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In dieser Arbeit wurde der Einfluss des Zytokins OPN speziell auf CD4+ CD25+ Foxp3+- regulatorische bzw. CD4+ CD25- Foxp3-- konventionelle T-Zellen mithilfe v.a. durchflusszytometrischer Daten untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes OPN die Supprimierbarkeit von konventionellen T-Zellen aus OPN-Knock-out-Tieren durch regulatorische T-Zellen aus Wildtyp- oder OPN-KO-Tieren erhöht. Die Supprimierbarkeit von wildtypischen Tconv-Zellen wird durch OPN jedoch nicht beeinflusst.
Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro
(2020)
Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zelluläre Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf früheren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdrängung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung ausüben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte darüber hinaus eine Erhöhung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umständen so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen möglich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antikörper stimulierten experimentellen Ansätzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Veränderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bezüglich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin bestätigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. Während die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeinträchtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse dafür, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase begünstigend auf Krankheitsgeschehen mit überschießender oder dysregulierter Aktivität des Immunsystems einwirken könnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erklären möglicherweise auch Einflüsse auf das Immunsystem, die für verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungeklärtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu klären, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden lässt.
Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes.
For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus.
In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human.
N-Glykosylierungen spielen beim Env-Gen eine wichtige Rolle. Sie dienen nicht nur als „Escape-Phänomen“ zur Verhinderung einer Elimination des Virus durch neutralisierende Antikörper. Es hat sich gezeigt, dass bestimmte Menschen sich mit HIV infizieren können, aber es zu keinem Zeitpunkt zu AIDS-typischen Symptomen kommt, ohne die Einnahme antiretroviraler Therapie (ART). Solche Menschen werden als Elite Controller bezeichnet. Ihr Organismus kann selbst die Viruslast in sehr geringen Grenzen halten (< 50 Kopien/ml). Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss von N-Glykosylierungen in der Entstehung von Elite Controller zu untersuchen und prozentuell eine Tendenz zu schaffen, inwieweit die Glykosylierungsdichte des Env-Proteins entscheidend ist.
Es konnte gezeigt werden, dass eine immunologische Kontrolle auch auf der B-Zellebene stattfinden kann. Als Hinweis dient die geringe Glykosylierungsdichte im Bereich CD4bs und MPER, die indirekt über MHC Klasse II zu einer erhöhten Produktion von Antikörpern führen kann. Bisher wurde bei Elite Controller die T-Zellebene als mögliche immunologische Kontrolle beschrieben, jedoch gibt diese Arbeit hinweise, dass auch eine immunologische Kontrolle mittels Antikörper möglich ist. Die glykosylierten Zielepitope können eine große Hilfe sein für das Aussehen eines späteren Impfstoffs.
Dendritische Zellen (DCs) sind als Zielzellen des MV für dessen Pathogenese von zentraler Bedeutung und fördern sowohl Dissemination und Transmission des Virus. Auf zellulärer Ebene findet sich eine Modulation des Sphingolipidmetabolismus in MV-infizierten DC-Kulturen. S1P selbst ist ein bioaktives Sphingolipid, das über auto- und parakrine S1P-Rezeptorstimulation Funktion, Migration und Positionierung von Immunzellen, aber auch als intrazellulärer Botenstoff Calcium-Haushalt, Apoptose und Proliferation reguliert. Über die an der Vermittlung der intrazellulären S1P-Effekte beteiligten Strukturen ist bisher weniger bekannt und der S1P-Metabolismus einzelner Zellen trotz Kompartiment-abhängiger Schwankungen der S1P-Konzentrationen kaum adressiert. Für murine DCs konnte eine kontinuierliche S1P-Produktion und Sekretion nachgewiesen werden. Ob dies auch auf humane DCs zutrifft und pathophysiologisch im Rahmen einer MV-Infektion moduliert wird, ist bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen S1Ps sowie dessen Metabolismus in humanen DCs quantitativ erfasst, und der Einfluss inflammatorischer, bakterieller und viraler (MV) Stimuli einbezogen. In Anbetracht der bekannten chemoattraktiven Potenz wurde nachfolgend der Beitrag S1Ps für die DC-induzierte T-Zellmigration untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass beide SphK Isoenzyme und auch die irreversibel degradierende SPL in humanen unreifen DCs (iDCs) auf mRNA-Ebene exprimiert werden. S1P konnte intrazellulär nachgewiesen werden, eine mit Erythroyzten vergleichbare Speicherkapazität ist nicht anzunehmen. Unter bakteriell oder inflammatorisch vermittelter Ausreifung (mDCs) wurde eine Reduktion des S1P Gehalts in DCs beobachtet. Abweichend davon behielten insbesondere stark MV infizierte DC-Kulturen die hohen S1P-Spiegel unreifer DCs bei, was möglicherweise neben der modulierten Chemokinsynthese und Oberflächenexpression ko-stimulatorischer Moleküle einen weiteren Parameter ihrer inkompletten Reifung nach MV Infektion reflektiert. Da die Veränderungen zwischen MV-infizierten DCs und mDCs nur für S1P, nicht aber für andere Sphingolipidmetaboliten messbar waren, liegt ihnen wohl eine Regulation der Sphingosinkinasen oder S1P degradierender Enzyme zugrunde. Bei unveränderter Akkumulation der hierfür spezifischen mRNAs müsste dies auf Ebene der Translation, Stabilität oder Aktivität der Enzyme beruhen.
Die indirekte Messung des extrazellulären S1Ps anhand der gegenläufigen S1P1-Dichte ließ vermuten, dass in DCs synthetisiertes S1P extrazellulär wirken konnte. Es kann dabei autokrin auf DCs wirken, beispielsweise deren Motilität oder Genexpression regulieren, ist aber auch Voraussetzung zum Aufbau eines S1P-Gradienten und damit parakriner Regulation lymphozytärer Migrationsvorgänge. Einen Beitrag S1Ps zur mDCs-induzierten T Zellchemotaxis konnte durch die erhobenen Daten mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Bezüglich der durch iDCs oder MV infizierte DCs induzierten T Zellchemotaxis konnte aufgrund experimenteller Limitationen keine abschließende Aussage zur Beteiligung S1Ps getroffen werden. Die T-Zellmigration auf DCs erwies sich im 2 D-System als gerichtete Bewegung. Weder Ausreifung noch MV-Infektion der DCs hatten Auswirkungen auf die Quantität der T-Zellmigration. Differentielle Expressionsmuster von Chemokinen in iDCs, mDCs und MV infizierten DCs sind jedoch bekannt und legen Variationen der Subset-Komposition innerhalb der migrierenden T Zellen nahe. Diese sollten gezielt in nachfolgenden Arbeiten untersucht werden.
Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit eine kontinuierliche Synthese S1Ps in DCs mit Stimulus-abhängiger Fluktuation nach. Eine MV Infektion löst dabei einen zu inflammatorischen und bakteriellen Stimuli divergenten Effekt auf den S1P-Gehalt aus mit möglichen pathophysiologischen Konsequenzen. Eine Modulation der T Zellchemotaxis und damit der DC-T-Zell-Interaktion wäre im Rahmen inflammatorischer, bakterieller oder viraler Szenarien denkbar. Unter inflammatorischen und bakteriellen Bedingungen trug S1P jedoch nicht zur T-Zellchemotaxis bei, für MV blieb dies unklar. Dahingegen zeigten weitere Experimente der Arbeitsgruppe einen autokrin vermittelten Beitrag des intrazellulär produzierten S1Ps zur Migration MV-infizierter DCs im respiratorischen Epithel und identifizierten damit einen bisher unbekannten Einflussfaktor einer erfolgreichen MV-Transmission.
Background: Integrase strand transfer inhibitors (INSTIs) are the latest addition to the array of antiretroviral compounds used to treat an infection with Human Immunodeficiency Virus (HIV). Due to their high efficacy and increased tolerability, INSTIs have become an integral part of first-line therapy in most high-income countries over the past years. However, little is known about HIV-1’s genetic inter- and intra-subtype diversity on the Integrase (IN)-gene and its impact on the emergence of INSTI-resistance. In the absence of a functional cure, long-term efficacy of first-line compounds remains paramount for reducing virological failure and curbing on-going HIV transmissions. South Africa, harbouring more than 20% of the global HIV burden (7.7 / 37.9 million people), requires international attention in order to globally pursue UNAIDS’ (Joint United Nations Programme on HIV/AIDS) 90-90-90 goals and the road to ending the HIV/AIDS (Acquired immunodeficiency syndrome) pandemic by 2030.
Methods: In this study, the prevalence of INSTI-resistance associated mutations (RAM) was investigated in a cohort of 169 archived drug-naïve blood samples from multiple collection sites around Cape Town, South Africa. Viral RNA was isolated from plasma samples, the integrase fragment amplified by RT-PCR and subsequently sequenced by Sanger-sequencing. Additionally, all publicly available drug-naïve, South African IN sequences, isolated before the availability of the first INSTIs in 2007, were retrieved from the Los Alamos HIV sequence database (n=284). All sequences were analysed for RAMs using the Stanford HIV Drug resistance database. The identification of polymorphism in the South African subtype C IN consensus sequence allowed for comparative analyses with global subtype B, as well as subtype C sequences, from countries other than South Africa.
Results: The IN gene could be amplified and sequenced in 95/169 samples (56%). Phylogenetic inference revealed close homology between three sequence-pairs, warranting the exclusion of 3/95 sequences from further analyses. Of the 92 samples used for mutational analyses, 86/92 (93.5%) belonged to subtype C, 5/92 (5.4%) to subtype B and 1/92 (1.1%) to subtype A. The prevalence of major and accessory INSTI RAMs was 0/92 (0%) and 1/91 (1.1%), respectively, similar to the observed rates of 8/284 (2.8%) and 8/284 (2.8%) in the database sequences (p = 0.2076 and p = 0.6944, Fisher’s exact test). Compared to subtype B IN sequences, 15 polymorphisms were significantly enriched in South African subtype C sequences (corrected p<0.0015. Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc procedure).
Compared to subtype C IN sequences isolated outside South Africa, four polymorphisms were significantly enriched in this study cohort (corrected p<0.0014, Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc procedure). The highest prevalence margin was observed for the polymorphism Met50Ile being present in 60.1% of South African subtype C sequences, compared to 37% in non-South African subtype C sequences.
Conclusions: The low prevalence of major and minor RAMs in all South African Integrase sequences predicts a high susceptibility to INSTIs, however, the presence of natural polymorphisms, in particular Met50Ile, in the majority of sequences warrants further monitoring under therapeutic pressure, as their role in mutational pathways leading to INSTI- resistance is yet to be determined. Additionally, this study revealed the presence of substantial inter- and intra-subtype diversity within the HIV-1 Subtype C IN-gene. These results implicate the need for more research on a regional, potentially patient-specific level, as mutational insights from other diverse backgrounds may not accurately represent the South African context. The implementation of a national pre-treatment INSTI-resistance screening program may provide necessary insights into the development of mutational pathways leading to INSTI-resistance under therapeutic pressure for the South African context and thereby bring South Africa one step closer to achieving UNAIDS 90-90-90 goals and ending the AIDS epidemic by 2030.
Patienten mit einer HIV-Infektion werden mit antiretroviralen Medikamenten therapiert, um die Krankheitsprogression zu verhindern, die HIV-Replikation zu hemmen und klinische HIV-induzierte Symptome zu verbessern. Für HIV-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) als Folge einer Infektion mit HIV gibt es jedoch noch keine ausreichende Therapie. In dieser Arbeit wurden PBMC, Serum- und Liquorproben von Teilnehmern einer placebokontrollierten klinischen Studie analysiert, in der die Wirksamkeit einer Lithium-Therapie bei HIV-Patienten mit HAND untersucht wurde. Die Studienteilnehmer erhielten für sechs Monate zusätzlich zu ihrer antiretroviralen Medikation Lithiumcarbonat bzw. ein Placebo. Die Einschlusskriterien waren eine mindestens sechs Monaten bestehende antiretrovirale Therapie bei unterdrückter Viruslast und eine mittelschwere bis schwere Manifestation der HIV-assoziierten neurokognitiven Störung. Die Studie wurde in Primary Care Kliniken des öffentlichen Sektors in Kapstadt, Südafrika, durchgeführt. Als primärer Wirksamkeitsendpunkt wurde die Veränderung des Global Deficit Scores (GDS) von Beginn der Studie bis zum Ende der 24. Woche festgelegt. Es hatten insgesamt 66 Patienten an der Studie teilgenommen, davon bekamen 32 Patienten das Medikament Lithiumcarbonat und 34 Patienten ein Placebo. Den Patienten wurden zu den Zeitpunkten Baseline (V3) und 24. Woche (V12) Blut- und CSF-Proben entnommen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proben mittles Durchflusszytometrie und ELISA untersucht. Die Daten wurden mit dem GDS sowie weiteren Progressionsmarkern der HIV-Infektion wie Viruslast und CD4+ Zellzahl korreliert. Von den 66 Teilnehmern, die die Studie begonnen haben, schlossen insgesamt 61 Teilnehmer ab, darunter hatten 30 Patienten Lithiumcarbonat und 31 Patienten ein Placebo eingenommen. Das Durchschnittsalter lag bei 40 Jahren und die mittlere CD4+ T-Zellzahl umfasste 500 Zellen pro ml. Es traten sechs schwerwiegende unerwünschte Ereignisse auf, aber keines wurde in Zusammenhang mit dem Studienmedikament betrachtet. Die Patienten mit HAND, die zusätzlich zu einer antiretroviralen Therapie eine medikamentöse Behandlung mit Lithium erhielten, haben dieses klinisch gut vertragen. Jedoch konnte keine Verbesserung in Bezug auf neurokognitive Beeinträchtigungen für die Studienteilnehmer beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass im zeitlichen Verlauf von V3 zu V12 ein signifikante Verbesserung des GDS innerhalb der Placebo-, sowie innerhalb der Lithium-Gruppe beobachtet werden konnte, wohingegen bei den Gruppen untereinander, Lithium versus Placebo, zu den jeweiligen Zeitpunkten V3 sowie V12, ähnliche Werte gemessen werden konnten und sich daher die Lithium-, und die Placebo-Gruppe nicht signifikant voneinander unterschieden. Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen ließ sich zudem ableiten, dass ein signifikanter Abfall der BDNF Konzentration im Plasma zu verzeichnen war. Insgesamt war ein Trend erkennbar, dass Patienten mit blip eine höhere Immunaktivierung zeigten, als Patienten ohne blip. Jedoch hatte die Behandlung mit Lithium keinen Einfluss auf die Immunaktivierung der CD8+ T-Zellen. Des Weiteren zeigte sich unter der Lithium-Therapie ein signifikanter Abfall der CD4+ Zellzahlen.
Neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) is a member of a superfamily of enzymes responsible for conversion of sphingomyelin into phosphocholine and ceramide at the cytosolic leaflet of the plasma membrane. Upon specific ablation of NSM2, T cells proved to be hyper-responsive to CD3/CD28 co-stimulation, indicating that the enzyme acts to dampen early overshooting activation of these cells. It remained unclear whether hyper-reactivity of NSM2-deficient T cells is supported by a deregulated metabolic activity in these cells. Here, we demonstrate that ablation of NSM2 activity affects metabolism of the quiescent CD4\(^+\) T cells which accumulate ATP in mitochondria and increase basal glycolytic activity. This supports enhanced production of total ATP and metabolic switch early after TCR/CD28 stimulation. Most interestingly, increased metabolic activity in resting NSM2-deficient T cells does not support sustained response upon stimulation. While elevated under steady-state conditions in NSM2-deficient CD4\(^+\) T cells, the mTORC1 pathway regulating mitochondria size, oxidative phosphorylation, and ATP production is impaired after 24 h of stimulation. Taken together, the absence of NSM2 promotes a hyperactive metabolic state in unstimulated CD4\(^+\) T cells yet fails to support sustained T cell responses upon antigenic stimulation.
Background
Progressive multifocal leukoencephalopathy is a demyelinating CNS disorder. Reactivation of John Cunningham virus leads to oligodendrocyte infection with lysis and consequent axonal loss due to demyelination. Patients usually present with confusion and seizures. Late diagnosis and lack of adequate therapy options persistently result in permanent impairment of brain functions. Due to profound T cell depletion, impairment of T-cell function and potent immunosuppressive factors, allogeneic hematopoietic cell transplantation recipients are at high risk for JCV reactivation. To date, PML is almost universally fatal when occurring after allo-HCT.
Methods
To optimize therapy specificity, we enriched JCV specific T-cells out of the donor T-cell repertoire from the HLA-identical, anti-JCV-antibody positive family stem cell donor by unstimulated peripheral apheresis [1]. For this, we selected T cells responsive to five JCV peptide libraries via the Cytokine Capture System technology. It enables the enrichment of JCV specific T cells via identification of stimulus-induced interferon gamma secretion.
Results
Despite low frequencies of responsive T cells, we succeeded in generating a product containing 20 000 JCV reactive T cells ready for patient infusion. The adoptive cell transfer was performed without complication. Consequently, the clinical course stabilized and the patient slowly went into remission of PML with JCV negative CSF and containment of PML lesion expansion.
Conclusion
We report for the first time feasibility of generating T cells with possible anti-JCV activity from a seropositive family donor, a variation of virus specific T-cell therapies suitable for the post allo transplant setting. We also present the unusual case for successful treatment of PML after allo-HCT via virus specific T-cell therapy.
Exon-4 Mutations in KRAS Affect MEK/ERK and PI3K/AKT Signaling in Human Multiple Myeloma Cell Lines
(2020)
Approximately 20% of multiple myeloma (MM) cases harbor a point mutation in KRAS. However, there is still no final consent on whether KRAS-mutations are associated with disease outcome. Specifically, no data exist on whether KRAS-mutations have an impact on survival of MM patients at diagnosis in the era of novel agents. Direct blockade of KRAS for therapeutic purposes is mostly impossible, but recently a mutation-specific covalent inhibitor targeting KRAS\(^{p.G12C}\) entered into clinical trials. However, other KRAS hotspot-mutations exist in MM patients, including the less common exon-4 mutations. For the current study, the coding regions of KRAS were deep-sequenced in 80 newly diagnosed MM patients, uniformely treated with three cycles of bortezomib plus dexamethasone and cyclophosphamide (VCD)-induction, followed by high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation. Moreover, the functional impact of KRAS\(^{p.G12A}\) and the exon-4 mutations p.A146T and p.A146V on different survival pathways was investigated. Specifically, KRAS\(^{WT}\), KRAS\(^{p.G12A}\), KRAS\(^{p.A146T}\), and KRAS\(^{p.A146V}\) were overexpressed in HEK293 cells and the KRAS\(^{WT}\) MM cell lines JJN3 and OPM2 using lentiviral transduction and the Sleeping Beauty vector system. Even though KRAS-mutations were not correlated with survival, all KRAS-mutants were found capable of potentially activating MEK/ERK- and sustaining PI3K/AKT-signaling in MM cells.