Konjugate in Zellen somit nicht nur lokalisiert, sondern darüber hinaus hinsichtlich einer möglichen Aggregation untersucht werden. Aus den in dieser Arbeit vorgestellten Daten kann zwar eine vollständige Aggregation der SWNTs durch deren Aufnahme in Zellen ausgeschlossen werden, sie muss jedoch in geringfügigem Ausmaß neben einer Beeinflussung durch die pH-Umgebung und die große räumliche Nähe durchaus in Betracht gezogen werden. Individualisierte ssDNA-SWNT-Konjugate können damit erstmals zeitaufgelöst PL-mikrospektroskopisch in HeLa-Zellen charakterisiert werden. Für das letzte Projekt werden in Kapitel 6 neuartige Funktionalisierungsmöglichkeiten von ssDNA-SWNT-Konjugaten zu zellulären Transportsystemen unter Erhalt der photophysikalischen Eigenschaften erforscht. Dazu soll das Dispergiermittel DNA als Kupplungsstelle für eine kovalente Anbindung eines Agenz genutzt werden. Anstelle eines Wirkstoffes werden die Untersuchungen mit einem Fluorophor als Modellverbindung durchgeführt, welcher den Vorteil einer einfachen Detektierbarkeit liefert. Prinzipiell besteht die Möglichkeit, das Oligomer mit dem Fluorophor vorzufunktionalisieren und anschließend auf die Oberfläche der SWNTs zu bringen. Als effektiver erweist sich die Methode der direkten Kupplung des Farbstoffs an bereits DNA-dispergierte SWNTs. Der Erfolg in der Präparation von FluorophorssDNA- SWNT-Konjugaten wird über die Emission des Fluorophors mit entsprechenden Referenzexperimenten gemessen. Der Versuch einer Quantifizierung liefert jedoch sehr hohe Werte, die lediglich als eine obere Grenze für die gefundene Anzahl gebundener Fluorophore pro Nanoröhre angesehen werden können. Im Verlauf des Projekts kann eine Funktionalisierbarkeit der Nanoröhren über das Dispergieradditiv DNA als neue Strategie aufgezeigt werden. Im Gegensatz zu bekannten Wirkstofftransportsystemen bietet dieser Funktionalisierungsansatz den Vorteil, dass die optischen Eigenschaften der individualisierten ssDNA-SWNT-Konjugate erhalten bleiben, welche wieder um einen gleichzeitigen Einsatz der Nanoröhren als Transporter und Marker bzw. Sensor erlauben. Die vorliegende Dissertation liefert neben dieser bisher unbekannten Funktionalisierungsstrategie neue Erkenntnisse über die Biokompatibilität speziell von individualisierten ssDNA-SWNT-Konjugaten und deren Verhalten in HeLa-Zellen. Mit diesem Wissen kann der gezielte Wirkstofftransport durch Kohlenstoffnanoröhren als biokompatibles und zellgängiges Trägersystem anvisiert werden.
Nanodiamant weist aufgrund seiner herausragenden mechanischen, optischen und biokompatiblen Eigenschaften ein enormes Potential auf. Für eine erfolgreiche Anwendung muss dieser jedoch zunächst desagglomerisiert und an seiner Oberfläche funktionalisiert werden. In dieser Arbeit werden zwei unterschiedlichen Methoden zur Deagglomerierung und Oberflächenfunktionalisierung vorgestellt. Im ersten Teil wird die thermochemische Methode beschrieben, um den ungewöhnlich stark agglomerierten Detonationsnanodiamant zu deagglomerieren. Dabei wird die Strategie verfolgt, den Nanodiamant erst durch eine thermische Behandlung im Vakuum die vorhandenen Oberflächengruppe zu entfernen, π-Bindungen zu etablieren und dann dessen Oberfläche durch kovalente Bindungen zu modifizieren. Im zweiten Teil wird eine mechanochemische Methode für die Deagglomerierung und Oberflächenfunktionalisierung vorgestellt. Dabei wird ein völlig neuer Ansatz (BASD-Verfahren) entwickelt. Die Ultraschallbehandlung in Kombination mit zusätzlichen Mikrokeramikpartikeln eignet sich hervorragend, um Nanodiamant-agglomerate aufzubrechen. Zwei unterschiedliche Reaktionen mit zwei unterschiedlichen Nanodiamantsorten werden getestet: Eine einfache Kondensationsreaktion durch Silanisierung und eine Radikalreaktion über das Diazoniumsalz. In weiteren Experimenten kann gezeigt werden, dass sich die zuerst vorgestellte thermochemische Methode auch eignet, um aus fluoreszierenden NV-Nanodiamant kolloidalen NV-Nanodiamant mit funktionellen Gruppen herzustellen. Der letzte Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung von Nanodiamanten aus Diamantfilmen mit Hilfe des Top-down Ansatzes, da der gezielte und kontrollierte Aufbau der Gitterstruktur des Diamanten sowie die kontrollierte Einführung bisher nur durch CVD oder Ionenimplantationstechnik möglich ist.
This thesis concerned the quantification of cell adhesion molecules (CAM) in and on thin hydrogel films as surface modification of biomaterials. The established and well characterized, per se inert NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogel system which allows the easy and reproducible bioactivation with peptides was used as basis for this thesis. Two methods can be used to functionalize the coatings. Ligands can either be mixed into the prepolymer solution in prior to layer formation (mix-in method), or freshly prepared coatings can be incubated with ligand solution (incubation method). Divided into three major parts, the first part of the thesis dealt with the concentration of ligands in the bulk hydrogel, whereas the second part of the thesis focused on the surface sensitive quantification of CAMs at the biointerface. The results were correlated with cell adhesion kinetics. The third part of this thesis investigated the biochemical and the structural mimicry of the extracellular matrix (ECM). ECM proteins were presented via sugar-lectin mediated binding and cell behavior on these surfaces was analyzed. Cell behavior on three-dimensional fibers with identical surface chemistry as the coatings in the previous sections of the thesis was analyzed and correlated with the amount of peptide used for bioactivation. Overall, the main question of this work was ‘How much?’ regarding maximal as well as optimal ligand concentrations for controlled cell-hydrogel interactions. The focus in the first practical part of this thesis was to analyze the amount of ligands in NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogels using classical quantification methods. Coatings in 96-well plates as well as on glass were functionalized with GRGDS and 125I-YRGDS for radioisotopic detection (Chapter 3). Using the incubation method for functionalization, a maximal ligand binding using peptide concentrations of 600 µg/mL could be determined. When functionalization was introduced via the mix-in method, a clear tendency for higher ligand concentrations with increasing ligand to prepolymer ratio was observed, but no maximal ligand binding could be detected with a ligand to prepolymer ratio of 2/1 being the highest ratio investigated. This ratio of 2/1 was not exceeded to ensure that complete crosslinking of the hydrogel was not affected. In Chapter 4, a fluorinated amino acid and an iodinated peptide were immobilized to the hydrogels using the mix-in method and were detected by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS). In these measurements, maximal ligand binding was detected for a ligand to prepolymer ratio of 1/1. Higher ligand to prepolymer ratios did not result in any significant increase in ligand concentrations in the surface near regions of the crosslinked hydrogels. To address the question of how many ligands were actually accessible for cell interaction at the interface, surface sensitive quantification methods were applied in the second part of this thesis. For the quantification with surface plasmon resonance (SPR) and surface acoustic wave technology (SAW) (Chapter 5), the hydrogel coating procedure needed to be transferred onto cystamine functionalized gold surfaces. Characterization with ellipsometry and atomic force microscopy (AFM) revealed inhomogeneous cystamine binding to the activated surfaces, which resulted in inhomogeneous coatings. Nevertheless, it could be shown that SPR as well as SAW were suitable methods for the surface sensitive quantification of the ligand concentration on NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogels. Non-functionalized coatings resisted non-specific serum as well as streptavidin (SA) adsorption. Coatings functionalized with biocytin and GRGDSK-biotin introduced specific SA binding that was dependent on the biotin concentration at the surface. Additionally, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and enzyme linked lectin assay (ELLA) (Chapter 6) were applied to coatings in 96-well plates and on glass. Coatings were functionalized with the model molecule biocytin, the biotinylated peptide GRGDSK-biotin, the ECM protein fibronectin (FN), as well as the carbohydrates N-acetylglucosamine (GlcNAc) and N-acetyllactosamine (LacNAc). All ligands could be successfully detected with antibodies or SA via ELISA or ELLA. Maximal GRGDSK-biotin binding to the hydrogel coatings on glass was achieved at a peptide to prepolymer ratio of 1/5, which was used as reference value in Chapter 8. Last but not least, cell adhesion (Chapter 7) was quantified depending on the GRGDS concentration on hydrogel coatings on glass. Maximal adhesion of primary human dermal fibroblast (HDF) was observed at GRGDS to prepolymer ratios of 1/5, when adherent cells were counted on life cell images. Quantification of adherent cells using the CASY® cell counter revealed maximal HDF adhesion at molar ligand to prepolymer ratios of 1/2. However, cell vitality detected by intracellular enzyme activities was not dependent on the GRGDS concentration. Cells which managed to adhere were vital regardless of the amount of ligands present. Additionally, adhesion of fibroblasts from the murine cell line NIH L929 was analyzed by counting on life cell images. These cells, being much smaller than the HDF cells, needed higher GRGDS to prepolymer ratios (2/1) for proper cell adhesion. All quantification methods applied to analyze hydrogels which were functionalized by the mix-in method in Chapter 3, 4, 6 and 7, were compared in Chapter 8. Radiodetection gave information about the ligand concentrations throughout the whole hydrogel and no maximal amount of ligands could be detected when increasing the peptide to prepolymer ratio. In contrast, XPS and TOF-SIMS which only penetrated the surface near regions of the coating, a maximal ligand binding to the hydrogel was detected for 1/1 ratios. SPR and SAW were not included in this comparison, as the coatings on gold need to be optimized first. The two surface sensitive quantification methods (ELISA and HDF adhesion) could give information about the quantity of peptide which was sterically available for SA or cell binding. With these methods, maximal SA and cell binding was detected at ratios of 1/5. These results underline the importance of carefully compare the different methods. Beside ligand quantification on hydrogels, the third part of this thesis was concerned with the biochemical and structural mimicry of the ECM by advanced ECM engineering to design biomimetic biomaterials that are better accepted by cells and tissue. The subject of Chapter 9 was the biomimetic and flexible presentation of the ECM protein FN. FN was attached via sugar-lectin mediated binding to NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogels. The build-up of the covalently immobilized sugar poly-N-acetyllactosamine (polyLacNAc), the subsequent non-covalent binding of the fungal galectin His6CGL2, and FN could be elegantly proven by fluorescent staining on coatings which were functionalized with the sugar by micro contact printing (MCP). Further experiments were carried out on build-ups, where polyLacNAc was immobilized on the hydrogel by incubation. Optimal parameters for the layer build-up were determined by ELLA/ELISA. Only the complete build-up induced proper adhesion of HDFs. Compared to tissue culture polystyrene (TCPS), cells adhered and spread faster on the biomimetic surfaces. The flexible presentation of FN allowed HDFs to rearrange homogenously immobilized FN into fibrillar structures, which seemed not to be possible when FN was adsorbed on glass or covalently bound directly to the hydrogel coatings. This new approach of a flexible and biomimetic presentation of an ECM protein allows new ways to design biomaterials with best possible cell-material interactions. The work described in Chapter 10 focused on the structural mimicry of the fibrous ECM structures by electrospinning of synthetic, bioactive, and degradable fibers. Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) and NCO-sP(EO-stat-PO) were electrospun out of one solution in an easy one-step preparation resulting in fibers with an ultrathin inert hydrogel layer at the surface. By adding GRGDS to the solution prior to electrospinning, specifically interacting fibers could be obtained. In comparison to PLGA, the adsorption of bovine serum albumin (BSA) could be reduced by 99.2%. As a control, the non-active peptide GRGES was immobilized to the fiber. These fibers did not allow cell adhesion, showing that the integrity of the hydrogel coated fibers was not affected by the immobilization of peptides. HDF adhesion was obtained by functionalization with GRGDS, leading to the adhesion, spreading, and proliferation of HDFs. Also mesenchymal stem cells (MSC) could adhere to GRGDS functionalized fibers. Additionally, for ligand quantification, the ELISA technique was successfully transferred to fiber substrates. To highlight the potential of the approaches for the biochemical and structural mimicry of the ECM, the sugar polyLacNAc was immobilized on the PLGA/sP(EO-stat-PO) fibers followed by the subsequent layer build-up with His6CGL2 and FN. These fibers triggered HDF adhesion.
Ausgangspunkt war die aus der Fulleren-Chemie bekannte Prato-Reaktion, bei welcher das Ylid in situ aus einer Aminosäure und einem Aldehyd generiert wird und anschließend mit den C=C-Bindungen des Fullerens reagiert. Diese Funktionalisierungsmethode wurde nun auf Detonationsnanodiamant übertragen.
Um zusätzliche π-Bindungen auf der Oberfläche der Diamantteilchen zu schaffen, wurden diese i.Vak. bei 750 °C ausgeheizt (ND750). Für die Immobilisierung wurde die Aminosäure Sarcosin gewählt. Dodecanal und 2,4,6-Tris(hexadecyloxy)-benzaldehyd dienten jeweils als Reaktionspartner.
Da bereits in früheren Studien gezeigt wurde, dass bei dieser Reaktion der Aldehyd selbst unspezifisch an den Diamanten binden kann und so möglicherweise Teile der Oberfläche für die spezifische Funktionalisierung blockiert, wurden für die weitere Betrachtung Azomethinylidvorstufen synthetisiert, die selbst nicht in der Lage sind, mit der Diamantoberfläche zu reagieren. Diesen Zweck erfüllten N-heterocyclische Iminiumbromide, die durch Umsetzung des jeweiligen Heteroaromaten mit Bromessigsäureethylester bzw. Bromacetonitril erhalten wurden.
Alle Ylidvorstufen wurden in Gegenwart von NEt3 in situ zu den gewünschten Dipolen umgesetzt und auf Nanodiamant immobilisiert.
Neben ND750 wurden auch oxidierter und unbehandelter Diamant (NDox bzw. NDunb) sowie Diamant, der bei 900 °C i.Vak. ausgeheizt wurde (ND900), als Substrat eingesetzt, um den Einfluss der Oberflächenterminierung und des Graphitisierungsgrades auf das Reaktionsverhalten zu studieren. Durch Raman- und IR-Spektroskopie wurde gezeigt, dass NDox sehr viele Carbonylgruppen und wenig C=C-Doppelbindungen auf seiner Oberfläche trägt. Durch das Ausheizen i.Vak wurden hingegen zusätzliche π-Bindungen erzeugt, die bei ND900 bereits ausgedehntere Bereiche mit sp2-Kohlenstoff bilden.
Der Erfolg der Immobilisierung wurde IR-spektroskopisch nachgewiesen. Die Oberflächenbeladung aller hergestellten Diamantaddukte wurde thermogravimetrisch bestimmt.
NDox immobilisierte unabhängig vom Reaktionspartner stets die wenigsten Moleküle auf seiner Oberfläche. Deren Terminierung wird von Carbonylgruppen dominiert, die grundsätzlich schlechtere Dipolarophile darstellen als C=C-Doppelbindungen.
Die übrigen Diamantmaterialien NDunb, ND750 und ND900 ließen keine eindeutige Tendenz bezüglich ihrer Reaktionsfreudigkeit erkennen. Die Oberfläche des unbehandelten Diamanten NDunb besitzt sowohl Carbonylfunktionen als auch einzelne Bereiche graphitischen Kohlenstoffs. Diese konkurrieren vermutlich um die angebotenen Dipole, sodass die resultierenden Oberlächenbeladungen ihrer Konjugate in einem mittleren Wertebereich liegen. Durch das Ausheizen i.Vak. werden viele Carbonylgruppen unter Ausbildung weiterer C=C-Doppelbindungen von der Oberfläche entfernt. Bei 750 °C sind diese räumlich sehr beschränkt, stark gekrümmt und daher sehr reaktiv. Trotzdem erreichte ND750 selten eine Oberflächenbelegung, welche jene von NDunb übertrifft. Die π-Bindungen auf seiner Oberfläche sind in Fünf- und Sechsringe eingebaut, um die gekrümmte Struktur zu realisieren. Wahrscheinlich besteht für die Cycloaddition an Nanodiamant eine dem Fulleren C60 ähnliche Regioselektivität bezüglich der angegriffen Doppelbindung. Somit stehen nicht alle frisch erzeugten C=C-Bindungen für die Reaktion zur Verfügung.
Bei 900 °C ist die Graphitisierung der Diamantoberfläche weiter fortgeschritten. Es entstehen nicht nur neue C=C-Bindungen, sondern bereits gebildete Kohlenstoffkappen beginnen zu koaleszieren, wobei ausgedehntere sp2-Bereiche mit geringerer Krümmung und somit verminderter Reaktivität entstehen. So nimmt die Oberflächenbeladung der meisten ND900-Konjugate nicht weiter zu.
Wie aus den Ergebnissen dieser Arbeit hervorgeht, ist die Funktionalisierung von Nanodiamantpartikeln nicht trivial. Sowohl die Oberflächenbeschaffenheit des Diamantmaterials als auch die Struktur des eingesetzten Azomethinylids beeinflussen das Immobilisierungsverhalten.
Die vorliegende Arbeit zeigt aber, dass die 1,3-dipolare Cycloaddition von Azomethinyliden eine nützliche Methode zur Funktionalisierung von Nanodiamantpartikeln ist. Sie ermöglicht des Weiteren die simultane Einführung mehrerer unterschiedlicher funktioneller Gruppen. Dies macht die untersuchte Reaktion zu einem wertvollen Werkzeug für die Herstellung funktionalisierter Nanodiamantmaterialien, z. B. für biomedizinische Anwendungen.