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Nuclear Magnetic Resonance (NMR) provides a highly flexible platform for non invasive analysis and imaging biological samples, since the manipulation of nuclear spin allows the tailoring of experiments to maximize the informativeness of the data. MRI is capable of visualizing a holistic picture of the lipid storage in living plant/seed. This review has sought to explain how the technology can be used to acquire functional and physiological data from plant samples, and how to exploit it to characterize lipid deposition in vivo. At the same time, we have referred to the current limitations of NMR technology as applied to plants, and in particular of the difficulty of transferring methodologies optimized for animal/medical subjects to plant ones. A forward look into likely developments in the field is included, anticipating its key future role in the study of living plant.
Purpose
Pheochromocytomas and Paragangliomas (PPGL) result in chronic catecholamine excess and serious health complications. A recent study obtained a metabolic signature in plasma from PPGL patients; however, its targeted nature may have generated an incomplete picture and a broader approach could provide additional insights. We aimed to characterize the plasma metabolome of PPGL patients before and after surgery, using an untargeted approach, and to broaden the scope of the investigated metabolic impact of these tumors.
Design
A cohort of 36 PPGL patients was investigated. Blood plasma samples were collected before and after surgical tumor removal, in association with clinical and tumor characteristics.
Methods
Plasma samples were analyzed using untargeted nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy metabolomics. The data were evaluated using a combination of uni- and multi-variate statistical methods.
Results
Before surgery, patients with a nonadrenergic tumor could be distinguished from those with an adrenergic tumor based on their metabolic profiles. Tyrosine levels were significantly higher in patients with high compared to those with low BMI. Comparing subgroups of pre-operative samples with their post-operative counterparts, we found a metabolic signature that included ketone bodies, glucose, organic acids, methanol, dimethyl sulfone and amino acids. Three signals with unclear identities were found to be affected.
Conclusions
Our study suggests that the pathways of glucose and ketone body homeostasis are affected in PPGL patients. BMI-related metabolite levels were also found to be altered, potentially linking muscle atrophy to PPGL. At baseline, patient metabolomes could be discriminated based on their catecholamine phenotype.
In diesem Projekt wurde die Wechselwirkung des PPIase-Enzyms MIP mit Kollagen IV unter- sucht. MIP ist maßgeblich für die Infektiösität von Legionella pneumophila verantwortlich, einem Bakterium, welches im Menschen schwere Lungenentzündungen auslösen kann. Das Enzym zeigt eine hohe Affinität gegenüber einem kurzen Peptidsequenzabschnitt in Kolla- gen IV (genannt „P290”), welches unter anderem im Epithel der Lunge zu finden ist. Die Interaktionsoberfläche der Moleküle wurde durch den Einsatz eines paramagnetischen Spin-Labels in NMR-Experimenten charakterisiert. Mit Hilfe von Docking und Moleküldy- namiksimulationen konnte aus diesen Daten ein Modell des MIP-Kollagen-Komplexes be- rechnet werden. Es wurde gezeigt, dass MIP als Dimer in der Lage ist, nach Kollagen IV zu „greifen” und sich dann an das Molekül heranzuziehen. Wahrscheinlich dient dieser Mechanismus der Adhä- sion von L. pneumophila an die Wirtszelle. Neben der zuvor postulierten Destabilisierung von Kollagen IV durch MIP, welche hier nicht beobachtet wurde, könnte die Adhäsion ein wichtiger Faktor für die Virulenz von L. pneumophila sein. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des isolierten Peptids P290 auf die biologische PPIase-Aktivität von MIP untersucht. Durch NMR-Messungen und anschließenden Mole- küldynamiksimulationen konnte gezeigt werden, dass P290 sich stabil in die Bindungsta- sche von MIP einlagert und durch den Sequenzabschnitt -CYS130-PRO131---TRP134- das Enzym blockiert. Die übrigen Aminosäuren in P290 dienen der Stabilisierung des Kom- plexes und sorgen für die Selektivität von P290, welches, im Unterschied zu bekannten Wirkstoffen, das humane Homolog zu MIP nicht inhibiert. Die Vorhersagen der Simulatio- nen konnten durch ein Peptid Microarray und Messungen der enzymatischen Aktivität von MIP in PPIase-Assays bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden zur Optimierung von P290 eingesetzt, indem die Peptidsequenz durch den Austausch zweier Aminosäuren verändert und das Molekül zu einem Ring geschlossen wurde. Die entstandene Struktur besitzt deut- lich verbesserte Bindungseigenschaften und könnte künftig als Basis für eine neue Klasse von Wirkstoffen gegen L. pneumophila dienen. In diesem Projekt wurde eine Methode zur Aufklärung der Molekülstruktur neuartiger Wirkstoffe gegen Malaria im Komplex mit ihrem paramagnetischen Zielmolekül etabliert und weiterentwickelt. Die Vorgehensweise leitet intermolekulare Distanzinformationen aus der sog. paramagnetischen Relaxation ab, einem Effekt, der den Einsatz klassischer Me- thoden zur Molekülstrukturaufklärung mittels NMR verhindert. Es werden drei Parameter durch NMR-Spektroskopie bestimmt: 1. die longitudinale Relaxationszeit der Wasserstoff- atome in Wirkstoffmolekül, 2. die effektive Korrelationszeit des Komplexes und 3. der Spin- Zustand des Eisenions im Zielmolekül. Mit Hilfe dieser Messmethode konnte die Komplexstruktur mehrerer bekannter Medika- mente gegen Malaria aufgeklärt werden. Weiterhin wurden zwei neue Klassen von Wirkstof- fen untersucht, die C,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide und die N,C-gekoppelte Naphthylisoquinolin-Alkaloide. In Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen aus der Literatur lagern sich die Wirkstoffe stets um einen Winkel geneigt und in Richtung des Randes des Zielmoleküls verschoben an. Diese Konfiguration maximiert die attraktiven π- π-Wechselwirkungen zwischen den Molekülen. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse aus NMR, UV-Spektroskopie und Massenspektrome- trie konnte die Existenz eines bisher nicht bekannten Tetramer-Komplexes nachgewiesen werden, welcher eine wichtige Zwischenstufe in der Biokristallisation von Hämozoin durch die Malariaparasiten darstellen könnte, und Ansatzpunkte für den weiterhin nicht vollstän- dig bekannten Wirkmechanismus der meisten Antimalaria-Wirkstoffe liefert. Für die Naphthylisoquinolin-Alkaloide zeigte sich weiterhin, dass Wasser eine essenzielle Rolle in der Komplexbildung spielt. In Moleküldynamiksimulationen der N,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide konnte die Entstehung einer Wasserstoffbrücke zwischen Wirkstoff und Zielmolekül gezeigt werden, welche einen zusätzlichen Weg der Komplex- stabilisierung neben den bereits bekannten π-π-Wechselwirkungen aufzeigt. Die N,C-NIQs konnten erstmals auch bei einem pH-Wert von 5,6 beobachtet werden, einer chemischen Umgebung wie sie auch in-vivo in der Verdauungsvakuole des Malariaparasiten herrscht.
Normoxic and anoxic metabolism of Nicotiana tabacum transformants lacking root nitrate reductase
(2002)
The aim of this work was to find out whether and how nitrate reduction in roots would facilitate survival of hypoxic and anoxic (flooding)-phases. For that purpose, we compared the response of roots of hydroponically grown tobacco wildtype (Nicotiana tabacum cv. Gatersleben) and of a transformant (LNR-H) with no nitrate reductase (NR) in the roots but almost normal NR in leaves (based on a nia2-double mutant). As an additional control we used occasionally a 35S-transformant of the same nia2-double mutant, which on the same genetic background constitutively expressed NR in all organs. In some cases, we also compared the response of roots from WT plants, which had been grown on tungstate for some time in order to completely suppress NR activity. The following root parameters were examined: 1) Growth and morphology 2) Root respiration rates and leaf transpiration 3) Metabolite contents in roots (ATP, hexosemonophosphates, free sugars, starch, amino acids, total protein) 4) Inorganic cation and anion contents 5) Lactate and ethanol production 6) Extractable LDH-and ADH-activities 7) Cytosolic pH values (by 31P-NMR) 8) NO Cation and anion contents of roots from WT and LNR-H were only slightly different, confirming that these plants would be better suited for our purposes than the widely used comparison of nitrate-versus ammonium-grown plants, which usually show up with dramatic differences in their ion contents. Normoxia: LNR-H-plants had shorter and thicker roots than WT with a lower roots surface area per leaf FW. This was probably the major cause for the significantly lower specific leaf transpiration of LNR-H. WT-roots had lower respiration rates, lower ATP-and HMP-contents, slightly lower sugar- and starch contents and somewhat lower amino acid contents than LNR-H roots. However, total protein/FW was almost identical. Obviously the LNR-H transformants did not suffer from N-defciency, and their energy status appeared even better than that of WT-roots. Data from the 35S-transformant were similar to those of WT. This indicates that the observed differences between WT and LNR-H were not due to unknown factors of the genetic nia2-background, but that they could be really traced back to the presence resp. absence of nitrate reduction. Anoxia: Under short-term anoxia (2h) LNR-H plants, but not WT-plants exhibited clear symptoms of wilting, although leaf transpiration was lower with LNR-H. Reasons are not known yet. LNR-H roots produced much more ethanol (which was excreted) and lactate compared to WT, but extractable ADH and LDH activities, were not induced by anoxia. However, the LDH activity background was twice as high as that of the WT troughout the time period studied. Tungstate-treated WT-roots also gave higher fermentation rates than normal WT roots. Sugar- and HMP-contents remained higher in LNR-H roots than in WT. NR in WT roots was activated under anoxia and roots accumulated nitrite, which was also released to the medium. 31P-NMR spectroscopy showed that LNR-H- roots, in spite of their better energy status, acidified their cytosol more than WT roots. Conclusions: Obviously nitrate reduction affects - by as yet unknown mechanisms - root growth and morphology. The much lower anoxic fermentation rates of WT-roots compared to LNR-H roots could not be traced back to an alternative NADH consumption by nitrate reduction, since NR activity was too low for that. An overall estimation of H+-production by glycolysis, fermentation and nitrate reduction (without nitrite reduction, which was absent under anoxia) indicated that the stronger cytosolic acidification of anoxic LNR-H roots was based on their higher fermentation rates. Thus, nitrate reduction under anoxia appears advantageous because of lower fermentation rates and concomitantly lower cytosolic acidification. However, it remained unclear why fermentation rates were so different. Perspective: Preliminary experiments had indicated that WT-roots produced more nitric oxide (NO) under anoxia than LNR-H-roots. Accordingly, we suggest that nitrate reduction, beyond a merely increased NADH-consumption, would lead to advantageous changes in metabolism, eventually via NO-production, which is increasingly recognized as an important signaling compound regulating many plant functions.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden potenzielle Wirksubstanzen zur Behandlung trypanosomaler und bakterieller Infektionen gesucht. Während auf dem Gebiet der Trypanosomiasis das Ziel in der Testung großer Substanzbibliotheken auf antitrypanosomale Wirkung und in der Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bestand, lag im Bereich der bakteriellen Infektion der Schwerpunkt in der Entwicklung neuer Testmethoden. Die Untersuchungen erfolgten mittels Kapillarelektrophorese und magnetischer Kernresonanz.
Marine invertebrate-associated symbiotic bacteria produce a plethora of novel secondary metabolites which may be structurally unique with interesting pharmacological properties. Selection of strains usually relies on literature searching, genetic screening and bioactivity results, often without considering the chemical novelty and abundance of secondary metabolites being produced by the microorganism until the time-consuming bioassay-guided isolation stages. To fast track the selection process, metabolomic tools were used to aid strain selection by investigating differences in the chemical profiles of 77 bacterial extracts isolated from cold water marine invertebrates from Orkney, Scotland using liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Following mass spectrometric analysis and dereplication using an Excel macro developed in-house, principal component analysis (PCA) was employed to differentiate the bacterial strains based on their chemical profiles. NMR H-1 and correlation spectroscopy (COSY) were also employed to obtain a chemical fingerprint of each bacterial strain and to confirm the presence of functional groups and spin systems. These results were then combined with taxonomic identification and bioassay screening data to identify three bacterial strains, namely Bacillus sp. 4117, Rhodococcus sp. ZS402 and Vibrio splendidus strain LGP32, to prioritize for scale-up based on their chemically interesting secondary metabolomes, established through dereplication and interesting bioactivities, determined from bioassay screening.
Low field NMR has been successfully used for the evaluation of seed composition and quality, but largely only in crop species. We show here that 1.5T NMR provides a reliable means for analysing the seed lipid fraction present in a wide range of species, where both the seed size and lipid concentration differed by >10 fold. Little use of high field NMR has been made in seed research to date, even though it potentially offers many opportunities for studying seed development, metabolism and storage. Here we demonstrate how 17.5T and 20T NMR can be applied to image seed structure, and analyse lipid and metabolite distribution. We suggest that further technical developments in NMR/MRI will facilitate significant advances in our understanding of seed biology.
Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zur Synthese und zum Reaktionsverhalten enantiomerenangereicherter Silyllithium- und Silylmagnesiumverbindungen. Dabei sind mehrere Punkte von Bedeutung: die Aufklärung der Struktur im Festkörper wie in Lösung, die Bestimmung der Selektivitäten und des stereochemischen Verlaufs hoch enantiomerenangereicherter polarer Silylmetallverbindungen in Umsetzungen mit Elektrophilen, die konfigurative Stabilität hoch enantiomerenangereicherter Silyllithium- und Silylmagnesiumverbindungen sowie die Aufklärung ungewöhlicher NMR-Verschiebungen. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte quantenchemische Berechnungen haben sich vor allem auf die beiden letzten Punkte konzentriert. Insgesamt wurden folgende Themenkomplexe bearbeitet: 1.) Synthese einer hoch enantiomerenangereicherten Silyllithiumverbindung 2.) Reaktionsverhalten der hoch enantiomerenangereicherten Silyllithiumverbindung 2 gegenüber Elektrophilen 3.) Konfigurative Stabilität der hoch enantiomerenangereicherten Silyllithiumverbindung 2 4.) Weitere Untersuchungen zur Darstellung von Silyllithiumverbindungen 5.) Untersuchungen zur Struktur von Silyllithiumverbindungen im Festkörper und in Lösung 6.) Quantenchemische Analysen der Ursachen der NMR-Verschiebungen von Disilenen und heteroatom-substituierten Silanen
Für die Verwendung von zellbasierten Therapeutika ist vor allem die korrekt Identifikation
sowohl vom Ausgangsmaterial wie auch dem produziertem Material von
zentraler Wichtigkeit. In dieser Arbeit wurde eine Methodik entwickelt, welche eine
nicht-invasive Klassifizierung von Zellen und zellulärer Entwicklung aufgrund ihrer
zweidimensionalen Magnetresonanz-Korrelationsspektren ermöglichte.
Hierzu wurde ein mobiler MR-Scanner mit einer Feldstärke von 0.5T und einem Isozentrum
von 1 cm3 verwendet. Aufgrund der kompakten und leichten Bauweise war
es möglich, das System in normalen Zellkulturlaboren zu verwenden. Von den Proben
wurde ein zweidimensionales T1/T2 -Korrelationsspektrum aufgenommen, anhand
dessen die Zellen klassifiziert werden sollten. Mithilfe von Agarose-Dotagraf® -Zell-
Phantomen konnte die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Messsystems und der
verwendeten Sequenz validiert werden.
Aufgrund der unter Umständen recht langen Messzeiten der MR-Technologie war
auch die Handhabung und Kultur der Zellproben während des Messprozesses von
großer Bedeutung. Um hierfür den Durchsatz an Proben zu erhöhen, wurde eine kostengünstige
und ebenfalls mobile Robotikanlage entwickelt. Diese basierte auf dem
kommerziell erhältlichen Roboterarm Braccio, welcher durch einen Arduino Mega
Mikrocontroller gesteuert wurde. Mit bis zu 24 Proben pro Tag konnte durch die
Automatisierung der Durchsatz an Proben um den Faktor 3 – 4 gesteigert werden.
Durch den entwickelten Prozess war es möglich, eine umfangreiche Datenbank –
bestehend aus 362 unabhängigen Messungen (biologische Replikate) – aufzubauen.
Die Datenbank enthielt Messungen von zehn unterschiedlichen Zelllinien. Zusätzlich
wurden T1/T2 -Korrelationsspektren von mesenchymalen Stromazellen (MSCs)
vor und nach deren Differenzierung zu Adipocyten aufgenommen, um ihre zelluläre
Entwicklung nicht-invasiv charakterisieren zu können.
Die aufgenommenen Daten wurden mithilfe einer geeigneten Support Vector Machine
wie auch angepassten künstlichen neuronalen Netzwerken klassifiziert. Mithilfe
dieser Methoden konnten die Zelllinien und MSCs anhand ihrer aufgenommenen
Korrelationsspektren mit einer Genauigkeit von bis zu 98% klassifiziert werden.
Diese hohe Treffsicherheit legte den Schluss nahe, dass die Kombination aus nichtinvasiver,
zweidimensionaler T1/T2 -MR-Relaxometrie und der Verwendung von geeigneten
Methoden des machine learning und der künstlichen Intelligenz eine effiziente
Methodik für die nicht-invasive Klassifizierung von Zellen sowie zellulärer
Entwicklung darstellt.
Auf der Suche nach neuen biologisch aktiven Naturstoffe aus der Gattung Aglaia(Meliaceae) wurde die insektizide Wirkung von Methanol-Extrakten verschiedener Aglaia-Arten gegenüber frisch geschlüpften Raupen des Schadinsektes Spodoptera littoralis (Noctuidae) untersucht. Die getesteten Proben stammen aus Vietnam und Südchina. Aus den in diesem Bioscreening aufgefallenen Extrakten wurden mit Hilfe von durch Biotests begleiteter Fraktionierung sowie parallel durchgeführten chemisch-physikalischen Analysen insgesamt 29 Naturstoffe isoliert und charakterisiert. Darunter befinden sich sechs bisher nicht beschriebene Benzofurane (Rocaglamide), zwei Benzopyrane (je ein Aglain und ein Aglaforbesin), zwei Benzoxepine (Forbagline) sowie ein Zimtsäure-Putrescin-Bisamid. Die Strukturaufklärung erfolgte vor allem durch NMR-Spektroskopie (darunter 2D-Experimente wie H-H-COSY, HMQC, HMBC und ROESY) sowie durch Massenspektrometrie. Die Untersuchungen zur Struktur-Wirkungs-Beziehung ergaben für die Rocaglamide V, Z und AA eine starke insektizide Aktivität gegenüber Raupen von S. littoralis mit LC50- und EC50-Werten von 2.0 bis 6.6 ppm bzw. 0.1 bis 1.0 ppm, während die Rocaglamide X und Y überraschenderweise keine Aktivität zeigten. Letztere stellen bisher die ersten Beispiele für biologisch inaktive Rocaglamid-Derivate überhaupt dar. Dieser Befund weist darauf hin, daß für die insektizide Aktivität dieser Verbindungs-Klasse der Hydroxyl-Substituent am C-8b neben dem Benzofuran-Grundkörper eine entscheidende Rolle spielt, da eine Alkoxylierung an C-8b zum vollständigen Verlust der Aktivität führt. In einem Screening mit drei verschiedenen basalen Medien, die mit unterschiedlichen Phytohormonen und organischen Zusätzen versetzt worden waren, erwies sich das RW-(Risser und White) Medium mit 1 mg/l 2.4-D, 0.2 mg/l BAP, 0.1 g/l Ascorbinsäure und 0.5 g/l Caseinhydrolysat als geeignetstes Kulturmedium zur Kalusbildung bei Aglaia-Arten. Die Vorversuche zeigten darüber hinaus deutlich, daß Kalluskulturen von Aglaia elliptica in der Lage sind, relevante Inhaltsstoffe wie das Zimtsäure-Pyrrolidin-Bisamid- Derivat zu bilden.