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Mammalian phoshoglycolate phosphatase (PGP, also known as AUM) belongs to the ubiquitous HAD superfamily of phosphatases. As several other members of HAD phosphatases, the Mg2+-dependent dephosphorylation is conducted via a nucleophilic attack from a conserved aspartate residue in the catalytic cleft. The protein structure of PGP could not yet be solved entirely. Only a hybrid consisting of the PGP cap and the PDXP core (pyridoxal phosphatase, closest enzyme paralog) was crystallizable so far. PGP is able to efficiently dephosphorylate 2-phosphoglycolate, 2-phospho-L-lactate, 4-phospho-D-erythronate, and glycerol-3-phosphate in vitro which makes them likely physiological substrates. The first three substrates can be derived from metabolic side reactions (during glycolysis) and inhibit key enzymes in glycolysis and pentose phosphate pathway, the latter is situated at the intersection between glycolysis and lipogenesis. 2-phosphoglycolate can also be released in the context of repair of oxidative DNA damage. The activity of purified PGP can be reversibly inhibited by oxidation - physiologically likely in association with epidermal growth factor (EGF) signal transduction. In fact, an association between persistently lacking PGP activity (via downregulation) and the presence of hyperphosphorylated proteins after EGF stimulation has been identified. Reversible oxidation and transient inactivation of PGP may be particularly important for short-term and feedback regulatory mechanisms (as part of the EGF signaling). Furthermore, cellular proliferation in PGP downregulated cells is constantly reduced. Whole-body PGP inactivation in mice is embryonically lethal. Despite the many well-known features and functions, the knowledge about PGP is still incomplete.
In the present work the influence of reactive oxygen species (ROS) on PGP activity in cells und a possible connection between oxidative stress and the proliferation deficit of PGP downregulated cells was investigated. For the experiments, a spermatogonial cell line was used (due to the high PGP expression in testis). PGP activity can be reversibly inhibited in cellular lysates by H2O2 (as a ROS representative). Reversible oxidation could thus indeed be physiologically important. More oxidative DNA damage (by bleomycin) showed no PGP-dependent effects here. EGF stimulation (as an inducer of transient and well-controlled ROS production), low concentrations of menadione (as an oxidant) and N-acetylcysteine (as an antioxidant) were able to approximate the proliferation rate in PGP downregulated cells to that of control cells. The redox regulation of PGP could thus have an influence on cellular proliferation as a feedback mechanism - a mechanism that could not take place in PGP downregulated cells. However, the connections are probably even more complex and cannot be elucidated by a sole examination of the proliferation rate. The present results can thus only be regarded as preliminary experiments.
For a better understanding of the features and functions of PGP, this work then focused on specific regulation of enzyme activity by pharmacologically applicable small molecules. Four potent inhibitors had previously been identified in a screening campaign. In this work, three of these four inhibiting compounds could be further characterized in experiments with highly purified, recombinant murine and human PGP. Compounds #2 and #9 showed competitive inhibition properties with a markedly rising KM value with little or no change in vmax. The results were consistent for all tested protein variants: the murine and the human PGP as well as a PGP/PDXP hybrid protein. Compound #1 was the most potent and interesting PGP-inhibitory molecule: less change in KM and a constant decrease in vmax as well as a lower impact on the PGP/PDXP hybrid hint at a mixed mode of inhibition as a combination of competitive and non-competitive inhibition. The characterization of the potential inhibitors can serve as a basis for further structural analysis and studies on the complex physiological role of PGP.
Proliferationsverhalten epithelialer Tumorzellen in Gegenwart von humanen mesenchymalen Stammzellen
(2020)
Die Stammzellforschung spielt eine zentrale Rolle in der Optimierung der zielgerichteten und selektiven Tumortherapie durch den angenommenen Tumortropismus von mesenchymalen Stammzellen. Bisher konnten keine eindeutigen Verhaltensmuster mesenchymaler Stammzellen in Gegenwart von Tumorzellen verzeichnet werden. Es gibt sowohl proliferationsfördernde als auch -hemmende Einflüsse. Mögliche Gründe für diese divergierenden Ergebnisse in Bezug auf die Tumorproliferation, im Speziellen auf die Kopf-Hals-Tumorzelllinie FaD, aufzudecken, war das Ziel dieser Arbeit.
Zahlreiche epidemiologische Studien zeigen für das Antidiabetikum Metformin anti-Tumor-Effekte, die bisher ansatzweise für verschiedene Tumorzelllinien in vitro bestätigt wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war, den antiproliferativen Effekt von Metformin an sechs humanen kolorektalen Karzinomzelllinien (Co-lo678, Colo741, HT29, HCT116, LS174T, RKO) zu untersuchen. Zur Identifizierung eines anti-proliferativen Effektes von Metformin bei kolorektalen Karzinomzellen wurde ein Konzentrationsbereich von 1 bis 100 mmol/L untersucht. Die für die Tumorzelllinien bestimmte halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC50) von Metformin reichte von 0,8 mmol/L (HT29) über 16 mmol/L (Colo678) bis >40 mmol/L (RKO). Der IC50 für die beiden nicht-transformierten Kontrollzellen lag ebenfalls über 40 mmol/L.
Um die Untersuchungen in vitro bei relevanten tumorphysiologischen Bedingungen durchführen zu können, die der Situation von Tumorzellen in einem soliden Tumor wie dem kolorektalen Karzinom möglichst nahekommt, wurden die Zellen bei unterschiedlichen Sauerstoff- und Glukosekonzentrationen kultiviert. Ein permanent erhöhter Blutzuckerspiegel hat sich als grundlegender Faktor für malignes Zellwachstum erwiesen. Der anti-proliferative Effekt von Metformin in Normoxie war nahezu unbeeinflusst von den untersuchten Glukosekonzentrationen (2,5; 5,0; 11 mmol/L). Dagegen nahm in Hypoxie im Vergleich zu Normoxie der antiproliferative Effekt von Metformin bei 4 von 6 Tumorzelllinien um mehr als das Doppelte ab. Ein zentrales Target der Metformin-Wirkung stellt die AMPK, ein wichtiges Enzym für den Energiestoffwechsel der Zelle, dar. Ihre phosphorylierte Form war in den Tumorzelllinien nachzuweisen, doch der anti-proliferative Effekt von Metformin war nicht durch den AMPK-Inhibitor Compound C zu hemmen.
Ein antiproliferativer Effekt von Metformin war bei kolorektalen Karzinomzellen nachzuweisen, doch bleiben die durch Metformin ausgelösten molekularen Mechanismen in der Tumorzelle weiterhin wenig verstanden.
A successful therapy for colorectal cancer (CRC), one of the most common malignancies worldwide, requires the greatest possible research effort. Of critical importance is an understanding of the relevant intracellular networks of signaling cascades, their activation, and the resulting cellular changes that are a prerequisite for a more successful CRC therapy. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and the appropriate VEGF receptors represent molecular targets that have already been successfully implemented in the clinic (i.e. using monoclonal antibodies, tyrosine kinase inhibitors). However, for platelet derived growth factor (PDGF) and the relevant PDGF receptors, there are currently no clinically approved molecular therapeutics available. However, there are preliminary data to show that PDGF and its associated signaling pathways play an important role in CRC progression. In particular, the PI3K/Akt/mTOR pathway is emerging as an important intracellular partner of PDGF with which to control proliferation, migration, and angiogenesis in tumor cells.
Therefore it was the objective of this work to investigate the multifactorial influence of PDGF on proliferation and metabolism, depending on CRC mutation status. The intention was to identify new therapeutic targets for future cancer therapy through analyses of PDGF-induced intracellular changes.
For this purpose two human colorectal cancer cell lines were analyzed at gene and/or protein level for components of the PI3K/Akt/mTOR and MAPK signaling pathway, c-Myc, p53, and HIF1α (hypoxia-inducible-factor 1α). Changes in proliferation and metabolism, either during stimulation with PDGF and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition, were also investigated. Experiments conducted at protein level during PDGF stimulation and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition revealed changes in signaling pathways and crosstalk. The influence of the tumor suppressors (retinoblastoma, Rb), oncogenes (c-Myc, p53mut), and HIF1α during stimulation with PDGF, and their interactions in the tumor cell with respect to proliferation and glycolysis warrant further examination in terms of clinical treatment options. Investigations at the gene level of ex vivo samples (UICC I-IV) complete the study with regards to the clinical relevance of PDGF.
PDGF stimulation increases tumor cell proliferation in HT29 cells via the PI3K/Akt/mTOR pathway rather than the MAPK pathway. However, if the PI3K/Akt/mTOR pathway is pharmacologically blocked, PDGF stimulation is mediated by inhibitory crosstalk through the MAPK pathway. Further analyses revealed that specific Akt inhibition impedes tumor cell growth, while PI3K inhibition had little effect on proliferation. Inhibitory crosstalk was found to be responsible for these different effects. Careful intervention strategies are therefore required if future therapies intend to make use of these specific signaling pathways. One aim of future research should be to gain a better understanding of the crosstalk between these signaling pathways. In this fashion, “over-inhibition” of the signal pathways, which would result in additional clinical side effects for patients, could be prevented.
In late stage UICC, more mutation events occur, with tumorigenicity promoted by an increased mutation rate. Given that PDGF is increasingly expressed in the late UICC stages, our data would indicate that PDGF's effects are amplified with increasing malignancy. The activating effect of PDGF on the PI3K/Akt/mTOR pathway and subsequent changes in the activity of p53mut, Rb, c-Myc, and HIF1α, lead to an unfavorable prognosis for colon cancer patients. PDGF acts on colon cancer cells in an Akt-activating, glycolysis-dependent manner. PDGF increases glycolysis and the ability of CRC cells to adjust their energy metabolism. These activities should be taken as possible starting points with which to design therapeutic interventions for CRC therapy.
PDGF, as another representative of the growth factor family, seems to play a similar role to VEGF in CRC. The data from this study underline the importance of the PDGF - PI3K/Akt/mTOR pathway-axis and its potential as a possible target in colorectal cancer. Thus PDGF represents an attractive therapeutic target, besides the VEGF/EGFR-based therapies already used in CRC.
Die Forschung mit induzierten pluripotenten Stammzellen (ipS) wurde in den letzten Jahren ein wichtiger Bestandteil der Stammzellforschung. Bisher sind nur wenige Möglichkeiten bekannt, wie man die unspezifische Proliferation der aus ipS differenzierten pan neuralen Progenitorzellen kontrollieren kann. Um dies weiter zu untersuchen, wurden murine induzierte Stammzellen, die mit den 4 Faktoren Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc reprogrammiert wurden, untersucht.
In diversen Forschungsreihen konnte zudem gezeigt werden, dass Erythropoetin (EPO) einen Einfluss auf das Zellüberleben, die Proliferation und die Differenzierung neuronaler Zellen hat. Ob dieser Einfluss auch bei induzierten pan neuralen pluripotenten Progenitorzellen zu beobachten ist, wird in dieser Arbeit untersucht.
Anhand eines Zellviabilitätsversuchs (MTT-Assay) wurde untersucht, ob die Stoffwechselaktivität durch EPO (0,1U/ml, 1 U/ml und 10 U/ml) im Vergleich zur Kontrollgruppe gesteigert werden kann. Dabei zeigte sich eine deutliche Zunahme nach 24 Stunden bei 1 und 10 U/ml EPO. Der Einfluss von EPO auf die Proliferation der Zellen wurde an Neurosphären unter Einsatz verschiedener EPO-Konzentrationen (0,1U/ml, 1U/ml und 10U/ml) sowie ohne EPO (Kontrollgruppe) untersucht. Dabei zeigte sich eine Reduzierung der Sphärenanzahl mit einem Durchmesser von >100µm bei zunehmender EPO-Konzentration. Im Gegensatz hierzu stieg die Anzahl der Sphären mit einem Durchmesser von 50-100µm. Die neuronale Differenzierung wurde durch den Zellfortsatz-Versuch mit Tuj1 positiven Zellfortsätzen in einer Monolayer-Kultur beobachtet. Dabei zeigte sich unter EPO eine Zunahme der Zellen mit einem Fortsatz. Ebenso wurde eine Durchflusszytometrie zum Nachweis der Proliferationshemmung durch EPO durchgeführt. Dazu wurden die Zellen mit CFSE markiert und mit einer EPO- oder Kontrolllösung versetzt. Dabei zeigte sich bei zunehmender EPO-Konzentration eine deutliche Zunahme der CFSE-Konzentration nach 48 und 72 Stunden. Der Nachweis, dass die Zellen auf EPO reagieren, wurde durch einen Western Blot erbracht. Dieser zeigte, dass die verwendeten 4F induzierte pan neurale Progenitorzellen (4F ipNP-Zellen) einen funktionellen EPO-Rezeptor besitzen, dessen Expression durch EPO deutlich gesteigert werden kann.
Es konnte gezeigt werden, dass EPO die Proliferation der Zellen vermindert, gleichzeitig aber auch die Zellviabilität und die Zelldifferenzierung erhöht. Diese Ergebnisse sind jedoch von vielen Faktoren abhängig, sodass noch einiges auf diesem Gebiet zu erforschen bleibt.
Bei Melanomen handelt es sich um die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate. Deshalb sind Untersuchungen dieser Hautkrebsart von immenser Bedeutung. Es ist bekannt, dass der AP-1-Transkriptionsfaktorkomplex eine große Rolle für Melanomentstehung und -progression spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der AP-1 Komponente FOSL1 in Melanomen untersucht.
Hierbei konnte zunächst ermittelt werden, dass die FOSL1 Expression im humanen Melanom durch den MAPK-Signalweg vermittelt wird und von den Onkogenen BRAF und NRAS abhängig ist. Dies wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass die Stabilität von FOSL1 durch MAPK reguliert wird.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass FOSL1 in vielen Melanomzellen die Proliferation verstärkt und auch an Migration beteiligt ist. Da diese Prozesse zur Krebsprogression beitragen, deutet dies darauf hin, dass FOSL1 bei der Melanomentwicklung eine wichtige Funktion besitzt. Weiterhin konnten SLUG, SNAI3, IL6 und MMP14 als FOSL1-Zielgene identifiziert werden, deren Regulierbarkeit durch FOSL1, jedoch abhängig von der jeweiligen Zelllinie war. Somit konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass FOSL1 nicht nur, wie zuvor für Brustkrebszellen beschrieben, an Migration beteiligt ist, sondern auch zur Proliferation humaner Melanome beiträgt. Zukünftige Arbeiten werden zeigen, ob die identifizierten Gene für die FOSL1-vermittelte Migration und Proliferation verantwortlich sind.
Zur Identifizierung geeigneter Routinemarker für die Prognose von Ependymompatienten führten wir immunhistochemische Untersuchungen und statistische Auswertungen an Ependymomen und Daten von 32 Erwachsenen und 23 pädiatrischen Patienten durch. Davon wurden bei drei Tumoren auch Rezidive untersucht, so dass insgesamt 59 Ependymome in die Untersuchung eingeschlossen wurden. Im Einzelnen handelte es sich um 11 myxopapilläre Ependymome, 6 Subependymome, 19 Ependymome und 23 anaplastische Ependymome. Die größten Fallgruppen bildeten pädiatrische Patienten unter drei Jahren und Erwachsene zwischen 50 und 70 Jahren. Bei Kindern war mit 45,8% die infratentorielle, bei Erwachsenen mit 65% die spinale Tumorlokalisation am häufigsten. Die untersuchten spinalen Ependymome entsprachen zu gleichen Teilen myxopapillären Ependymomen WHO Grad I und Ependymomen WHO Grad II. In supratentorieller Lage fanden sich mit 67% überwiegend anaplastische Ependymome WHO Grad III. Auch bei den infratentoriell gelegenen Ependymomen waren mit 63% die Mehrzahl anaplastische Ependymome, daneben fanden sich 29,6% Ependymome WHO Grad II. Beim Vergleich des von uns definierten und bestimmten Ki67-Scores als Zeichen für die Ependymomproliferation und der immunhistochemischen Positivität für HCK fiel nach Anwendung des Chi-Quadrat-Tests mit p=0,067 ein deutlicher Trend zu schwächerer punktförmiger Positivität bei höherem Ki67-Score auf. Dieser Trend setzte sich in der Erwachsenengruppe separat fort, während er in der Kindergruppe allein nicht nachweisbar war. In der Erwachsenengruppe war mit 28% ein deutlicher Anteil myxopapillärer Ependymome vorhanden, welche bei den Kindern nur 8% ausmachten.Möglicherweise spielt die veränderte HCK-Expression in der Subgruppe der myxopapillären Ependymome eine Rolle. Unsere Untersuchungen zeigten außerdem mit p=0,057 einen deutlichen Trend zu längerem Überleben bei immunohistochemischer DBC1-Negativität. Die Multivarianzanalyse mittels Cox-Regression wies eine Positivität für DBC1 als unabhängigen Risikofaktor für eine kürzere Überlebenszeit nach. Des Weiteren konnte eine mit p=0,013 signifikante Korrelation zwischen immunhistochemischer Positivität für DBC1 und höherem Ki67-Score gezeigt werden. Auch mit höherem WHO-Grad korrelierte die DBC1-Positivität mit p=0,009. Besonders infratentoriell gelegene Ependymome zeigten DBC1-Reaktivität. Hier treten bekannterweise häufiger anaplastische Ependymome mit höherem Proliferationsindex auf. Unsere Ergebnisse legen somit die Eignung des Markers DBC1 als immunhistochemische Routineuntersuchung für die Beurteilung der vom Resektionsstatus unabhängigen Prognose und Überlebenszeit von Ependymompatienten nahe.
Zahlreiche Studien schreiben Histondeacetylase-Inhibitoren einen Anti-Tumor-Effekt auf verschiedene hämatologische und solide Tumoren durch Apoptoseinduktion, vermehrte Zelldifferenzierung und verminderte Zellproliferation zu. Als Mechanismus wird eine Einflussnahme auf die Genexpression durch Modulation von Histondeacetylasen und deren Auswirkung auf den Acetylierungsstatus von Histonen und Nicht-Histon-Proteinen angenommen. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen des Histondeacetylase-Inhibitors LBH589 auf Proliferation und Differenzierung von Kolonkarzinomzellen und dessen Metastasenzellen in Zellkulturexperimenten zu untersuchen. Die Untersuchungen wurden an Zellen der Zellkulturlinien SW480 (kolorektales Karzinom) und SW620 (Metastase des kolorektalen Karzinoms) durchgeführt. Für die Zellproliferation wurden die Zellen nach entsprechender Vorbehandlung in einer Neubauer-Zellzählkammer ausgezählt. Zur Feststellung des Verlaufs der Zelldifferenzierung diente die Bestimmung der Intestinalen Alkalischen Phosphatase als Marker. Unter LBH589-Inkubation kam es zu einer Hemmung der Zellproliferation sowohl bei SW480-Zellen als auch bei SW620-Zellen. Allerdings ergab sich kein signifikanter Unterschied bei der Auswertung der Kontrolllösungen mit jeweils äquimolaren Mengen DMSO. Daher konnte dem HDAC-Inhibitor LBH589 im Rahmen dieser Arbeit kein sicherer Effekt auf die Inhibition der Zellproliferation zugeschrieben werden. LBH589 hatte keinen nachweisbaren relevanten Einfluss auf die Differenzierung von Zellen der beiden Zelllinien. Allenfalls konnte ein leicht hemmender Einfluss auf die Zelldifferenzierung gezeigt werden, der jedoch nicht signifikant ausfiel. Weitere Untersuchungen sind anzustreben, um den Verlauf der Zellproliferation und weiterer Differenzierungsmarker unter dem Einfluss von LBH589 sowie äquimolaren Mengen DMSO detaillierter zu charakterisieren. Zukünftige Arbeiten zu Histondeacetylase-Inhibitoren und deren Effekt auf Zellen des kolorektalen Karzinoms, sowie Histondeacetylase-Inhibitoren in der Kombinationstherapie von kolorektalen Tumoren sind sicher sinnvoll.
SUMMARY GABP is a heterodymeric member of Ets-family transcription factors. It consists of two subunits – GABPa which contains DNA binding domain and GABPb, which provides transcriptional activation domain and nuclear localization signal. GABPa/b complex is essential for transcriptional activation of multiple lineage-restricted and housekeeping genes, several viral genes, and in some cases might function as transcriptional repressor. Large variety of data indicates involvement of GABP in the complex regulation of cell growth, specified by quiescence, stimulation/proliferation, apoptosis and senescence. Expression level of GABPa subunit is rapidly increased when resting cells enter S-phase, and GABPa/b complex is critical to promote the continuity of the cell cycle. Conditional inactivation of GABPa expression in mouse embryonic fibroblasts results in a complete block of proliferation and acquisition of senescence-like phenotype. However, the influence of GABP on the other cell growth determinant – the apoptosis – remains largely obscure. Therefore we aimed to investigate the influence of GABPa/b expression level on the cell growth in vitro. Using siRNA approach we achieved efficient but only transient down-regulation of GABPa expression which precluded further cell growth studies. Persistent increase of the expression of GABPb subunit only resulted in a positive effect on the cell growth speed. Simultaneous conditional overexpression of both GABPa and GABPb subunits though, strongly reduced the growth of the affected cell cultures in reversible and in expression level dependent manner. Interestingly, GABPa/b overexpressing cells did show neither cell cycle arrest nor massive induction of apoptosis. However, more detailed analyses revealed that dampened apoptotic processes were taking place in GABPa/b−overexpressing cells, starting with a prominent activation of caspase-12. Interestingly, activation of downstream effector caspases was rather suppressed explaining a weak increase of apoptotic cells in GABPa/b overexpressing cultures. This effect suggests that the activation of caspase-12 by elevated amounts of exogenous GABPa/b reflects the normal physiological mechanism of caspase-12 regulation.
Das CCN Protein CYR61 besitzt eine Reihe außergewöhnlicher biologischer Funktionen. Als ein Molekül der EZM dient es der Regulation zellulärer Aktivitäten wie Adhäsion, Wanderung und Proliferation. Diese Funktionen stehen im Einklang mit der Wirkung von Proteinen, die Zellwachstum und Differenzierung steuern. Die gewebespezifische und zeitlich begrenzte Expression von CYR61 in Mäuseembryonen lieferte bereits erste Hinweise über eine mögliche Beteiligung an der Entwicklung des Skelettsystems. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde das CYR61 Protein in nachfolgenden Arbeiten als ein neuer, die Chondrogenese regulierender, Faktor identifiziert. Welchen Einfluss dieses Proteins auf den Knorpelstoffwechsel unterschiedlicher humaner Chondrozytenzelllinien hat wurde Gegenstand neuer Untersuchungen. Dieses Interesse bildete die Grundlage zur Themenstellung der vorliegenden Arbeit. Die Wirkung von CYR61 auf die chondrogene Differenzierung sollte anhand zweier verschiedener Zelllinien (C-28/I2 und T/C-28a2) untersucht werden. Hierbei wurde das Expressionsverhalten von unterschiedlichen Chondrozytenmarkern unter der Wirkung von CYR61 untersucht. Die CYR61-abhängigen Effekte wurden durch RT-PCR nachgewiesen und die Ergebnisse unter serumhaltigen sowie serumreduzierten Versuchsbedingungen hierbei miteinander verglichen.