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Experimentelle FACS-Flow-Analysen im Kontext einer radiogenen Lungenfibrose zur Veränderung der Zellproliferation von Maus-Lungen-Fibroblasten unter dem Einfluss von Kulturüberständen bestrahlter Fibroblasten. Additiv einzelne Versuche mit Antikörperzugabe gegen TGF-beta zur Evaluation eines hemmenden Effektes auf eine postulierte Arretierung der Fibroblasten in der G1-Phase der Zellteilung durch die Zytokine der Kulturüberstände bestrahlter Maus-Lungen-Fibroblasten.
Die Knochenhomöostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. Während die Osteoblasten für den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorgänge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine Störung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose führen. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen über zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein“-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signalübertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Deren Aktivierung führt zu einem intrazellulären Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellulär, membranständig und intrazellulär reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellulären Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugehörigkeit zur DAN-Familie zunächst fälschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors“ gehören. Über den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufklärung mittels NMR-Spektroskopie ergab für Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop“-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und ähneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verläuft („Loop“), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente ermöglichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann für die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivität neutralisierende Antikörper AbD09097, hochinteressante Ansätze für neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen.
Echinococcus multilocularis besitzt als Lebergewebe - infiltrierender Parasit und Erreger der Alveolären Echinokokkose evolutionär konservierte Faktoren des TGF-β / BMP Signalsystems, die im Konzept der hormonellen Wirt - Parasit Kreuzkommunikation nicht nur hinsichtlich des Wirts - Einflusses auf die Entwicklung des Parasiten sondern auch umgekehrt in Bezug auf Immunantwort und Physiologie des Wirts eine mögliche regulierende Funktion besitzen. Die vorliegende Arbeit befasst sich primär mit den Auswirkungen von TGF-β / BMP Signaling auf den Fuchsbandwurm E. multilocularis. Dazu wurde zunächst durch Immunlokalisation das Vorliegen aller Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren während einer natürlich aufgetretenen Alveolären Echinokokkose überprüft, sowie die funktionelle Interaktion von EmRSK3 und EmRSK4 mit humanem TGF-β1 in vitro nachgewiesen. Mit Hilfe von humanen Zytokinen (BMP2 und TGF β1) und Rezeptor - spezifischen Inhibitoren (SB431542, Dorsomorphin und LY364947) wurde die Rolle von TGF β / BMP Signaling in Bezug auf Vitalität, Wachstum, Differenzierung und Regeneration von E. multilocularis in verschiedenen Stadien untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von humanem BMP2 und von SB431542 auf die Genexpression in E. multilocularis analysiert. Die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation durch Echinokokken Faktoren des TGF-β / BMP Signaling wurde ebenfalls adressiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Echinokokken TGF-β / BMP Rezeptoren in vitro durch sekretierte Faktoren aus Metazestoden aktiviert werden können. Auf Basis von Genomsequenzierungsdaten wurden zudem weitere Komponenten des TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis, wie die bisher unbekannten TGF β / BMP Homologe EmBMP2 und EmAct, die Noggin-like Homologe EmNlg1 und 2, ein I-Smad (EmSmadF) sowie ein zweiter BR-Smad (EmSmadE) identifiziert, strukturell charakterisiert und die jeweilige Genexpression in verschiedenen Stadien überprüft. EmSmadE wurde zudem in weiterführenden Studien funktionell charakterisiert. Fragestellungen bezüglich der Spezifität, Funktionalität und Möglichkeit der konstitutiven Aktivierung von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis wurden auf Basis von EmSmadA, EmRSK3 und EmRSK3b in weiteren molekularbiologischen Studien untersucht und dienen dem tieferen Verständnis von TGF-β / BMP Signaling. In der vorliegenden Arbeit konnten damit alle grundlegenden Faktoren von TGF-β / BMP Signaling in E. multilocularis identifiziert werden und es wurden erstmals die eindeutige Sensierung von Wirts TGF-β / BMP Zytokinen durch Metazestoden sowie die Möglichkeit einer intra - Spezies Kommunikation über Echinokokken TGF-β / BMP Faktoren belegt. Zusätzlich deuten die neu identifizierten potenziell sekretierten TGF-β / BMP Faktoren auf eine mögliche Beeinflussung von Physiologie und Immunantwort des Wirts durch Echinokokken TGF-β / BMP Zytokine hin.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand’s point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors’ point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability.
Das Zytokin Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) gehört als Mitglied der Transforming Growth Factor ß-Superfamilie zu einer großen Gruppe eng verwandter Wachstums- und Differenzierungsfaktoren. Es spielt eine entscheidende Rolle bei Bildung und Regeneration von Knorpel und Knochen und während verschiedener Prozesse der embryonalen Entwicklung. Durch Sezernierung des Proteins und anschließende Diffusion in der extrazellulären Matrix (EZM) ausgehend vom Ort der Sekretion unterliegt sein Wirkungsgrad einem abnehmenden Konzentrationsgradienten. BMP-2 bindet neben der hochaffinen Bindung an seinen spezifischen Rezeptor unter anderem auch an die extrazelluläre Matrix. So konnte in Vorarbeiten bereits durch Deletion der basischen Heparinbindungsstelle des BMP-2, die sich im N-terminalen Bereich befindet, eine Wirkungsverstärkung des Proteins in einem in vitro- Experiment, dem Hühnergliedmaßentest, erreicht werden, da die konkurrierende Bindung an Heparinbindungsstellen der EZM wegfällt. Im Tiermodell konnte jedoch ein genau umgekehrter Effekt dieser Mutante im Vergleich mit dem Wildtyp gezeigt werden, da in vivo die Diffusion des Moleküls durch Bindung an die EZM begrenzt und es so lokal an seinem Wirkungsort konzentriert wird. Von diesen Vorbefunden ausgehend war das Ziel der Arbeit die Klonierung und Expression von Mutanten des BMP-2, bei denen durch schrittweise Modifizierung der Heparinbindungsstelle die Bindung des Proteins an Heparin und deren Einfluß auf die Rezeptorbindung charakterisiert werden sollte. Dazu wurden zwei Mutanten des BMP-2 mit Verdopplung eines bzw. beider basischer Aminosäuretripletts kloniert, da diesem basischen Bereich im N-Terminus die eigentliche Bindung an Heparin zugeschrieben wird. Nach Expression, Renaturierung und säulenchromatographischer Aufreinigung der Proteine konnte in dieser Arbeit in drei verschiedenen funktionellen in vitro-Tests eine abnehmende Wirkung der Mutanten gezeigt werden. Neben dem biophysikalischen Nachweis der apparenten Affinitäten der Mutanten zu Rezeptor und Matrix in Biacore-Messungen konnte die Änderung des Wirkungsgrades auch in einem Zellkulturassay mit einer Maus-Fibroblasten-Zellinie durch Messung der Alkalischen Phosphatase und im Hühnergliedmaßentest gezeigt werden. In in vivo Experimenten bleibt eine entsprechende zu erwartende Wirkungsverstärkung dieser beiden Mutanten nachzuweisen, die im Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz bei gewünschtem Ersatz zerstörten Knochens relevant werden könnte.
BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.
While TGF-β is able to regulate miRNA expression in numerous cell types, TGF-β-dependent changes in the miRNA profile of CD8+ T cells had not been studied before. Considering that TGF-β suppresses CD8+ T cell effector functions in numerous ways, we wondered whether induction of immune-regulatory miRNAs could add to the known transcriptional effects of TGF-β on immune effector molecules. In this study, we used miRNA arrays, deep sequencing and qRT-PCR to identify miRNAs that are modulated by TGF-β in human CD8+ T cells. Having found that the TGF-β-dependent downregulation of NKG2D surface expression in NK cells and CD8+ T cells does not go along with a corresponding reduction in mRNA levels, this pathway appeared to be a possible target of TGF-β-inducible miRNAs. However, this hypothesis could not be confirmed by miRNA reporter assays. Instead, we observed that DAP10 transcription is suppressed by TGF-β which in turn negatively affects NKG2D surface expression. In spite of promising preliminary experiments, technical difficulties associated with the transfection of primary NK cells and NK cell lines unfortunately precluded the final proof of this hypothesis.
Instead, we focused on the TGF-β-induced changes in the miRNome of CD8+ T cells and confirmed the induction of the miR-23a cluster members, namely miR-23a, miR-27a and miR-24 by three different techniques. Searching for potential targets of these miRNAs which could contribute to the immunosuppressive action of TGF-β in T cells, we identified and confirmed a previously unknown regulation of IFN-γ mRNA by miR-27a and miR-24. Newly generated miRNA reporter constructs further revealed that LAMP1 mRNA is a target of miR-23a. Upon modulation of the miR-23a cluster in CD8+ T cells by the respective miRNA antagomirs and mimics, significant changes in IFN-γ expression confirmed the functional relevance of our findings. Effects on CD107a/LAMP1 expression were, in contrast, rather minimal. Still, overexpression of the miR-23a cluster attenuated the cytotoxic activity of antigen-specific CD8+ T cells. Taken together, these functional data reveal that the miR-23a cluster not only is induced by TGF-β, but also exerts a suppressive effect on CD8+ T-cell effector functions, even in the absence of TGF-β signaling.
In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites.
Thrombozyten enthalten und sezernieren eine Vielzahl von Wachstumfaktoren, deren Mitwirkung an der Knochenbildung und –regeneration als gesichert gilt. Platelet-rich plasma (PRP) enthält eine hohe Thrombozytenkonzentration und somit auch dementsprechend hohe Spiegel von Wachstumsfaktoren. Ziel dieser Arbeit war eine Evaluation des Einflusses von PRP auf die Qualität und Quantität der interkorporellen knöchernen Fusion im Rahmen der ventralen Spondylodese von Wirbelkörperverletzungen mit Cage-Implantaten und autologer Spongiosa. In einer prospektiven Studie wurden 15 Patienten mit traumatischer Fraktur der BWS oder LWS ventral mit einem Cage-Implantat und autologer Spongiosa stabilisiert. Indikationsabhängig wurden additiv dorsale Fixateur interne und/oder ventrale Plattensysteme implantiert. Intraoperativ erfolgte die Kombination der autologen Spongiosa mit PRP. Dieses wurde direkt perioperativ aus max. 110 ml venösem Eigenblut des Patienten mit dem kommerziell erhältlichen GPS™-System (Biomet Deutschland GmbH, Berlin) hergestellt. Als Kontrollgruppe fungiert ein zufällig ausgewähltes Kollektiv von 20 Patienten mit traumtischer BWS- oder LWS-Fraktur. Diese wurden ebenfalls ventral mit Cage und autologer Spongiosa sowie zusätzlichen Implantaten stabilisiert, jedoch ohne den Einsatz von PRP. Im Rahmen der Nachbehandlung wurden nach durchschnittlich 8,33 Monaten (PRP-Gruppe) und 12,5 Monaten (Kontrolle) Computertomographien der instrumentierten Wirbelsäulenregion im Knochenfenster angefertigt. Anhand dieser wurde der Fusionsfortschritt exemplarisch für den linkslateralen Auftragungsbereich von Spongiosa bzw. Spongiosa/PRP um den Cage qualtitativ und quantifizierend mittles Volumetrie und Densitometrie (HU) erfasst. Es zeigte sich qualtitaiv bei 20% der PRP-Gruppe sowie 30% der Kontrollgruppe keine oder nur minimale linkslaterale Verknöcherung. Jeweils 40% wurden als durchgehend fusioniert klassifiziert. Quantifizierend ergab sich für beide Gruppen ein nahezu identischer mittlerer Volumenanteil > +100 HU (56,5 bzw. 56,6%) am linkslateralen Gesamtvolumen. Der Volumenanteil > +500 HU beträgt in der Kontrollgruppe 23,57% in der PRP-Gruppe hingegen 29,33%. Die absolute Dichte der Teilvolumina zeigt einen signifikant höheren Durchschnitsswert in der PRP-Gruppe (639,7 HU zu 514,2 HU) sowie nicht signifikant höhere Werte im Teilvolumen > +500 HU (930,7 HU zu 846 HU). Aus den VAS-Scores konnte für den gewählten Nachuntersuchungzeitraum kein signifikanter Unterschied im subjektiven, patientenbezogenen Outcome festgestellt werden. Insgesamt zeigt sich ein Trend, demnach der Einsatz von PRP eine Verbesserung der autologen Spongiosaplastik und damit der Verknöcherung um den Cage ermöglicht. Der bei Etablierung des Konzepts thrombozytärer Wachtsumsfaktoren-konzentrate zur Verbesserung der Knochenheilung erhoffte deutliche, klinische Effekt bleibt jedoch aus.