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Untersuchungen zur Diversität, Abundanz und vertikalen Weitergabe von Bakterien in marinen Schwämmen
(2013)
Marine Schwämme (Phylum Porifera) gehören mit ihrem ersten Auftreten im Präkambrium vor ungefähr 580 Millionen Jahren zu den ältesten Vertretern der Metazoen weltweit. Ähnlich lange leben sie wahrscheinlich schon in Symbiose mit Mikroorganismen. In der vorliegenden Doktorarbeit soll der karibische Schwamm Ectyoplasia ferox als Modellsystem zur Erforschung der Schwamm-assoziierten mikrobiellen Konsortien, deren Weitergabe und Interaktionen mit dem Schwamm, vorgestellt werden. Mit Hilfe von 16S rRNA-Genbanken sowie der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) konnte gezeigt werden, dass Symbionten aus sechs der in E. ferox gefundenen acht Phyla sowie der „sponge-associated unclassified lineage” SAUL vertikal an die nächste Schwammgeneration weitergegeben werden. Mittels phylogenetischer Analysen wurden insgesamt 21 „vertical transmission“ (VT) Cluster identifiziert, von denen 19 in „sponge specific“ Cluster (SSC) bzw. „sponge coral“ Clustern (SCC) lagen. Daraus kann man schließen, dass ein Großteil des mikrobiellen Konsortiums von E. ferox über die reproduktiven Stadien weitergegeben wird. Auch konnten zwei Cyanobakterien identifiziert werden, die nicht in den reproduktiven Stadien vorhanden waren und höchstwahrscheinlich horizontal aus dem umgebenden Meerwasser aufgenommen wurden. Eine Reduzierung von 50% der Symbionten im Mesohyl nach dem „spawning“ zeigte erstmalig experimentell auf, dass Schwammsymbionten aus dem Schwamm in das umgebende Meerwasser gelangen können. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der „presence vs. activity“-Vergleich zur Feststellung der metabolischen Aktivität von Bakterien auf die DGGE-Methode übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass die meisten mikrobiellen Symbionten im Adult-Schwamm, Embryo- sowie Larvalstadium metabolisch aktiv waren. Erste Versuche die Anzahl von Symbionten in den Larven von E. ferox mittels Antibiotika zu reduzieren, verliefen positiv. So wiesen die mit Antibiotika behandelten Larven in der DGGE eine deutliche Reduzierung der Bandenintensität auf. Die Verfügbarkeit aller reproduktiver Stadien von E. ferox sowie die Möglichkeit die Larven im Labor experimentell zu manipulieren, machen E. ferox zu einem geeigneten Modellschwamm für zukünftige Studien bezüglich der vertikalen Weitergabe von Symbionten.
The evolutionary success of insects is believed to be at least partially facilitated by symbioses between insects and prokaryotes. Bacterial endosymbionts confer various fitness advantages to their hosts, for example by providing nutrients lacking from the insects’ diet thereby enabling the inhabitation of new ecological niches. The Florida carpenter ant Camponotus floridanus harbours endosymbiotic bacteria of the genus Blochmannia. These primary endosymbionts mainly reside in the cytoplasm of bacteriocytes, specialised cells interspersed into the midgut tissue, but they were also found in oocytes which allows their vertical transmission. The social lifestyle of C. floridanus may facilitate the rapid spread of infections amongst genetically closely related animals living in huge colonies. Therefore, the ants require an immune system to efficiently combat infections while maintaining a “chronic” infection with their endosymbionts.
In order to investigate the immune repertoire of the ants, the Illumina sequencing method was used. The previously published genome sequence of C. floridanus was functionally re-annotated and 0.53% of C. floridanus proteins were assigned to the gene ontology (GO) term subcategory “immune system process”. Based on homology analyses, genes encoding 510 proteins with possible immune function were identified. These genes are involved in microbial recognition and immune signalling pathways but also in cellular defence mechanisms, such as phagocytosis and melanisation. The components of the major signalling pathways appear to be highly conserved and the analysis revealed an overall broad immune repertoire of the ants though the number of identified genes encoding pattern recognition receptors (PRRs) and antimicrobial peptides (AMPs) is comparatively low. Besides three genes coding for homologs of thioester-containing proteins (TEPs), which have been shown to act as opsonins promoting phagocytosis in other insects, six genes encoding the AMPs defesin-1 and defensin-2, hymenoptaecin, two tachystatin-like peptides and one crustin-like peptide are present in the ant genome. Although the low number of known AMPs in comparison to 13 AMPs in the honey bee Apis mellifera and 46 AMPs in the wasp Nasonia vitripennis may indicate a less potent immune system, measures summarised as external or social immunity may enhance the immune repertoire of C. floridanus, as it was discussed for other social insects. Also, the hymenoptaecin multipeptide precursor protein may be processed to yield seven possibly bioactive peptides. In this work, two hymenoptaecin derived peptides were heterologously expressed and purified. The preliminary antimicrobial activity assays indicate varying bacteriostatic effects of different hymenoptaecin derived peptides against Escherichia coli D31 and Staphylococcus aureus which suggests a functional amplification of the immune response further increasing the antimicrobial potency of the ants.
Furthermore, 257 genes were differentially expressed upon immune challenge of C. floridanus and most of the immune genes showing differential expression are involved in recognition of microbes or encode immune effectors rather than signalling components. Additionally, genes coding for proteins involved in storage and metabolism were downregulated upon immune challenge suggesting a trade-off between two energy-intensive processes in order to enhance effectiveness of the immune response. The analysis of gene expression via qRT-PCR was used for validation of the transcriptome data and revealed stage-specific immune gene regulation. Though the same tendencies of regulation were observed in larvae and adults, expression of several immune-related genes was generally more strongly induced in larvae. Immune gene expression levels depending on the developmental stage of C. floridanus are in agreement with observations in other insects and might suggest that animals from different stages revert to individual combinations of external and internal immunity upon infection.
The haemolymph proteome of immune-challenged ants further established the immune-relevance of several proteins involved in classical immune signalling pathways, e.g. PRRs, extracellularly active proteases of the Toll signalling pathway and effector molecules such as AMPs, lysozymes and TEPs. Additionally, non-canonical proteins with putative immune function were enriched in immune-challenged haemolymph, e.g. Vitellogenins, NPC2-like proteins and Hemocytin. As known from previous studies, septic wounding also leads to the upregulation of genes involved in stress responses. In the haemolymph, proteins implicated in protein stabilisation and in the protection against oxidative stress and insecticides were enriched upon immune challenge. In order to identify additional putative immune effectors, haemolymph peptide samples from immune-challenged larvae and adults were analysed. The analysis in this work focussed on the identification of putative peptides produced via the secretory pathway as previously described for neuropeptides of C. floridanus. 567 regulated peptides derived from 39 proteins were identified in the larval haemolymph, whereas 342 regulated peptides derived from 13 proteins were found in the adult haemolymph. Most of the peptides are derived from hymenoptaecin or from putative uncharacterised proteins. One haemolymph peptide of immune-challenged larvae comprises the complete amino acid sequence of a predicted peptide derived from a Vitellogenin. Though the identified peptide lacks similarities to any known immune-related peptide, it is a suitable candidate for further functional analysis.
To establish a stable infection with the endosymbionts, the bacteria have to be transmitted to the next generation of the ants. The vertical transmission of B. floridanus is guaranteed by bacterial infestation of oocytes. This work presents the first comprehensive and detailed description of the localisation of the bacterial endosymbionts in C. floridanus ovaries during oogenesis. Whereas the most apical part of the germarium, which contains the germ-line stem cells, is not infected by the bacteria, small somatic cells in the outer layers of each ovariole were found to be infected in the lower germarium. Only with the beginning of cystocyte differentiation, endosymbionts are exclusively transported from follicle cells into the growing oocytes, while nurse cells were never infected with B. floridanus. This infestation of the oocytes by bacteria very likely involves exocytosis-endocytosis processes between follicle cells and the oocytes. A previous study suggested a down-modulation of the immune response in the midgut tissue which may promote endosymbiont tolerance. Therefore, the expression of several potentially relevant immune genes was analysed in the ovarial tissue by qRT-PCR. The relatively low expression of genes involved in Toll and IMD signalling, and the high expression of genes encoding negative immune regulators, such as PGRP-LB, PGRP-SC2, and tollip, strongly suggest that a down-modulation of the immune response may also facilitate endosymbiont tolerance in the ovaries and thereby contribute to their vertical transmission.
Overall, the present thesis improves the knowledge about the immune repertoire of C. floridanus and provides new candidates for further functional analyses. Moreover, the involvement of the host immune system in maintaining a “chronic” infection with symbiotic bacteria was confirmed and extended to the ovaries.
Marine sponges are the most ancient metazoans and of large ecological importance as drivers of water and nutrient flows in benthic habitats. Furthermore marine sponges are well known for their association with highly abundant and diverse microbial consortia. Microorganisms inhabit the extracellular matrix of marine sponges where they can make up to 35% of the sponge’s biomass. Many microbial symbionts of marine sponges are highly host specific and cannot, or only in very rare abundances, be found outside of their host environment. Of special interest is the candidate phylum Poribacteria that was first discovered in marine sponges and still remains almost exclusive to their hosts. Phylogenetically Poribacteria were placed into the Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydiae superphylum and similarly to many members of this superphylum cell compartmentation has been proposed to occur in members of the Poribacteria. The status as a candidate phylum implies that no member of Poribacteria has been obtained in culture yet. This restricts the investigations of Poribacteria and their interactions with marine sponges to culture independent methods and makes functional characterisation a difficult task.
In this PhD thesis I used the novel method of single-cell genomics to investigate the genomic potential of the candidate phylum Poribacteria. Single-cell genomics enables whole genome sequencing of uncultivated microorganisms by singularising cells from the environment, subsequent cell lysis and multiple displacement amplification of the total genomic DNA. This process yields sufficient amounts of DNA for whole genome sequencing and genome analysis. This technique and its relevance for symbiosis studies are discussed in this PhD thesis.
Through the application of single-cell genomics it was possible to increase the number of single-amplified genomes of the candidate phylum Poribacteria from initially one to a total of six. Analyses of these datasets made it possible to enhance our understanding of the metabolism, taxonomy, and phylum diversity of Poribacteria and thus made these one of the best-characterised sponge symbionts today. The poribacterial genomes represented three phylotypes within the candidate phylum of which one appeared dominant. Phylogenetic and phylogenomic analyses revealed a novel phylogenetic positioning of Poribacteria distinctly outside of the Planctomycete, Verrucomicorbia, Chlamydiae superphylum. The occurrence of cell compartmentation in Poribacteria was also revisited based on the obtained genome sequences and revealed evidence for bacterial microcompartments instead of the previously suggested nucleotide-like structures. An extensive genomic repertoire of glycoside hydrolases, glycotransferases, and other carbohydrate active enzymes was found to be the central shared feature between all poribacterial genomes and showed that Poribacteria are among those marine bacteria with the largest genomic repertoire for carbohydrate degradation. Detailed analysis of the carbohydrate metabolism revealed that Poribacteria have the genomic potential for degradation of a variety of polymers, di- and monosaccharaides that allow these symbionts to feed various nutrient sources accessible through the filter-feeding activities of the sponge host. Furthermore the poribacterial glycobiome appeared to enable degradation of glycosaminoglycan chains, one of the main building blocks of extracellular matrix of marine sponges. Different lifestyles resulting from the poribacterial carbohydrate degradation potential are discussed including the influence of nutrient cycling in sponges, nutrient recycling and scavenging. The findings of this thesis emphasise the long overlooked importance of heterotrophic symbionts such as Poribacteria for the interactions with marine sponges and represent a solid basis for future studies of the influence heterotrophic symbionts have on their sponge hosts.
BAKTERIELLE ENDOSYMBIONTEN DER BIENENWÖLFE Symbiontische Interaktionen zwischen verschiedenen Arten stellen allgegenwärtige und essentielle Bestandteile natürlicher Systeme dar und haben wahrscheinlich die Evolution jedes rezenten Lebewesens beeinflusst. Insekten als die diverseste Metazoen-Klasse der Erde profitieren von dem außerordentlichen metabolischen Potenzial vieler Mikroorganismen in einer großen Anzahl mutualistischer Assoziationen. Die große Mehrheit der bisher untersuchten Symbiosen zwischen Insekten und Mikroorganismen stellen Interaktionen dar, in denen die Wirte durch die Symbionten mit essentiellen Nährstoffen versorgt werden. Es sind jedoch auch einige Fälle bekannt, in denen symbiontische Bakterien eine wichtige Rolle für die intraspezifische olfaktorische Kommunikation spielen oder zur Verteidigung gegen Pathogene oder Parasitoide dienen. Die vorliegende Arbeit untersucht eine hoch spezialisierte Assoziation zwischen einer Grabwespen-Art, dem Europäischen Bienenwolf (Philanthus triangulum, Hymenoptera, Crabronidae), und Bakterien aus der Familie der Actinomyceten. Die bakteriellen Symbionten sind an einem einzigartigen Ort zu finden: Sie werden in den Reservoiren spezialisierter Antennendrüsen weiblicher Bienenwölfe kultiviert. Das Weibchen sezerniert vor der Eiablage große Mengen dieser Bakterien in die unterirdischen Brutkammern. Wenn die Bienewolf-Larve einige Tage später ihre Nahrungsaufnahme an den von der Mutter als Nahrungsvorrat bereitgestellten Honigbienen beendet hat, nimmt sie die Bakterien auf und spinnt sie in ihren Kokon mit ein. Dort erfüllen die Symbionten eine wichtige Funktion, indem sie den Schimmelbefall herabsetzen und dadurch die Überlebenschancen der Larve im Kokon während der langen und gefährlichen Winterruhe signifikant erhöhen. Experimente, in denen Bienenwolf-Weibchen ohne die Bakterien aufgezogen wurden, und Beobachtungen an Bienenwolf-Larven deuten darauf hin, dass die Symbionten vertikal von der Mutter an die Töchter weitergegeben werden. Vermutlich werden die Bakterien während des Schlupfes oder kurz davor vom Kokon in die Antennendrüsen-Reservoire aufgenommen. Phylogenetische Untersuchungen von Wirten und Symbionten sowie Transfer-Experimente mit den Bakterien wären notwendig, um herauszufinden, ob ein horizontaler Austausch der Symbionten zwischen verschiedenen Bienenwolf-Arten möglich ist. Genetische Analysen zeigen, dass die Symbionten einer unbeschriebenen Art der Gattung Streptomyces innerhalb der Actinomyceten angehören. 16s rDNA Primer und eine fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Sonde wurden entwickelt, um die Bienenwolf-Symbionten mittels PCR und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) spezifisch nachweisen zu können. Mit Hilfe von PCR und Sequenzierungen der 16s rDNA konnten nah verwandte Endosymbionten in den Antennen von 28 Arten und Unterarten der Gattung Philanthus festgestellt werden, nicht aber in anderen Gattungen der Unterfamilie Philanthinae (Aphilanthops, Clypeadon, Cerceris), so dass die Symbiose auf die Gattung Philanthus beschränkt zu sein scheint. Phylogenetische Untersuchungen auf der Grundlage nahezu kompletter 16s rDNA-Sequenzen belegen, dass die Symbionten aller analysierten Bienenwolf- Arten eine monophyletische Gruppe innerhalb der Gattung Streptomyces bilden, was darauf hindeutet, dass die Symbiose hoch spezifisch ist und wahrscheinlich das Ergebnis einer langen Koevolution und Kospeziation darstellt. Anhand von Sequenzunterschieden zwischen den Symbionten lässt sich das Alter der Assoziation zwischen Philanthus und Streptomyces auf etwa 26-67 Millionen Jahre schätzen, was der Entstehung der Gattung Philanthus entsprechen könnte. Auf der Basis von 16s rDNA Sequenzen und Ultrastruktur-Daten wurden die Antennensymbionten der Bienenwölfe als neues Taxon ‚Candidatus Streptomyces philanthi’ beschrieben, wobei die Symbionten verschiedener Wirtsarten als Ökotypen behandelt und nach der Wirtsart benannt wurden (z.B. ‚Candidatus Streptomyces philanthi triangulum’). Wie die Bakterien von der Assoziation mit Bienenwölfen profitieren, ist noch unklar. Auf jeden Fall wird ihnen vom Wirt eine unbesetzte und wahrscheinlich konkurrenzfreie ökologische Nische in den Antennen sowie eine zuverlässige Weitergabe an die nächste Generation garantiert. Außerdem sprechen einige Hinweise für eine Versorgung der Bakterien mit Nährstoffen durch den Bienenwolf: (1) Weibchen legen manchmal mehrere Brutkammern pro Tag an und sezernieren jedes Mal große Mengen an Bakterien; die Bakterien müssen sich also in den Drüsen-Reservoiren schnell vermehren, um den Vorrat an Symbionten wieder aufzufüllen. (2) Die Reservoire sind von Typ 3-Drüsenzellen umgeben, die die Bakterien mit Nährstoffen versorgen könnten. (3) Eine der Reservoir-Wände weist eine netzartige Struktur auf, die möglicherweise den Eintritt von Hämolymphe und damit von Nährstoffen in das Reservoir zulässt. Dies wird durch chemische Analysen der Kohlenwasserstoffe in der Hämolymphe und in dem Antennendrüsen-Sekret untermauert, die sehr ähnliche Zusammensetzungen aufweisen. Die Assoziation zwischen Bienenwölfen und Streptomyceten stellt den ersten bekannten Fall einer Symbiose dar, bei der Bakterien in den Antennen von Insekten kultiviert werden, und sie repräsentiert eines von wenigen Beispielen für Actinomyceten als Symbionten von Insekten. Weitere Untersuchungen evolutionärer und ökologischer Aspekte dieser Symbiose werden wertvolle Erkenntnisse über die Bedeutung von Actinomyceten für die Pathogen-Abwehr bei Insekten liefern und könnten sogar zur Entdeckung neuer Sekundärmetabolite mit antibiotischen Eigenschaften für die Verwendung in der Humanmedizin führen. CHEMISCHE KOMMUNIKATION UND PARTNERWAHL BEIM EUROPÄISCHEN BIENENWOLF Chemische Signale stellen sowohl die älteste als auch die am weitesten verbreitete Form von Kommunikation zwischen Organismen dar. Bei Insekten spielen Pheromone eine essentielle Rolle für die intraspezifische Kommunikation, und eine Vielzahl aktueller Untersuchungen belegt die Bedeutung olfaktorischer Signale für die Balz und Paarung. Die meisten dieser Studien konzentrieren sich jedoch auf Weibchen-Pheromone, während von Männchen produzierte Pheromone trotz ihrer ökologischen und evolutionären Bedeutung für die Partneranlockung und Partnerwahl bisher wenig Beachtung gefunden haben. Männchen des Europäischen Bienenwolfes etablieren und verteidigen Territorien, die sie mit einem Kopfdrüsen-Sekret markieren. Dieses Sekret wirkt höchstwahrscheinlich als ein Sex- Pheromon und lockt paarungsbereite Weibchen an. Da Männchen-Territorien meist aggregiert in der Nähe von Weibchennestern auftreten, haben die Weibchen die Möglichkeit, zwischen verschiedenen potenziellen Paarungspartnern zu wählen. Die chemischen Analysen der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Zusammensetzung und Menge des männlichen Markierpheromons vom Verwandtschaftsgrad, der Herkunft, dem Alter und der Größe der Männchen abhängen. Das Pheromon beinhaltet demnach Informationen über eine Vielzahl von Eigenschaften der Männchen, die für die Weibchenwahl von Bedeutung sein könnten. Sowohl die genetische Distanz („optimal outbreeding“) als auch die allgemeine genetische Qualität („good genes“) eines Männchens könnte die Partnerwahl der Bienenwolf-Weibchen beeinflussen. In dieser Arbeit für den Europäischen Bienenwolf entwickelte polymorphe Mikrosatelliten legen den Grundstein für Vaterschaftsanalysen und ermöglichen so die Durchführung und Auswertung von Experimenten zur Weibchenwahl bei dieser Art.
While beneficial sponge-microbe associations have received much attention in recent years, less effort has been undertaken to investigate the interactions of sponges with potentially pathogenic microorganisms. Thus, the aim of this study was to examine two selected Caribbean disease conditions, termed “Sponge Orange Band” and “Sponge White Patch”, via ecological and molecular methods. Sponge Orange Band (SOB) disease affects the prominent Caribbean barrel sponge Xestospongia muta that is counted among the high-microbial-abundance (HMA) sponges, whereas Sponge White Patch (SWP) disease affects the abundant rope sponge Amphimedon compressa that belongs to the low-microbial-abundance (LMA) sponges. I have documented for both Caribbean sponge diseases a disease progression going along with massive tissue destruction as well as loss of the characteristic microbial signatures. Even though new bacteria were shown to colonize the bleached areas, the infection trials revealed in both cases no indication for the involvement of a microbial pathogen as an etiologic agent of disease leaving us still in the dark about the cause of Sponge Orange Band as well as Sponge White Patch disease.
Mechanisms and adaptive significance of interspecific associations between tropical ant species
(2009)
Aggression between ants from different colonies or species is ubiquitous. Exceptions to this rule exist in the form of supercolonies (within a species) and interspecific associations (between species). Probably the most intimate interspecific association is the parabiosis, where two ant species live together in a common nest. They keep their brood separate but jointly use trails and often share food resources. Parabioses are restricted to few species pairings and occur in South American and Southeast Asian rainforests. While the South American parabioses have been studied, albeit poorly, almost nothing is known about their Southeast Asian counterparts. My PhD project focuses on Southeast Asian parabioses between the myrmicine Crematogaster modiglianii Emery 1900 and the considerably larger formicine Camponotus rufifemur Emery 1900. The two species frequently nest together in hollow trees in the tropical lowland rainforest of Borneo. The basic question of my PhD project is why these two species live together. I investigated both proximate and ultimate aspects of this question. For comparative purposes, I included studies on a trail-sharing association in the same habitat. On the proximate level, I investigated which mechanisms facilitate tolerance towards hetero-spe¬ci¬fic nestmates. Ants generally discriminate nestmates from non-nestmates via cuticular hydro¬carbons that function as colony recognition cues. I studied the specificity of nestmate recognition within and between the two parabiotic species. Using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), I analyzed the cuticular substances in both ant species to find potential differences to non-parabiotic species, and to estimate the substance overlap among the two species. A high substance overlap would e.g. suggest that interspecific tolerance is caused by chemical mimicry. Finally, bioassays were conducted to evaluate the function of different cuticular compounds. Interspecific tolerance in the two parabiotic species was species-specific but not colony-specific. Ca. rufifemur tolerated all Cr. modiglianii individuals, even those from foreign colonies, but strongly attacked workers of other Crematogaster species. Cr. modiglianii, in turn, tolerated Ca. rufifemur workers of certain foreign colonies but attacked those of others. Chemical analyses revealed two sympatric, chemically distinct Ca. rufifemur varieties (‘red’ and ‘black’) with almost no hydrocarbon overlap. Cr. modiglianii only tolerated foreign Ca. rufifemur workers if they belonged to the same chemical variety as their own Ca. rufifemur partner. It also attacked other, non-parabiotic Camponotus species. Thus, reciprocal interspecific tolerance was restricted to the species Cr. modiglianii and Ca. rufifemur. Ca. rufifemur frequently tolerated conspecific non-nestmates of the same chemical variety. Minor workers were more often tolerated than majors, possibly because they possess two to three times lower hydrocarbon quantities per body surface than majors. In contrast, Cr. modiglianii nearly always attacked conspecific non-nestmates. Both species possessed hydrocarbons with considerably higher chain lengths than congeneric, non-parabiotic ant species. Long-chain hydrocarbons are less volatile than shorter ones and thus harder to perceive. They may thus considerably facilitate interspecific tolerance. Moreover, up to 98% of the cuticular hydrocarbons in Ca. rufifemur were methylbranched alkenes, which are highly unusual among insect cuticular hydrocarbons. Cr. modiglianii and Ca. rufifemur had almost no hydrocarbons in common, refuting chemical mimicry as a possible cause of interspecific tolerance. The only hydrocarbons common to both species were two methylbranched alkenes, which constituted 89% of the ‘red’ Ca. rufifemur hydrocarbon profile and also occurred in those Cr. modiglianii colonies that lived together with this Ca. rufifemur variety. Cr. modiglianii presumably acquired these two compounds from its red Ca. rufifemur partner. Cr. modiglianii was significantly less aggressive towards foreign Cr. modiglianii workers that were associated with the same Ca. rufifemur variety than to those associated with the respective other one. Hence, this species seemed to use recognition cues acquired from its parabiotic partner. Apart from hydrocarbons, both species possessed a set of hitherto unknown substances on their cuticle. The quantitative composition of the unknown compounds varied between parabiotic nests but was similar among the two species of a nest. They are probably produced in the Dufour glanf of Cr. modiglianii and transferred to their Ca. rufifemur partner. Possible transfer mechanisms include interspecific trophallaxis and ‘mounting behaviour’, where Cr. modiglianii climbed onto Ca. rufifemur workers without being displaced. Although the composition of the unknown compounds greatly varied between nests, they did not function as nestmate recognition cues since both species used hydrocarbons for nestmate recognition. However, the unknown compounds significantly reduced aggression in Ca. rufifemur. The ultimate, i.e. ecological and evolutionary aspects of my PhD research deal with potential costs and benefits that Cr. modiglianii and Ca. rufifemur may derive from the parabiotic association, their interactions with other species, and population genetic analyses. Additional studies on a trail-sharing association between three other ant species deal with two possible mechanisms that may cause or facilitate trail-sharing. Whether parabioses are parasitic, commensalistic, or mutualistic, is largely unknown and depends on the costs and benefits each party derives from the association. I therefore investigated food competition (as one of the most probable costs), differentiation of foraging niches (which can reduce competition), and several potential benefits of the parabiotic way of life. Besides, I studied interactions between the ant species and the hemiepiphyte Poikilospermum cordifolium. The foraging niches of the two species differed regarding foraging range, daily activity pattern, and food preferences. None of the two species aggressively displaced its partner species from baits. Thus, interference competition for food seemed to be low or absent. For both ant species, a number of benefits from the parabiotic lifestyle seem possible. They include interspecific trail-following, joint nest defence, provision of nest space by the partner species, food exchange via trophallaxis, and mutual brood care. If an ant species follows another species’ pheromone trails, it can reach food resources found by the other species. As shown by artificial extract trails, Ca. rufifemur workers indeed followed trails of Cr. modiglianii but not vice versa. Thus, Ca. rufifemur benefited from Cr. modiglianii’s knowledge on food sources (informational parasitism). In turn, Cr. modiglianii seemed to profit from nest defence by Ca. rufifemur. Ca. rufifemur majors are substantially larger than Cr. modiglianii workers. Although Cr. modiglianii often effectively defended the nest as well, it seemed likely that this species derived a benefit from its partner’s defensive abilities. In neotropical parabioses (ant-gardens), mutualistic epiphytes play an important role in providing nest space. The neotropical Camponotus benefits its Crematogaster partner by planting epiphyte seeds, for which Crematogaster is too small. Similarly, the Bornean parabioses often were inhabited by the hemiepiphyte Poikilospermum cordifolium (Barg.-Petr.) Merr (Cecropiaceae). P. cordifolium seedlings, saplings and sometimes larger indivi¬duals abundantly grew at the entrances of parabiotic nests. However, P. cordifolium provides no additional nest space and, apart from nutritive elaiosomes, perianths, and extrafloral nectar probably plays a less important role for the ants than the neotropical epiphytes. In conclusion, the parabiosis is probably beneficial to both species. The main benefits seem to be nest defence (for Cr. modiglianii) and interspecific trail-following (for Ca. rufifemur). However, Ca. rufifemur seems to be more dependent on its partner than vice versa. For both parabiotic species, I analyzed mitochondrial DNA of ants from different regions in Borneo. My data suggest that there are four genetically and chemically distinct, but closely related varieties of Camponotus rufifemur. In contrast, Crematogaster modiglianii showed high genetic differentiation between distant populations but was not differentiated into genetic or chemical varieties. This argues against variety-specific cocladogenesis between Cr. modiglianii and Ca. rufifemur, although a less specific coevolution of the two species is highly likely. In Bornean rainforests, trail-sharing associations of Polyrhachis (Polyrhachis) ypsilon Emery 1887 and Camponotus (Colobopsis) saundersi Emery 1889 are common and often include further species such as Dolichoderus cuspidatus Smith 1857. I investigated a trail-sharing association between these three species and studied two mechanisms that may cause or facilitate these associations: interspecific trail-following, i.e. workers following another species’ pheromone trail, and differential inter¬specific aggression. In trail-following assays, D. cuspidatus regularly followed extract trails of the other two species, thus probably parasitizing on their information on food sources. In contrast, only few P. ypsilon and Ca. saundersi workers followed hetero¬speci¬fic extract trails. Hence, the association between P. ypsilon and Ca. saundersi cannot be ex¬plained by foragers following heterospecific trails. In this case, trail-sharing may originate from few scout ants that do follow heterospecific pheromone trails and then lay their own trails. Interspecific aggression among P. ypsilon, Ca. saundersi and D. cuspidatus was strongly asymmetric, Ca. saundersi being submissive to the other two species. All three species discriminated between heterospecific workers from the same and a distant trail-sharing site. Thus, it seems likely that the species of a given trail-sharing site habituate to one another. Differential tolerance by dominant ant species may be mediated by selective habituation towards submissive species, and thereby influence the assembly of trail-sharing associations.
Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, ähnlich den Symbionten von Blattläusen, hauptsächlich Gene der Aminosäurebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell bestätigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der dynamischen Interaktion der beiden Partner während des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem während der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein könnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus während der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgeklärt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in späteren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschränkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. Übereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am höchsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gefüllte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene für molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die möglicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminosäuren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem höheren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begründet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte bestätigt werden, dass die Faktoren mit der höchsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich mögliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell bestätigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angehören, ähnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf übergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus späten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erhöhte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminosäuren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge benötigt werden, während die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies äußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Veränderung der Symbiontenzahl übertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch während der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts über die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen Fähigkeiten der Bakterien stellen möglicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bedürfnissen des Wirtes verändert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose führen. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose für einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabhängige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolutionären Erfolg dieser Ameisengattung erklären könnte. 
Schwämme (Phylum Porifera) sind der älteste rezente Tierstamm der Erde. Insbesondere marine Vertreter dieser sessilen Invertebraten sind oftmals mit einem mikrobiellen Konsortium assoziiert, welches hochgradig wirtsspezifisch und phylogenetisch divers ist. Die Biomasse dieser Mikroflora kann dabei rund die Hälfte der Masse eines Schwamms ausmachen. Die Komplexität des Konsortiums sowie der Mangel an kultivierbaren Vertretern der Schwamm-spezifischen Kladen erschwert dabei eine gezielte funktionelle Charakterisierung. Von besonderem Interesse hierbei ist das exklusiv in marinen Schwämmen vorzufindende Candidatus Phylum Poribacteria, für das bislang kein kultivierter Vertreter vorliegt. Die metabolisch aktiven und hochabundanten Poribakterien liegen in der extrazellulären Matrix des Schwammes vor und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Nukleoid-ähnlichen intrazellulären Struktur aus. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, neue Einzelzell-basierte Methoden auf das Gebiet der funktionellen Charakterisierung von Bakterien anzuwenden, welche spezifisch mit dem mediterranen Schwamm Aplysina aerophoba assoziiert sind. Dabei wurden sowohl kultivierungs-abhängige, als auch kultivierungs-unabhängige Versuchsansätze verfolgt. Das Hauptaugenmerk dieser Studien lag dabei auf dem Candidatus Phylum Poribacteria. Während auf dem ‚dilution-to-extinction‘-Prinzip beruhende Hochdurchsatz-Kultivierungen nicht zum Erhalt einer Schwammsymbionten-Reinkultur führten, konnten durch eine Kombination aus FACS-Vereinzelung von Schwamm-assoziierten Bakterien und anschließenden Einzel-Genom-Amplifizierungen (‚whole genome amplifications‘) umfassende Einblicke in die metabolischen Kapazitäten von Schwammsymbionten gewonnen werden. Ferner gelang durch die Anwendung dieser neuen kultivierungs-unabhängigen Methode eine spezifische Verknüpfung von Phylogenie und Funktion Schwamm-assoziierter, nicht-kultivierbarer Bakterien. So konnte im Rahmen dieser Dissertation eine neue nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) einem Vertreter einer Schwamm-spezifischen Chloroflexi-Klade zugewiesen werden. Ferner gelang die Zuordnung einer exklusiv in marinen Schwämmen vorgefundenen Polyketidsynthase (Sup-PKS) zu den Poribacteria. Die Klonierung von hochmolekularer, Einzel-Genom-amplifizierter DNA in Cosmide gewährte zudem Einblicke in den genomischen Kontext dieser, mit dem bakteriellen Sekundärmetabolismus assoziierten Gene. Die Pyrosequenzierung eines amplifizierten, von einem einzelnen Poribakterium abstammenden Genoms führte zudem zum Erhalt von rund zwei Megabasen an genetischer Information über diese Schwammsymbionten. Dadurch wurden detaillierte Informationen über den poribakteriellen Primär- und Sekundärstoffwechsel gewonnen. Die Auswertung der automatisch annotierten 454-Daten erlaubte die Rekonstruktion von Stoffwechselwegen, so z.B. der Glykolyse oder des Citratzyklus und bestätigte das Vorhandensein eines Sup-PKS-Gens im poribakteriellen Genom. Ferner konnten Gemeinsamkeiten mit den Schwesterphyla Planctomycetes, Chlamydiae und Verrucomicrobia gefunden werden. Zudem zeigte die vergleichende Analyse mit einem poribakteriellen Referenzklon aus einer bestehenden Metagenombank die genomische Mikroheterogenität innerhalb dieses Phylums. Nicht zuletzt konnte die Auswertung der poribakteriellen 454-Sequenzierung eine Reihe von möglichen Symbiose-Determinanten aufdecken, die beispielsweise am Austausch von Metaboliten zwischen den Interaktionspartnern beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit stellen die Basis für eine gezielte und detaillierte funktionelle Beschreibung einzelner Bakterien innerhalb komplexer mikrobieller Konsortien dar, wie sie in marinen Schwämmen vorzufinden sind. Dieser Studie gewährte erstmalig umfassende Einblicke in das genomische Potential der nicht-kultivierten, Schwamm-assoziierten Poribacteria. Weiterführende Einzelzell-basierte Experimente werden in Zukunft dazu beitragen, das Bild von der Interaktion zwischen Bakterien und eukaryontischen Wirten zu komplettieren.
Within my PhD project I gained several novel insights into the poorly investigated
symbiotic world of fungus farming ambrosia beetles and their bark beetle ancestors,
where I especially focused on physiological interactions and capabilities of
associated fungal symbionts. Here, (i) I could confirm the association of mutualistic
Phialophoropsis fungi with the ambrosia beetle genus Trypodendron and found hints
for a possible new Phialophoropsis species in T. signatum and T. domesticum.
Moreover, I could show that mutualistic fungi of Trypodendron ambrosia beetles are
able to decompose major woody polysaccharides such as cellulose and xylan.
Additionally, (ii) I provided the first images using micro-computed tomography (µCT)
of the formerly unknown structure of the mycetangium of Trypodendron leave. (iii) I
could confirm a general tolerance towards ethanol in mutualistic ambrosia beetle
fungi, while antagonistic fungi as well as most examined fungal bark beetle
associates (e.g. possibly tree-defense detoxifying species) were highly sensitive to
even low concentrations of ethanol. Further, (iv) I found that natural galleries of
ambrosia beetles are highly enriched with several biologically important elements
(such as N, P, S, K, Mg) compared to the surrounding woody tissue and suggest that
mutualistic fungi are translocating and concentrating elements from the immediate
surrounding xylem to the beetles galleries. Furthermore, (v) I could show that various
fungi associated with bark and ambrosia beetles (mutualists, possibly beneficial
symbionts) are emitting several volatile organic compounds mostly within aliphatic
and aromatic alcohols and esters, while non-mutualistic and free living species were
generally emitting a lower number and amount of volatiles. Finally, especially bark
and ambrosia beetle fungi were found to incorporate several amino acids, from which
some are especially important for the production of certain volatile organic
compounds. Amino acid content also indicated a higher nutritional value for certain
species. Here, I propose that especially volatile organic compounds are widespread
key players in maintaining various symbioses between fungi and beetles, as already
proven by a recent study on the bark beetle Ips typographus (as well as for some
other bark beetle-fungus symbioses, see summary in Kandasamy et al. 2016) and
also suggested for ambrosia beetles.
Interaktionen zwischen Insekten und Pflanzen können auf chemischen oder mechanischen Faktoren beruhen. Mechanische Faktoren spielen eine besonders wichtige Rolle bei den Fallen karnivorer Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle mechanischer Faktoren in der Interaktion zwischen der Kannenpflanze Nepenthes bicalcarata und der Ameise Camponotus schmitzi aufzuklären, bei der Ameisen Gegenanpassungen zu spezialisierten pflanzlichen Fangstrukturen entwickelt haben. Im Rahmen meiner Arbeit habe ich mich mit den Fragen beschäftigt, 1) welche Kannenstrukturen und welche Mechanismen für den Fang von Arthropoden wichtig sind und 2) welche speziellen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen für das Leben auf ihrer karnivoren Wirtspflanze besitzen. Bisher wurde angenommen, dass Nepenthes-Kannen Tiere mit Hilfe von rutschigen Wachskristallschichten fangen. Ich konnte zeigen, dass ein weiterer, bisher unbekannter Fangmechanismus existiert, welcher auf speziellen Oberflächeneigenschaften des Kannenrandes (Peristom) und "Insekten-Aquaplaning" basiert. Das Peristom besitzt eine regelmäßige Mikrostruktur, welche dafür sorgt, dass die Oberfläche vollständig mit Wasser benetzbar ist, so dass sie bei feuchter Witterung von homogenen Flüssigkeitsfilmen überzogen ist. Auf dem trockenen Peristom können Ameisen ohne Schwierigkeiten laufen und Nektar von den am inneren Peristomrand gelegenen Nektarien ernten. Wird die Oberfläche aber beispielsweise durch Regen nass, rutschen die meisten Tiere ab und stürzen in die Kanne. Messungen der Reibungskräfte von Weberameisen (Oecophylla smaragdina) auf dem Peristom von N. bicalcarata zeigten, dass Flüssigkeitsfilme auf der Oberfläche die Anhaftung der Haftorgane (Arolien) verhindern, und dass die Mikrostruktur des Peristoms auch den Einsatz der Krallen unterbindet. Versuche an Nepenthes alata zeigten darüber hinaus, dass dieser Fangmechanismus des Peristoms auch für Nepenthes-Arten mit wachsbereifter Kanneninnenwand essentiell, und die Wachsschicht eher für die Retention gefangener Tiere wichtig ist. Zur Analyse der ökologischen Auswirkungen des "Aquaplaning"-Fangmechanismus habe ich die Peristomfeuchte von Nepenthes rafflesiana var. typica-Kannen zeitgleich mit meteorologischen Daten im Feld kontinuierlich aufgezeichnet und mit Experimenten zur Beurteilung der Fangeffizienz der Kannen kombiniert. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass die Kannen abhängig vom Befeuchtungsgrad des Peristoms zeitweise sehr effiziente Fallen mit Fangraten von 80% sein können, während sie zu anderen Zeiten vollkommen ineffizient sind. Die Variation der Peristomfeuchte wird durch Regen, Kondensation und von den Peristomnektarien sezerniertem Nektar verursacht. Es ist zu vermuten, dass die nur zeitweise und unvorhersehbare Aktivierung der Nepenthes-Kannenfallen durch Nässe der Evolution von Vermeidungsstrategien bei Beutetieren entgegenwirkt. Im Rahmen der Untersuchungen, welche mechanischen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen für das Leben auf N. bicalcarata besitzen habe ich mich auf die Fragen konzentriert, wie es den Ameisen gelingt den Peristom-Fangmechanismus zu umgehen und welche Anpassungen sie besitzen um in der Kannenflüssigkeit tauchend und schwimmend nach Nahrung zu suchen. Im Gegensatz zu generalistischen Arten stürzen C. schmitzi-Ameisen auf dem nassen Peristom nicht ab. Durch selektive Manipulation der tarsalen Haftstrukturen konnte ich demonstrieren, dass die Arolien für die Peristomlauffähigkeit der C. schmitzi-Ameisen eine wesentliche Rolle spielen. Für das Furagieren in der Kannenflüssigkeit verfügen C. schmitzi-Ameisen über ein sich wiederholendes, stereotypes Verhaltensmuster, welches aus einer Unterwasserlauf- und einer Oberflächenschwimmphase besteht. Meine Untersuchungen dieses Verhaltensmusters zeigten, dass die Ameisen am Ende der Unterwasserlaufphase mit Hilfe ihres stets vorhandenen Auftriebs zur Flüssigkeitsoberfläche aufsteigen. Dabei taucht ein Teil ihres Hinterleibs aus der Kannenflüssigkeit auf, was den Ameisen die Sauerstoffaufnahme aus der Luft ermöglicht. Nach dem Auftauchen schwimmen C. schmitzi-Ameisen mittels schneller Beinbewegungen an der Oberfläche der Kannenflüssigkeit. Dabei ähnelt die Bewegungskoordination ihrer Beine dem bei Ameisen für die Fortbewegung an Land typischen Dreifußgang. Ein Vergleich der Kinematik von schwimmenden und laufenden C. schmitzi-Ameisen hat gezeigt, dass schwimmende Ameisen ihre Beine in der Schlagphase mit einer höheren Winkelgeschwindigkeit als in der Rückholphase bewegen, während dies bei den laufenden Tieren genau umgekehrt ist. Ferner strecken schwimmende Ameisen ihre Beine während der Schlagphase weiter aus als in der Rückholphase, wohingegen laufende Ameisen in beiden Bewegungsphasen vergleichbare Beinradien aufweisen. Dies lässt den Schluss zu, dass die Schwimmkinematik der C. schmitzi-Ameisen eine abgewandelte Form ihrer Laufkinematik darstellt, welche für die Erzeugung von Vortrieb im Wasser optimiert wurde.