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Die DNA-Durchflusszytometrie ist eine anerkannte Methode zur Erfassung genetischer Abweichungen und Änderungen der Proliferationsfraktion von Tumorzellen. Die Aufarbeitung von Tumorzellen mit vorhandenen Begleitpopulationen bewirkt allerdings bei der Einfachfärbung der DNA eine Ungenauigkeit der Zellzyklusanalyse. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Begleitpopulationen auf die Analyse von Ploidie und Zellzyklus mit Hilfe der DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung am Mammakarzinom untersucht. Zum anderen wird auf Zusammenhänge zwischen p53, Proliferation und Ploidie von Mammakarzinomen eingegangen. Von 28 untersuchten Fällen waren 26 für die DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung komplett auswertbar. Bei 9 dieser 26 ausgewerteten Fälle konnte immunhistochemisch p53 nachgewiesen werden. Die Zellen wurden aus Gefriermaterial mechanisch vereinzelt und mit Propidium Jodid und FITC-konjugiertem anti-Zytokeratin-Antikörper bzw. anti-p53-Antikörper gefärbt. Die Messungen wurden mit einem FACScan durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Multicycle Software AV. Die Auswertung der Zytokeratin-Doppelfärbung ergab im Vergleich zur Einfachfärbung einen Anstieg sowohl des Anteiles aneuploider Tumoren als auch des mittleren DNA-Index. Die Proliferationsrate, insbesondere die S-Phasen-Fraktion erhöhte sich ebenfalls signifikant. Die vergleichenden Zellzyklusanalysen der Zytokeratin-positiven und der p53-positiven Tumorzellen zeigte eine geringere Proliferationsfraktion der p53-positiven Zellen, verglichen mit den p53-negativen Tumorzellen. Der überwiegende Anteil der p53-positiven Zellen zeigte eine Aneuploidie. Weiterhin ergaben sich in dieser Untersuchung Hinweise auf eine Zellzyklusabhängige Expression des p53-Proteins. Durch die Nutzung der Doppelfärbung für DNA und Zytokeratin in der Durchflusszytometrie gelingt die exaktere Wiedergabe der Biologie von Tumoren. Es ist zu erwarten, dass dies die prognostische Aussagekraft der DNA-flowzytometrischen Parameter Ploidie und Proliferationsfraktion erhöht.
Das menschliche MHS2 Gen ist eine sehr gut charakterisierte Komponente des Mismatch-Reparatur-Systems (MMR) und häufig mit der HNPCC Erkrankung assoziiert. Der Mechanismus über den MSH2 an der Karzinomentwicklung beteiligt ist, sind Defekte in der DNA-Reparatur. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen in den kodierenden Regionen dieses Gens direkt in die Mikrosatelliteninstabilität involviert sind. Generell ist MSH2 ein Teil des postreplikativen Reparatursystems der Zellen, und schützt so vor der Akkumulation von Mutationen. Dadurch wird die genetische Stabilität und Integrität gewährleistet. Ein anderer Teil der zellulären Krebsabwehr ist das p53 Tumorsuppressorgen. Ein möglicher DNA Schaden, der in der Lage ist, p53 zu aktivieren, ist UV-Licht. Eine weitere gut charakterisierte Komponente der zellulären UV Reaktion ist der Transkriptionsfaktor c-Jun. Ziel der Arbeit war es die Regulation und Signalfunktion von MSH2 näher zu charakterisieren. Dazu wurde der Promotor des Gens in ein Luziferase Promotorgenkonstrukt kloniert. Dieses Konstrukt wurde in menschliche Keratinozyten transfiziert, die nachfolgend mit UV bestrahlt wurden. Es konnte eine zeit- und dosisabhängige Hochregulation von MSH2 gezeigt werden. Diese Transkriptionserhöhung wurde von p53 initiiert, denn durch eine gezielte Mutation der p53-Bindungsstelle im MSH2 Promotor war dieser Effekt vollkommen aufgehoben. Interessanterweise war dieser Effekt von einem zusätzlichen Faktor abhängig, ohne den keine Hochregulation erkennbar war. Verantwortlich hierfür war der Transkriptionsfaktor c-Jun. Dadurch konnte eine funktionelle Interaktion von p53 und c-Jun in der transkriptionellen Aktivierung von hMSH2 gezeigt werden. Dieser zeit- und dosisabhängige Effekt war sowohl auf RNA als auch auf Proteinebene nachvollziehbar. Der größte Anstieg war bei 50 J/m2 zu verzeichnen, wohin gegen bei Verwendung von 75 J/m2 die Transkriptmenge geringer wurde, um bei 100 J/m2 erneut anzusteigen. Um diesen erneuten Anstieg des Proteins näher zu beschreiben wurden bei den stark bestrahlten Zellen TUNEL-Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an MSH2 Protein und an TUNEL-positiven apoptotischen Zellen. Um weiter zu zeigen, dass der zweite Anstieg des Proteins nicht mit einer Reparaturfunktion verbunden ist, wurde ein biochemisch basierter Test durchgeführt, welcher die Reparaturkapazität semiquantitativ beschreibt. Dabei konnte klar gezeigt werden, dass die mit 100 J/m2 bestrahlten Zellen keine Reparaturfunktion mehr erfüllen. FACS-Analysen und Zellfärbungen gegen Annexin V und mit Propidiumiodid bestätigten die stattfindende Apoptose in den Zellen. Eine weitere Komponente des MMR-Systems ist MSH6. MSH6 bildet mit MSH2 ein Dimer, welches den Fehler in der DNA erkennt und das weitere Reparaturprogramm einleitet. Die Expression dieses Proteins konnte nur bis zu einer Dosis von 50-75 J/m2 UV nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu MSH2 war MSH6 nicht in 100 J/m2 bestrahlten Keratinozyten detektierbar. Um über die Lokalisation dieser Proteine mehr zu erfahren wurden Immunfärbungen gegen MSH2 durchgeführt. Es zeigte sich eine Translokation des Proteins vom Kern in das Zytoplasma in Korrelation zum zunehmenden DNA-Schaden durch höhere Dosen an UV-Licht. Dies stellt eine mögliche Verbindung zwischen dem Mismatch-Reparatursystem und apoptotischen Signalwegen dar.
Mechanisms of apoptosis modulation and their contribution to genomic instability in tumor cells
(2004)
The concept of programmed cell death has been increasingly considered from various aspects since early 1970’s. Primarily, knowledge of apoptosis referred to morphological changes in which chromatin is condensed and increasingly fragmented, revealed as small structure in the nucleus. The membrane shrinks and the cell becomes dense as can be seen by flow cytometry. Interestingly, similar modes of cell deletion were observed in nematodes indicating that apoptosis is a highly conserved machinery. Three Caeonorhabditis elegans gene products are found to have high homology with mammalian apoptotic genes: CED-9 inhibits apoptosis and is related to bcl-2; CED-3 and CED-4 promote apoptosis and are related to caspase 9 and APAF-1. Apoptosis is not accidental death, but a highly controlled and medically important molecular process. More general terms such as ‘physiological’ or ‘regulated’ cell death cover different morphologies and sequences. Programmed suicide of cells that were subjected to toxic exogenous and endogenous stimuli plays a key role in understanding cancer development and its treatment. Apoptosis involves sequences of events that may overlap and play contradictory or antagonistic roles in cell death. Generally, the ability to trigger apoptotic processes in cancer cells would benefit an organism by keeping homeostasis intact. Programmed cell death is a regularly present mechanism, for instance, in lymphocyte recruitment in the thymus where immature lymphocytes may recognize host antigens. Therefore, such lymphocytes become apoptotic and are removed by macrophages. Removal prevents possible autoimmune diseases. Unlike apoptosis, necrosis is a passive process of cell death recognizable by membrane morphological changes and accompanied by leakage of intracellular material into intercellular space that may cause inflammation in the organism. Signals that may initiate apoptosis are generally classified into two groups: signals that launch extrinsic apoptotic pathways starting with aggregation of death receptors and intrinsic apoptotic pathways starting with disruption of intracellular homeostasis such as the release of mitochondrial factors or DNA degradation. Early in the process, apoptotic signals may lead to a broad range of signaling mechanisms such as DNA repair and assessment of DNA damage (check points). Thus, failure in any of these steps can cause a defective apoptotic response that plays a decisive role in both tumorigenesis and drug resistance in tumor treatment. More distinctly, the capability of cancer cells to go into apoptosis prevents further neoplastic changes. Generally, the purpose of this study is to investigate the balance between formation of genomic damage and induction of apoptosis under genotoxic stress. After genotoxic insult there are different possibilities for the fate of a cell (Figure 1). The genomic integrity is analyzed at cellular checkpoints, usually leading to a delay in cell cycle progression if DNA was damaged. Mutations in genes such as p53 and p21 change the cellular response to genotoxic stress and may alter the balance between apoptosis and genomic damage. However, p53 is usually mutated or not expressed in 70% of human tumors. Alterations in p53 states that reflect distinct apoptotic response upon induction of DNA damage were examined. In this study, three cell lines with distinct p53 states were used: TK6 harboring wild-type p53, WTK1 with mutated p53 and NH32 with knocked out p53. In the present work we applied different approaches to investigate the correlation between DNA damage and apoptotic responsiveness in cancer cell lines with different p53 states or in hormone responsive cell lines with over expressed bcl-2 gene. We were focused on effects caused by temporary down regulation of the p53 and Bcl-2 activity in human lymphoblastoid cell lines. In addition, we investigated the impact of estradiol-induced proliferation on apoptosis and DNA damage in stably transfected cells with bcl-2gene.
Das Ribonukleoprotein, Telomerase wird vor allem für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge benötigt und ist normalerweise nur in Keimbahnzellen, Stammzellen und anderen Zellen mit erhöhter Regenerationsfähigkeit aktiv. Die Aktivierung der Telomerase ist darüber hinaus ein wichtiger Faktor während der Krebsentstehung. Fast das komplette Spektrum humaner Tumore zeichnet sich durch hohe Telomerase-Aktivität aus. Vor allem maligne Tumore besitzen eine sehr aktive Telomerase, unlimitiertes Wachstum und Immortalität ermöglicht. Die Aktivität der Telomerase wird vor allem über die Expression der katalytischen Untereinheit hTERT reguliert, die unter der strikten Kontrolle verschiedener Tumorsuppressorgene liegt. Zu den wichtigsten Regulatoren der hTERT-Expression gehört auch der bekannte Tumorsuppressor p53. Über die Rolle des p53-Familienmitglieds p73 in der Regulation der Telomerase-Aktivität war bisher nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein regulatorischer Einfluss von p73 nachgewiesen werden. Dabei wurden deutliche Unterschiede in der Funktion der N-terminalen Isoformen TAp73 und DeltaNp73 beobachtet. TAp73 erwies sich sowohl nach Überexpression als auch nach Induktion des endogenen TAp73 als ein effizienter Repressor der hTERT-Expression. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hemmung des endogenen TAp73 mittels RNAi die Expression von hTERT in verschiedenen Zelllinen induziert werden. Zusätzlich zu der Funktion als Tumorsuppressor scheint p73 auch in verschiedene Differenzierungsprozesse involviert zu sein. Die Expression von p73 korreliert zwar mit der Hemmung der Telomerase-Aktivität während der myeloischen Differenzierung von HL60-Zellen, hat hier aber keine Bedeutung für die Repression von hTERT. Die N-terminal verkürzte Isoform DeltaNp73 wirkt im Gegensatz zu TAp73 als effizienter Aktivator der hTERT-Expression. DeltaNp73 induziert die hTERT-Expression einerseits über seine dominant-negative Funktion auf die pro-apoptotischen p53-Familienmitglieder und andererseits über die Hemmung repressiver RB-E2F-Komplexe. Im Rahmen dieser Studie erwies sich p73 somit als ein wichtiger Regulator der Telomerase Aktivität, wobei sich eine duale Rolle als negativer (TAp73) und auch als positiver (DeltaNp73) Regulator der Telomerase Aktivität herausstellte.
Ziel dieser Arbeit war es, prognoserelevante Faktoren für das kolorektale Karzinom anhand des eigenen Patientengutes zu untersuchen. Insbesondere sollte die prognostische Relevanz der Tumormarker CEA, CA 19-9 und p53 in Bezug auf tumorbedingtes Überleben und rezidivfreie Zeit analysiert werden, um anhand ihrer Ausprägung die Prognose eines Patienten nach primär chirurgischer Therapie besser definieren zu können. Dementsprechend sollte ein möglichst adäquates therapeutisches Vorgehen gewährleistet sein. Bezüglich des tumorbedingten Überlebens wurde anhand des Kaplan-Meier Verfahrens nachgewiesen, dass sowohl das UICC-Stadium als auch die Darmwandinfiltration (T-Status), Lymphknotenbefall (N-Status) und CEA im Serum als hochsignifikante Parameter dienen, wohingegen eine signifikante Einflussnahme für das Geschlecht, Alter, Tumorlokalisation, Grading, CA 19-9 und p53 (Serummessung) auf das Überleben nicht festgestellt wurde. Bei näherem Betrachten der einzelnen UICC-Stadien in Abhängigkeit von CEA war dieser der aussagekräfitgste prognostische Tumormarker (Serummessung, cut-off point >= 5 ng/ml) für Patienten in höherem UICC-Stadium (UICC III). Bei weiterer Betrachtung der einzelnen Subgruppen des UICC III-Stadiums war CEA insbesondere für Patienten in UICC IIIA am relevantesten. Bezüglich der beiden anderen Tumormarker CA 19-9 und p53 konnte mittels der Serummessungen keine Korrelation mit dem UICC-Stadium bzw. auch keine signifikante Einflussnahme auf das tumorbedingte Überleben festgestellt werden. Für die rezidivfreie Zeit zeigten UICC-Stadium, T-Status, N-Status, CEA (Serummessung) und Tumorlokalisation (Kolon/Rektum) eine signifikante Einflussnahme. Tumoren des Rektums hatten ein höheres Risikoprofil als die des Kolons. Die immunhistologische und molekulargenetische Analyse bezüglich aller drei Tumormarker bestätigte das UICC Stadium III als ein Risikostadium. Dabei lies sich entgegen der Serummessungen auch für CA 19-9 und p53 eine stadienabhängige Risiko-Korrelation darstellen. Des Weiteren korrelierte das Auftreten p53 spezifischer IgG Antikörper stark mit der p53 Proteinexpression im Gewebe, was die Annahme eines Zusammenhangs zwischen intrazellulärer Ansammlung von p53 in Tumorzellen und einer humoralen Antwort auf p53 stützt. Mit Ausnahme von CEA, zeigten CA 19-9 und p53 für sich alleine keine Korrelation zwischen erhöhten Serumwerten und/oder der Expression im Tumor und dem postoperativen Auftreten von Rezidiven. Dahingegen wurde erstmals in dieser Arbeit festgestellt, dass Patienten, die mindestens drei erhöhte Parameter (CEA, CA 19-9 und p53) im Serum und/oder im Tumor (Protein- oder Genexpression) hatten, eine höhere Rezidivrate (Lokal-, Metastasen) während der Tumornachsorge (36±6,6 Monate) zeigten; dies unabhängig von ihrem UICC Stadium (UICC I-III). Speziell diese Risikogruppe könnte von einer adjuvanten Therapie profitieren.
Krebserkrankungen zeichnen sich häufig durch Störungen zellulärer Differenzierungsprozesse aus. So weisen Rhabdomyosarkome, die aus Muskelvorläuferzellen hervorgehen, Differenzierungsdefekte auf, die zur unkontrollierten Proliferation der Tumorzellen führen. Bislang ist ungeklärt, ob die Differenzierungsdefekte auf der verstärkten Expression von Inhibitoren, der defekten Funktion von Aktivatoren oder einer Kombination von beidem beruht. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Unterschied zu normalen Muskelzellen RMS-Zellen verstärkt DeltaNp73, einen Pan-Inhibitor der p53-Tumorsuppressorfamilie, exprimieren. Die experimentelle Überexpression von DeltaNp73 in normalen Myoblasten blockierte die Muskeldifferenzierung und förderte in Kombination mit klassischen RMS-Onkogenen wie IGF2 oder PAX3/FKHR die maligne Transformation. Umgekehrt führte die Hemmung von DeltaNp73 durch RNAi zur Reduktion der Tumorigenität von RMS-Tumorzellen. Da DeltaNp73 als dominant-negativer Inhibitor der p53-Familie wirkt, lies die Hemmung von Differenzierungsprozessen durch DeltaNp73 vermuten, dass die p53-Familienmitglieder (p53, p63, und p73) an der Regulation der Muskeldifferenzierung beteiligt sind. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die drei p53-Familienmitglieder bei der Induktion später Differenzierungsstadien kooperieren, indem sie die Aktivität des Retinoblastoma-Proteins RB regulieren. Die Funktion von RB ist bekanntermassen sowohl für den permanenten Zellzyklusarrest als auch für die Aktivierung Muskel-spezifischer Gene notwendig. Während p53 die Proteinspiegel von RB reguliert, kontrollieren p63 und p73 den Aktivierungsgrad von RB, indem sie dessen Phoshphorylierungszustand über den Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitor p57KIP2 modifizieren. Eine Hemmung dieser Funktionen blockiert das Differenzierungsprogramm und fördert die Tumorentstehung. Die Aktivierung zellulärer Differenzierungsprozesse stellt somit einen entscheidenden Bestandteil der Tumorsuppressoraktivität der p53-Familie dar und liefert eine Erklärung für die Häufigkeit von Mutationen im p53-Signalweg bei Rhabdomyosarkom-Patienten.
Trotz radikaler chirurgischer Resektion kommt es bei Patienten mit kolorektalem Karzinom häufig zum Tumorrezidiv. In unserem Patientenkollektiv (n=51) erlitten innerhalb von 3 Jahren 18% der Patienten ein Rezidiv nach kurativer R0-Resektion. Eine mögliche Erklärung dafür wird in einer Suppression der Anti-Tumor-Immunantwort gesehen, die eine vollständige immunologische Tumorzerstörung verhindert. Regulatorische T(Treg)-Lymphozyten spielen hierbei eine wesentliche Rolle. Der Nachweis dieser Zellen und deren gesteigerte IL-10-Produktion könnte eine mögliche Erklärung für die hohe Rezidivrate bei Patienten mit kolorektalem Karzinom bieten. Ziel unserer Untersuchungen war es daher, die tumorspezifische Immunantwort bei Patienten mit kolorektalem Karzinom stadienabhängig (UICC I-IV) zu untersuchen und im Blut und Tumor vorhandene T-Zellen sowohl morphologisch als auch funktionell zu charakterisieren. Als tumorspezifisches Antigen wurde das Tumorsuppressorgen p53 gewählt, da es in bis zu 60% aller kolorektalen Karzinome überexprimiert wird. Präoperativ gewonnene periphere Blutlymphozyten (PBL) dieser Patienten wurden mit überlappenden synthetischen Peptidfragmenten der gesamten Wildtyp-p53-Proteinsequenz stimuliert und anhand der resultierenden Zytokinproduktion (IL-10, IFN-γ) verglichen (ELISPOT, ELISA). Sowohl Cytospinpräparate der PBL als auch Tumorgewebe wurden immunhistologisch in Einzel- und Doppelfärbung charakterisiert. Mittels ELISA wurde das Serum der Patienten auf das Vorhandensein von p53-Antikörpern untersucht. Spezifische p53-Mutationen und die Expression von Treg spezifischen Genen im Tumorgewebe wurden mittels Real-Time-PCR analysiert. Nur bei 35 % der untersuchten Patientensera (n=40) fanden sich p53-spezifische Antikörper, wobei keine Korrelation zum UICC-Stadium bestand. Es zeigte sich, dass sich die p53-Peptide, die eine IFN-γ Produktion hervorrufen, von denen unterscheiden, die eine IL-10 Expression induzieren. Unabhängig von spezifischen p53-Mutationen spielte dabei das UICC-Stadium für die IL-10-Produktion eine besondere Rolle. So produzierten nach Peptid-Stimulation T-Zellen von Patienten im UICC-Stadium II wesentlich mehr IL-10 als T-Zellen von Patienten fortgeschrittener Stadien. Für die IFN-γ-Produktion fand sich keine Korrelation zum UICC-Stadium. Die immunhistologischen Untersuchungen zeigten, dass Patienten höherer Stadien (UICC III/IV) mehr CD4+CD25+-Lymphozyten im Blut und eine stärkere p53-Akkumulation im Tumor aufweisen als Patienten niedrigerer Stadien. Die Expression Treg-spezifischer Gene (CD4, CD25,CTLA-4, Foxp3, GITR, GATA-3) im Tumor korrelierte ebenso mit dem UICC-Stadium und war im UICC-Stadium II gesteigert. p53 induziert sowohl eine IFN-γ als auch eine IL-10 Expression. Das Überwiegen der IL-10-Produktion deutet darauf hin, dass p53-spezifische Treg–Zellen direkt an der Modulation Anti-Tumor-Immunantwort beteiligt sind. Durch Überexpression von p53 induziert der Tumor selbst eine Th2-Immunantwort, die zu vermehrter Toleranz des Tumors durch die Lymphozyten führt. Dies stellt einen neuen möglichen Tumor-Escape-Mechanismus dar. Sowohl die IL-10 Spiegel im Blut als auch die Expression Treg-spezifischer Gene im Tumorgewebe korrelieren mit dem Stadium der Erkrankung. Dies scheint die schlechte Prognose und hohe Rezidivhäufigkeit von Patienten mit bereits weit fortgeschrittenen Karzinomen zu erklären. Die Ergebnisse der Arbeit eröffnen darüber hinaus neue Therapieoptionen: Eine Verschiebung der Anti-Tumor-Immunantwort hin zur vollständigen immunologischen Tumorzerstörung (Th1) wäre in Form einer spezifischen anti-IL-10-Antikörperapplikation oder einer gezielten Depletion der tumorspezifischen Treg–Zellen denkbar.
Brustkrebs ist gegenwärtig die häufigste bösartige Erkrankung der Frau weltweit und verantwortlich für 15 % der Krebs¬todes-ursachen in der westlichen Welt. Maligne Erkrankungen in metastasierten Stadien gelten generell als unheilbar mit einem medianen Überleben von wenigen Jahren. Das LIM und SH3 Domänen Protein (LASP-1) ist ein spezielles fokales Ad¬hä¬sions-protein, das an den Vorgängen der Zellproliferation und -migration beteiligt ist. Der Knockdown von LASP-1 in metastatischen Brust- und Eier¬stock¬krebs-zelllinien führt zu einer starken Hemmung der Zellmigration und -proliferation. Um¬ge-kehrt kommt es nach Überexpression des Proteins in nicht neoplastischen Zellen zu einer erhöhten Migration. Bei den von uns untersuchten Patientinnen mit Brust- oder Eierstockkrebs korreliert die Überexpression des Proteins mit fortgeschrittener Tumor-größe und Lymphknoten-Metastasierung. Die genetische Analyse von 63 mikrodissektierten histologischen Brust-krebs-Schnittpräparaten mit anschließender qRT PCR auf LASP-1 ergab (mit nur einer positiven Probe; 1,6 %) allerdings keine Amplifikation des Gens. Es scheint, dass die LASP 1 Proteinüberexpression als aktiver Prozess in der Tumorgenese aufgefasst werden kann und in der Mehrheit der Brustkrebsfälle bevorzugt durch trans¬krip-tionelle Regulation als durch Gen¬amplifi¬ka-tion hervorgerufen wird. LASP-1 ist nicht ausschließlich ein zytosolisch lokalisiertes Protein, sondern in malignen Zellen außerdem im Zellkern nachweisbar. In einer Langzeitstudie (Januar 1985 – Dezember 2007) wurde anhand anti-LASP-1 gefärbter histologischer Schnittpräparate die LASP Expression bestimmt und mit dem Patienten-Überleben korreliert. Patientinnen mit nukleärer LASP-1-Lokalisation zeigen, im Vergleich zu nukleär-LASP-1 negativen Schnitten, ein signifikant (p = 0,0250) reduziertes Langzeitüberleben. Mit diesen Ergebnissen lassen sich zukünftig vielleicht prognostische Aussagen über die Auswirkungen der LASP-1-Expression für den einzelnen Patienten treffen.
Precise control of progression through mitosis is essential to maintain genomic stability and to prevent aneuploidy. The DREAM complex is an important regulator of mitotic gene expression. Depletion of Lin9, one core-subunit of DREAM, leads to reduced expression of G2/M genes and impaired proliferation. In conditional mouse knockout cells (MEFs) Lin9 deletion causes defects in mitosis and cytokinesis and cells undergo premature senescence in order to prevent further proliferation. In this work it could be shown that the senescence phenotype in Lin9 knockout MEFs is independently mediated by the two tumor suppressor pathways p53-p21 and p16-pRB. Studies using the conditional Lin9 knockout mouse model demonstrated an important function of Lin9 in the regulation of mitotic gene expression and proliferation in vivo. Deletion of Lin9 caused reduced proliferation in the intestinal crypts resulting in atrophy of the intestinal epithelium and in rapid death of the animals. In the second part of this work, the pathways leading to p53 mediated G1 arrest after failed cytokinesis were analyzed by using a chemical inhibitor of the mitotic kinase Aurora B. In a high throughput siRNA screen the MAP kinase MAP3K4 was identified as an upstream activator of p53. It could be shown that MAP3K4 activates the downstream stress kinase p38b to induce the p53 mediated cell cycle arrest of tetraploid cells. p38b was required for the transcriptional activation of the p53 target gene p21 in response to Aurora B inhibition. In contrast, phosphorylation, stabilization and recruitment of p53 to the p21 promoter occured independently of p38 signaling. Partial inhibition of Aurora B demonstrated that chromosome missegregation also activates the MAP3K4-p38-p53 pathway, suggesting that subtle defects in mitosis are sufficient for inducing this stress signaling pathway. Although p38 was required for the G1 cell cycle arrest after mitotic failures, long-term co-inhibition of p38 and Aurora B resulted in reduced proliferation probably due to increased apoptosis. Presumably, MAP3K4-p38-p53 signaling is a common pathway that is activated after errors in mitosis or cytokinesis to arrest cells in G1 and to prevent chromosomal instability.
Die Therapiemöglichkeiten für Patienten im Melanom Stadium IV sind nach wie vor begrenzt und die Erkrankung nur selten heilbar. Eine mögliche Ziel¬struktur in der Melanom¬therapie der Zukunft könnte das im Melanom häufig genetisch wild¬typisch vorliegende p53 sein.
Für vorliegende Arbeit wurden humane Melanomzelllinien, welche stabil mit einem p53-Reportergenkonstrukt transduziert waren, hinsichtlich ihrer p53-Expression, -Akti-vität und -Akti¬vierbarkeit untersucht. Alle verwendeten Melanom¬zell¬¬¬linien exprimierten p53 un¬ab¬hängig vom p53-Mutations¬status. Drei der sieben untersuchten p53-wild¬typischen Melanomzelllinien zeigten keine oder nur sehr niedrige p53-Reporter¬gen¬aktivität. Die anderen vier p53-wildtypischen Zelllinien dagegen waren durch hohe, mittels p53-Knockdown unterdrückbare Reportergen¬expression gekennzeichnet. Die Proliferation dieser Zellen in Gegenwart von aktivem p53 belegt, dass Melanomzellen eine hohe Toleranz gegenüber diesem Tumor¬suppressor besitzen können. Eine weitere Steige¬rung der p53-Expression und -Aktivität durch die Hemmung von MDM2 (mouse double minute 2) mit der Substanz Nutlin-3a führte in den Zellen mit messbarer p53-Aktivität jedoch zu einem G1-Zell¬zyklusarrest. Dies belegt die prinzipielle Eignung von p53 als mögliche thera¬peutische Zielstruktur. Aufgrund ihrer schlechten Biover¬füg¬barkeit und hohen Toxizität gelten MDM2-Inhibitoren bisher aber als ungeeignet für den klinischen Einsatz.
Die Reduktion hoher therapeutischer Nebenwirkungen könnte durch eine Melanom-spezifische Reaktivierung von p53 gelingen. Eine mögliche negativ-modulierende Wirkung des Mela¬¬nom¬¬markers TRP2 (tyrosinase-related-protein 2) auf p53 wurde im Jahr 2010 von Sendoel et al. nach Unter¬suchungen am Fadenwurm C. elegans vorgeschlagen. TRP2 wird beim metastasierten Melanom in mehr als 80 % der Fälle exprimiert und wäre, handelte es sich beim Melanom um einen weit verbreiteten Regulationsmechanismus, ein interessantes Zielprotein, um die Aktivität von p53 zu steigern. Die dargestellten Ergeb¬nisse zeigen, dass TRP2 zwar in vier von fünf Melanomzelllinien exprimiert wurde, die Unterdrückung der TRP2-Expression jedoch weder spezifischen Einfluss auf die p53-Expression noch auf die p53-Reportergenaktivität zeigte. Auch das veränderte Wachs¬tums¬¬¬verhalten der Zellen nach Unterdrückung von TRP2 mittels drei unterschiedlicher shRNAs konnte im Rescue-Experiment, bei dem TRP nach seinem Knockdown ektop exprimiert wurde, keinem spezifischen Effekt von TRP2 auf die p53-Expression oder p53-Reporteraktivität zugeordnet werden. Auch in der TRP2-negativen Zelllinie führte die ektope TRP2-Expression nicht zu einer verminderten p53-Expression oder -Aktivität. Für das im Gegensatz zu MDM2 deutlich melanomspezifischere TRP2 konnte demensprechend kein sicherer regulatorischer Zusammenhang mit p53 dargestellt werden.
Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche Bedeutung wildtypischem p53 im Melanom zukommt und ob sich weitere mögliche p53-Regulatoren als therapeutische Angriffspunkte eignen.