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Virotherapy using oncolytic vaccinia virus (VACV) strains is one promising new strategy for cancer therapy. We have previously reported that oncolytic vaccinia virus strains expressing an anti-VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) single-chain antibody (scAb) GLAF-1 exhibited significant therapeutic efficacy for treatment of human tumor xenografts. Here, we describe the use of oncolytic vaccinia virus GLV-1h109 encoding GLAF-1 for canine cancer therapy. In this study we analyzed the virus-mediated delivery and production of scAb GLAF-1 and the oncolytic and immunological effects of the GLV-1h109 vaccinia virus strain against canine soft tissue sarcoma and canine prostate carcinoma in xenograft models. Cell culture data demonstrated that the GLV-1h109 virus efficiently infect, replicate in and destroy both tested canine cancer cell lines. In addition, successful expression of GLAF-1 was demonstrated in virus-infected canine cancer cells and the antibody specifically recognized canine VEGF. In two different xenograft models, the systemic administration of the GLV-1h109 virus was found to be safe and led to anti-tumor and immunological effects resulting in the significant reduction of tumor growth in comparison to untreated control mice. Furthermore, tumor-specific virus infection led to a continued production of functional scAb GLAF-1, resulting in inhibition of angiogenesis. Overall, the GLV-1h109-mediated cancer therapy and production of immunotherapeutic anti-VEGF scAb may open the way for combination therapy concept i.e. vaccinia virus mediated oncolysis and intratumoral production of therapeutic drugs in canine cancer patients.
Background
Oncolytic viruses, including vaccinia virus (VACV), are a promising alternative to classical mono-cancer treatment methods such as surgery, chemo- or radiotherapy. However, combined therapeutic modalities may be more effective than mono-therapies. In this study, we enhanced the effectiveness of oncolytic virotherapy by matrix metalloproteinase (MMP-9)-mediated degradation of proteins of the tumoral extracellular matrix (ECM), leading to increased viral distribution within the tumors.
Methods
For this study, the oncolytic vaccinia virus GLV-1h255, containing the mmp-9 gene, was constructed and used to treat PC-3 tumor-bearing mice, achieving an intra-tumoral over-expression of MMP-9. The intra-tumoral MMP-9 content was quantified by immunohistochemistry in tumor sections. Therapeutic efficacy of GLV-1h255 was evaluated by monitoring tumor growth kinetics and intra-tumoral virus titers. Microenvironmental changes mediated by the intra-tumoral MMP-9 over-expression were investigated by microscopic quantification of the collagen IV content, the blood vessel density (BVD) and the analysis of lymph node metastasis formation.
Results
GLV-1h255-treatment of PC-3 tumors led to a significant over-expression of intra-tumoral MMP-9, accompanied by a marked decrease in collagen IV content in infected tumor areas, when compared to GLV-1h68-infected tumor areas. This led to considerably elevated virus titers in GLV-1h255 infected tumors, and to enhanced tumor regression. The analysis of the BVD, as well as the lumbar and renal lymph node volumes, revealed lower BVD and significantly smaller lymph nodes in both GLV-1h68- and GLV-1h255- injected mice compared to those injected with PBS, indicating that MMP-9 over-expression does not alter the metastasis-reducing effect of oncolytic VACV.
Conclusions
Taken together, these results indicate that a GLV-1h255-mediated intra-tumoral over-expression of MMP-9 leads to a degradation of collagen IV, facilitating intra-tumoral viral dissemination, and resulting in accelerated tumor regression. We propose that approaches which enhance the oncolytic effect by increasing the intra-tumoral viral load, may be an effective way to improve therapeutic outcome.
Despite the obvious clinical significance of post-stroke angiogenesis in aged subjects, a detailed transcriptomic analysis of post-stroke angiogenesis has not yet been undertaken in an aged experimental model. In this study, by combining stroke transcriptomics with immunohistochemistry in aged rats and post-stroke patients, we sought to identify an age-specific gene expression pattern that may characterize the angiogenic process after stroke. We found that both young and old infarcted rats initiated vigorous angiogenesis. However, the young rats had a higher vascular density by day 14 post-stroke. “New-for-stroke” genes that were linked to the increased vasculature density in young animals included Angpt2, Angptl2, Angptl4, Cib1, Ccr2, Col4a2, Cxcl1, Lef1, Hhex, Lamc1, Nid2, Pcam1, Plod2, Runx3, Scpep1, S100a4, Tgfbi, and Wnt4, which are required for sprouting angiogenesis, reconstruction of the basal lamina (BL), and the resolution phase. The vast majority of genes involved in sprouting angiogenesis (Angpt2, Angptl4, Cib1, Col8a1, Nrp1, Pcam1, Pttg1ip, Rac2, Runx1, Tnp4, Wnt4); reconstruction of a new BL (Col4a2, Lamc1, Plod2); or tube formation and maturation (Angpt1, Gpc3, Igfbp7, Sparc, Tie2, Tnfsf10), had however, a delayed upregulation in the aged rats. The angiogenic response in aged rats was further diminished by the persistent upregulation of “inflammatory” genes (Cxcl12, Mmp8, Mmp12, Mmp14, Mpeg1, Tnfrsf1a, Tnfrsf1b) and vigorous expression of genes required for the buildup of the fibrotic scar (Cthrc1, Il6ra, Il13ar1, Il18, Mmp2, Rassf4, Tgfb1, Tgfbr2, Timp1). Beyond this barrier, angiogenesis in the aged brains was similar to that in young brains. We also found that the aged human brain is capable of mounting a vigorous angiogenic response after stroke, which most likely reflects the remaining brain plasticity of the aged brain.
Nach einem Myokardinfarkt setzen Wundheilungsprozesse ein, um die Durchblutung wieder herzustellen und nekrotisches Muskelgewebe durch Narbengewebe zu ersetzen. Die Einsprossung neuer Kapillaren vom bestehenden Gefäßnetz aus wird als Angiogenese bezeichnet. Das dabei vermehrt exprimierte proteolytische Enzym Aminopeptidase N (APN) spielt eine entscheidende Rolle bei der Einsprossung von Endothelzellen. Beim kardialen Remodeling werden abgestorbene Myozyten mithilfe der Einwanderung von Fibroblasten durch Binde- oder Stützgewebe ersetzt, dabei übernimmt das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha (FAP) Aufgaben bei der Proliferation und Fortbewegung von Fibroblasten.
Durch ihre erhöhte Expression bei den Wundheilungs- und Remodelingprozessen nach einem Herzinfarkt stellen die Metalloprotease APN und die Serinprotease FAP molekulare Targets für die Diagnostik und Therapie dar. Als Diagnosemethode besonders geeignet ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die es ermöglicht, biochemische Prozesse in Echtzeit im zu untersuchenden Organismus zu visualisieren und zu quantifizieren. Eine als Radiopharmakon oder Tracer bezeichnete biochemische Sonde kann im Falle eines Enzyms dessen radioaktiv markiertes Substrat oder ein Inhibitor sein.
Ziel dieser Arbeit war es, spezifische APN- und FAP-affine Tracer für die nicht-invasive Untersuchung der APN- und FAP-Expression mittels PET zu entwickeln und dadurch die Rolle von APN und FAP bei Remodelingprozessen nach Myokardinfarkt besser verstehen bzw. klären zu können.
Um die Protease APN mittels PET zu untersuchen, wurden die für APN affine Verbindung NOTA-NGR (Komplexbildner + cyclisches Peptid inkl. Asparagin-Glycin-Arginin) mit dem Positronen-emittierenden Nuklid Gallium-68 (68Ga) markiert. Das Potential von 68Ga-NOTA-NGR als PET-Tracer wurde in vivo am Infarktmodell mittels Kleintier-PET untersucht und mit 68Ga-NOTA-RGD, einem zur Visualisierung des neo-angiogenetischen alphavbeta3-Integrins etablierten Tracer, verglichen. Untersuchungen ergaben, dass 68Ga-NOTA-NGR einen vielversprechenden neuen PET-Tracer für die Visualisierung und Quantifizierung der APN-Expression im Rahmen der Angiogenese nach einem Myokardinfarkt darstellt. 68Ga-NOTA-NGR zeigte eine erhöhte Aufnahme im Bereich des Myokardinfarkts im Sinne einer vermehrten Angiogenese. Die Aufnahme des Tracers in infarzierten Arealen war quantitativ höher als in der Untersuchung mit 68Ga-NOTA-RGD. In Autoradiographie-Experimenten wurde 68Ga-NOTA-NGR ex vivo untersucht. Die Akkumulation von 68Ga-NOTA-NGR im ischämischen Bereich war deutlich höher als im gesunden Myokard. Der Nachweis der unterschiedlichen Bereiche des Herzens erfolgte mit HE-Färbung.
Die Expression von APN wurde immunohistochemisch mittels spezifischer Antikörper bestätigt. Zum Vergleich wurden ebenso einige andere an der Angiogenese beteiligte Faktoren untersucht. APN stellte sich auch hier als geeignetes Target zum Nachweis der Angiogenese heraus.
Um die Protease FAP mittels PET zu untersuchen, wurden eine Reihe peptidomimetischer Inhibitoren, die die Erkennungssequenz Glycin-Prolin mit einer Carbonitril-Gruppe als elektrophiler Einheit zur kovalent-reversiblen Hemmung des Enzyms enthalten, entwickelt. Ausgehend vom N-Acetylglycin-pyrrolidin-(2S)-carbonitril als Leitstruktur wurden Inhibitoren und Vorstufen zur Radiomarkierung inkl. verschieden substituierter Benzoesäuren dargestellt. Zusätzlich wurden noch bereits bekannte Inhibitoren synthetisiert, die zum Vergleich in den Enzymassays dienten.
Drei Verbindungen zeigten gute inhibitorische Wirkung an FAP und außerdem Selektivität gegenüber DPP IV. Keine der entwickelten Verbindungen zeigte einen KI-Wert im nanomolaren Bereich, erforderlich für einen potentiellen Tracer zur in-vivo-Visualisierung einer Enzymexpression mittels PET.
Um die Inhibitoren mit der besten Hemmung an FAP zum PET-Tracer weiterzuentwickeln, mussten sie mit einem Positronenemitter markiert werden. Die Markierung erfolgte über Isotopenaustausch, bei dem nicht-radioaktives Iod am aromatischen Ring des Precursors durch das radioaktive Iod-124 (124I) substituiert wurde. Es konnten dadurch die radioiodierten Verbindungen 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril und 1-(4-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril synthetisiert werden.
Trotz der relativ niedrigen Affinität für FAP wurde das neue 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril in Ratten am Infarktmodell mittels Kleintier-PET getestet. Die Lage der ischämischen Zone wurde im Anschluss durch HE-Färbung bestimmt. In vivo zeigte sich eine nur sehr geringe Aufnahme des Radiopharmakons in der ischämischen Zone des Myokards. Damit ist 1-(2-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril kein für den gewünschten Zweck geeigneter PET-Tracer. Nichtsdestotrotz war der Ansatz vielversprechend und es wurde zum ersten Mal ein PET-Tracer dieser Art zur Untersuchung des FAP im Myokardinfarkt hergestellt.
(1) Background: C-X-C Motif Chemokine Receptor 4 (CXCR4) and Fibroblast Activation Protein Alpha (FAP) are promising theranostic targets. However, it is unclear whether CXCR4 and FAP positivity mark distinct microenvironments, especially in solid tumors. (2) Methods: Using Random Forest (RF) analysis, we searched for entity-independent mRNA and microRNA signatures related to CXCR4 and FAP overexpression in our pan-cancer cohort from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database — representing n = 9242 specimens from 29 tumor entities. CXCR4- and FAP-positive samples were assessed via StringDB cluster analysis, EnrichR, Metascape, and Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Findings were validated via correlation analyses in n = 1541 tumor samples. TIMER2.0 analyzed the association of CXCR4 / FAP expression and infiltration levels of immune-related cells. (3) Results: We identified entity-independent CXCR4 and FAP gene signatures representative for the majority of solid cancers. While CXCR4 positivity marked an immune-related microenvironment, FAP overexpression highlighted an angiogenesis-associated niche. TIMER2.0 analysis confirmed characteristic infiltration levels of CD8+ cells for CXCR4-positive tumors and endothelial cells for FAP-positive tumors. (4) Conclusions: CXCR4- and FAP-directed PET imaging could provide a non-invasive decision aid for entity-agnostic treatment of microenvironment in solid malignancies. Moreover, this machine learning workflow can easily be transferred towards other theranostic targets.
Virotherapy on the basis of oncolytic vaccinia virus (VACV) strains is a novel approach for canine cancer therapy. Here we describe, for the first time, the characterization and the use of VACV strain GLV-5b451 expressing the anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) single-chain antibody (scAb) GLAF-2 as therapeutic agent against different canine cancers. Cell culture data demonstrated that GLV-5b451 efficiently infected and destroyed all four tested canine cancer cell lines including: mammary carcinoma (MTH52c), mammary adenoma (ZMTH3), prostate carcinoma (CT1258), and soft tissue sarcoma (STSA-1). The GLV-5b451 virus-mediated production of GLAF-2 antibody was observed in all four cancer cell lines. In addition, this antibody specifically recognized canine VEGF. Finally, in canine soft tissue sarcoma (CSTS) xenografted mice, a single systemic administration of GLV-5b451 was found to be safe and led to anti-tumor effects resulting in the significant reduction and substantial long-term inhibition of tumor growth. A CD31-based immuno-staining showed significantly decreased neo-angiogenesis in GLV-5b451-treated tumors compared to the controls. In summary, these findings indicate that GLV-5b451 has potential for use as a therapeutic agent in the treatment of CSTS.
Multiple Antenatal Dexamethasone Treatment Alters Brain Vessel Differentiation in Newborn Mouse Pups
(2015)
Antenatal steroid treatment decreases morbidity and mortality in premature infants through the maturation of lung tissue, which enables sufficient breathing performance. However, clinical and animal studies have shown that repeated doses of glucocorticoids such as dexamethasone and betamethasone lead to long-term adverse effects on brain development. Therefore, we established a mouse model for antenatal dexamethasone treatment to investigate the effects of dexamethasone on brain vessel differentiation towards the blood-brain barrier (BBB) phenotype, focusing on molecular marker analysis. The major findings were that in total brains on postnatal day (PN) 4 triple antenatal dexamethasone treatment significantly downregulated the tight junction protein claudin-5, the endothelial marker Pecam-1/CD31, the glucocorticoid receptor, the NR1 subunit of the N-methyl-D-aspartate receptor, and Abc transporters (Abcb1a, Abcg2 Abcc4). Less pronounced effects were found after single antenatal dexamethasone treatment and in PN10 samples. Comparisons of total brain samples with isolated brain endothelial cells together with the stainings for Pecam-1/CD31 and claudin-5 led to the assumption that the morphology of brain vessels is affected by antenatal dexamethasone treatment at PN4. On the mRNA level markers for angiogenesis, the sonic hedgehog and the Wnt pathway were downregulated in PN4 samples, suggesting fundamental changes in brain vascularization and/or differentiation. In conclusion, we provided a first comprehensive molecular basis for the adverse effects of multiple antenatal dexamethasone treatment on brain vessel differentiation.
Downregulation of miR-221-3p expression in prostate cancer (PCa) predicted overall and cancer-specific survival of high-risk PCa patients. Apart from PCa, miR-221-3p expression levels predicted a response to tyrosine kinase inhibitors (TKI) in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) patients. Since this role of miR-221-3p was explained with a specific targeting of VEGFR2, we examined whether miR-221-3p regulated VEGFR2 in PCa. First, we confirmed VEGFR2/KDR as a target gene of miR-221-3p in PCa cells by applying Luciferase reporter assays and Western blotting experiments. Although VEGFR2 was mainly downregulated in the PCa cohort of the TCGA (The Cancer Genome Atlas) database, VEGFR2 was upregulated in our high-risk PCa cohort (n = 142) and predicted clinical progression. In vitro miR-221-3p acted as an escape mechanism from TKI in PC3 cells, as displayed by proliferation and apoptosis assays. Moreover, we confirmed that Sunitinib induced an interferon-related gene signature in PC3 cells by analyzing external microarray data and by demonstrating a significant upregulation of miR-221-3p/miR-222-3p after Sunitinib exposure. Our findings bear a clinical perspective for high-risk PCa patients with low miR-221-3p levels since this could predict a favorable TKI response. Apart from this therapeutic niche, we identified a partially oncogenic function of miR-221-3p as an escape mechanism from VEGFR2 inhibition.
Identifizierung und Isolierung von Angiostatin aus dem Urin bei Patienten mit Prostatakarzinom
(2004)
Die Angiogenese beschreibt einen entscheidenden Schritt für Tumorwachstum und Metastasierung. Die Tendenz, neue Blutgefäße zu bilden, wird durch das Gleichgewicht angiogener und nicht-angiogener Faktoren bestimmt. In einer Reihe eleganter tierexperimenteller Versuche gelang es O`Reilly erstmals einen tumorassoziierten Inhibitor der Angiogenese, den er Angiostatin nannte, nachzuweisen und zu isolieren. Uns gelang es, im Western-Blot Angiostatin und Angiostatin-Spaltprodukte sowohl aus dem Urin von PCa-Patienten als auch aus dem Urin gesunder Probanden nachzuweisen und zu isolieren. Die anti-angiogene Wirksamkeit des von uns isolierten Proteins wurde im Endothelzellkultur-Assay bestätigt. Eine Differenzierung gesunder Personen von PCa-Patienten war aufgrund der kleinen Fallzahlen nicht möglich. Der Nachweis von Angiostatin bei Gesunden belegt aber, dass anti-angiogene Proteine unabhängig vom Vorhandensein maligner Tumore im Urin ausgeschieden werden. Es bleibt zu vermuten, dass Angiogenese-Inhibitoren ähnlich den Gerinnungsfaktoren bei Bedarf aktiviert und inaktiviert werden können. Der Angiogenese zugrunde liegende Mechanismen und beteiligte Faktoren sind Bestandteil intensiver Forschung. Unklar ist, ob Angiogenese-Inhibitoren in Zukunft in der Krebstherapie die Rolle spielen werden, die man ihnen bei ihrer Entdeckung zuschrieb.
Zerebrale kavernöse Malfomationen (CCM) sind vaskuläre Fehlbildungen im Gehirn. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte, blutgefüllte Gefäße mit einschichtigem Endothel, denen Merkmale ausgereifter Blutgefäße fehlen. Die klinischen Symptome reichen von Kopfschmerz bis hin zu hämorraghischem Schlaganfall. Eine genaue Vorhersage des Krankheitsverlaufs ist nicht möglich und die neurochirurgische Dissektion ist in der Regel die Therapieform der Wahl. Die genauen molekularen Mechanismen der CCM-Pathogenese sind unbekannt. CCMs treten sporadisch oder familiär gehäuft auf und folgen einem autosomal-dominanten Erbgang. Drei krankheitsverursachende Gene wurden in familiären CCMs identifiziert: CCM1/KRIT1, CCM2/MGC4607 und CCM3/PDCD10. Da Patienten mit einer Mutation in einem der drei CCM-Gene denselben klinischen Phänotyp aufweisen, wurde angenommen, dass die CCM-Proteine (CCM1, CCM2 und CCM3) Bestandteile eines molekularen Signalwegs sind. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass CCM3 mit CCM2 interagiert und zusammen mit CCM1 einen ternären Proteinkomplex bildet. Untersuchungen mit der humanen in-frame CCM2-Deletionsmutante CCM2:p.P11_K68del belegten, dass CCM2 das zentrale Gerüstprotein des CCM1/CCM2/CCM3-Proteinkomplexes ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass CCM3 an die Serin/Threonin-Kinase STK25 und an die Fas-assoziierte Phosphatase-1 (FAP-1) bindet. STK25 phosphoryliert CCM3 am Serin 39 und am Threonin 43. Die katalytische Domäne von FAP-1 dephosphoryliert CCM3. Untersuchungen mit der einzig bekannten humanen CCM3-Deletionsmutante, der aufgrund einer in-frame Deletion von Exon 5 im CCM3-Gen 18 Aminosäuren (CCM3:p.L33_K50del) fehlen, belegten zudem, dass in vitro dephosphoryliertes CCM3 Bestandteil des ternären CCM-Proteinkomplexes ist. Während STK25 die Deletionsmutante nicht mehr binden und phosphorylieren konnte, war die Interaktion mit CCM2 und die Bildung des ternären CCMKomplexes nicht beeinträchtigt. Somit könnte CCM3 über die Dephosphorylierung durch FAP-1 und die Phosphorylierung durch STK25 funktionell reguliert werden. Es stellte sich zudem heraus, dass CCM3 durch Induktion von oxidativem Stress mittels H2O2-Behandlung in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen herunterreguliert wird. Die in dieser Arbeit beschriebene Charakterisierung von CCM3-Interaktionen bringt CCM3 über seine Interaktionspartner erstmals in Zusammenhang mit molekularen Signalwegen, die an Prozessen der Angiogenese und vaskulären Entwicklung beteiligt sind. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise für die Entschlüsselung der pathogenen Mechanismen zerebraler kavernöser Malformationen und stellen einen ersten Schritt dar, um andere Behandlungsansätze als den bisher angewandten chirurgischen Eingriff, der multiple Risiken birgt, entwickeln zu können.