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Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten.
Einfluß der Atherosklerose auf den NO:cGMP Signalweg am Modell des cholesteringefütterten Kaninchen
(2002)
Atherosklerose ist Volkskrankheit und Todesursache Nummer Eins in den sogenannten entwickelten Ländern. Ursachen für die meisten Folgeerkrankungen sind Minderperfusion und Gefäßverschluß, verursacht durch Ablagerungen und Verdickung der Gefäßwand und durch einen pathologisch erhöhten Gefäßtonus. Mehrere zelluläre Signalwege, die im Gesunden eine Vasodilatation hervorrufen können, sind in atherosklerotischen Gefäßen gestört, so auch der NO:cGMP-Signalweg. Der Einfluß der Atherosklerose auf den NO-abhängigen Teil des Signalwegs, also NO-Produktion und -Abbau, sowie Diffusion von NO zu den glatten Muskelzellen, ist seit längerem bekannt. In dieser Studie zeigen wir, daß im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung auch der NO-unabhängige Teil des Signalwegs in erheblichen Maße gestört ist. Die Expression und Aktivität der Enzyme lösliche Guanylatzyklase (sGC) und cGMP-abhängige Proteinkinase-I ist vor allem in der neugebildeten Neointima reduziert. P-VASP, ein Indikator der Aktivität des gesamten NO:cGMP-Signalwegs, ist in eindrucksvoller Weise reduziert. Die Enzyme des NO-unabhängigen Teils des NO:cGMP-Signalwegs werden in zunehmenden Maße pharmakologisch beeinflußbar. Die Ergebnisse dieser Studie stellen somit eine wichtige Grundlage für neue Therapieansätze der Atherosklerose dar.
Retrospektive Studie (1995-1999) aus dem Institut für Röntgendiagnostik der Universität Würzburg mit insgesamt 206 Patienten. Die Offenheitsraten der insg. 535 radiologischen Interventionen (PTA, Stentimplantationen) der Becken- und Beinarterien wurden in einer statistischen Auswertung nach Kaplan-Meier dargestellt. Dabei wurden die Ergebnisse auf die unterschiedlichen Grundparameter (Alter, Geschlecht, Risikofaktoren, Fontaine-Stadium, Gefäßlokalisation, Runoff, Stenosenart, Stenosenanzahl, Interventionsart...) bezogen.
Atherosklerose und Hypercholesterinämie führen zu einer deutlichen Beeinträchtigung der vaskulären Funktion. Neben der bereits vielfältig beschriebenen Hemmung der endothelvermittelten Vasodilatation durch oxidierte Lipoproteine, fanden sich in den vergangenen Jahren auch zunehmend Hinweise für ein verändertes Kontraktionsverhalten von Arterien unter dem Einfluss von oxidiertem LDL. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob oxidiertes Lipoprotein die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion verändert, durch welche Mechanismen dies geschieht und ob sich durch den Einsatz bereits bekannter und etablierter antihypertensiver Medikamente und neuerer Substanzen ein Einfluss hierauf nehmen lässt. Hierfür wurden Kontraktionsexperimente an isolierten Kaninchenaorten durchgeführt. Zu Beginn der Arbeit wurde zunächst die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion studiert, hierbei zeigte sich, dass Angiotensin II selbst bei repetitiver Stimulation zu einer Zunahme der Kontraktilität isolierter Kaninchenaorten führt. Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnte dieser Effekt durch die Blockade von Calciumkanälen nur teilweise beeinflusst werden. Hiervon ausgehend kann festgestellt werden, dass Angiotensin II zu einer Zunahme der Kontraktilität durch eine Sensibilisierung des kontraktilen Apparates gegenüber Calcium führt. Der Mechanismus der Ca2+- Sensibilisierung ist noch nicht vollständig geklärt, in vorangehenden Studien unterschiedlicher Arbeitsgruppen fanden sich jedoch viele Hinweise auf eine Rho-Kinase vermittelte Aktivitätsmodulierung der Myosin-Leichtketten-Phosphastase. Die Beteiligung der Rho-Kinase an der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion konnte durch den Einsatz des Rho-Kinase Hemmers Y27632 gezeigt werde. Nach Inkubation kam es zu einer signifikant verringerten Ausprägung der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion. Auch durch die Blockade des AT1-Rezepors konnte die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion verhindert werden, während der Einsatz eines Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitors ohne Einfluss auf die Vasomotorik blieb. Im Anschluss wurde der Effekt des oxidierten Low Density Lipoproteins auf die Angiotensin II induzierte Vasokonstriktion untersucht. OxLDL steigerte die durch eine Schwellenkonzentration von Angiotensin II hervorgerufene Kontraktion isolierter Kaninchenaortenringe um das 2,9 fache, während es den Basaltonus unkontrahierter Gefäße nicht beeinflusste. Dabei war zunächst unklar, über welchen Mechanismus diese Potenzierung der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion vermittelt wird. Durch den Einsatz eines Calciumkanalantagonisten konnte gezeigt werden, dass die OxLDL induzierte Zunahme der Kontraktilität nicht einzig durch eine Steigerung der intrazellulären Calciumionenkonzentration vermittelt ist, da dieser nur eine partiellen Effekt von etwa 40% hatte. Der Rho-Kinase-Inhibitor Y27632 führte jedoch zu einem Ausbleiben bzw. Rückgang der Potenzierung. Daher bleibt festzustellen, dass sowohl bei Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion als auch deren Potenzierung durch OxLDL die Rho-Kinase beteiligt ist. Auch eine Hemmung der Angiotensin II induzierten Vasokonstriktion durch einen AT1-Rezeptorblocker verhinderte den potenzierenden Einfluss von OxLDL. In der Hypertonus Therapie bei hypercholesterinämischen Patienten könnte der Einsatz von AT1-Rezeptorblockern und Rho-Kinase-Hemmern erfolgsversprechend sein.
Es wurde die Wirkung von oxidiertem LDL, ein ausgeprägt atherogen wirkendes Lipoprotein, auf die Zellzyklusregulation von Endothelzellen untersucht. Eine Bestimmung der Proliferation von HUVEC zeigte einen dualer Effekt von OxLDL: Niedrige Konzentrationen (1-50μg/ml)OxLDL führten zu einem Anstieg der Proliferation im Vergleich zu Kontrollzellen,wohingegen es bei höheren Konzentrationen OxLDL (100 und 200μg/ml) zu einem Absterben der Zellen kam. Im Weiteren wurde der Einfluss von OxLDL auf den Zellzyklusinhibitor p27Kip1 mittels Western Blot-Analyse und Oligonukleotid-Transfektion bestimmt.
Kaum eine Krankheit steht seit mehreren Jahrzehnten derart im Blickfeld der medizinischen und biochemischen Forschung wie die Arteriosklerose. Aktuellen Studien zu Folge könnte der Atherogenese ein entzündlicher Prozess zu Grunde liegen, bei dem CRP eine wichtige Rolle spielt. Frühere Untersuchungen gingen nur von einer Konformation des CRP aus. Wie in den 90er Jahren festgestellt wurde, scheint jedoch neben dem nCRP noch das mCRP zu existieren, das sich vom nCRP nicht nur durch seine Struktur, sondern auch seine Funktionen unterscheidet. Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Frage, ob CRP proatherogen ist und ob es diesbezüglich Unterschiede zwischen nCRP und mCRP gibt. Hierzu wurden Versuche am etablierten ApoE(-/-) - Modell durchgeführt. Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 8 Wochen mit nCRP bzw. mCRP in Form von wöchentlichen, subkutanen Injektionen behandelt. Anschließend wurde die Aorta ascendens histologisch und die Aorta abdominalis im Organbad untersucht, um das Ausmaß der atherosklerotischen Plaques und der endothelialen Dysfunktion zu bestimmen. Die histologischen Ergebnisse zeigen, dass die mit nCRP behandelten Tiere, im Vergleich zur mCRP - Gruppe, signifikant größere atherosklerotischer Plaques aufweisen. Bezüglich der endothelialen Dysfunktion konnte in Gefäßversuchen gezeigt werden, dass nCRP, jedoch nicht mCRP, die Gefäßmotilität negativ beeinflusst, was höchstwahrscheinlich auf eine verstärkte Radikalbildung durch die iNOS zurückzuführen ist. Unter Berücksichtigung der Gefäßversuche und der histologischen Ergebnisse, behaupten wir, dass nCRP die Entstehung atherosklerotischer Plaques in ApoE(-/-) - Mäusen beschleunigt, mCRP hingegen diesbezüglich protektiv wirkt. Die von uns durchgeführte Studie am ApoE(-/-) - Modell ist das erste mCRP - in vivo - Modell zur Atherosklerose. Weitere Untersuchungen diesbezüglich sind nötig, um unsere Hypothese zu untermauern und den zugrunde liegenden Mechanismus besser verstehen zu können und um Herauszufinden, ob mCRP auch unter anderen tierexperimentellen Bedingungen protektive Eigenschaften bezügliche der Atherogenese besitzt und ob sich für mCRP in Zukunft vielleicht sogar therapeutische Konsequenzen ergeben.
In dieser Arbeit wurde die Rolle der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase in der spontanen Atheroskleroseentwicklung untersucht. Die Untersuchungen wurden an Apolipoprotein E-Knockout /neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout-Mäusen und Apolipoprotein E-Knockout-Mäusen durchgeführt, die zuvor 14 bzw. 24 Wochen mit einer ‚western-type’-Diät gefüttert worden sind. Durch eine immunhistochemische Analyse konnte zunächst gezeigt werden, dass neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase in Plaques von Apolipoprotein E-Knockout Mäusen exprimiert wird. Nach 14 Wochen ‚western-type’- Diät zeigten männliche Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere eine signifikante Zunahme der %-Läsionsfläche um 66%. Im Gegensatz dazu war die %-Läsionsfläche der weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere nach 14 Wochen unverändert, zeigte aber nach 24 Wochen eine signifikante Zunahme um 32 %. Aortengesamtfläche, Körpergewicht und Plasmacholesterinspiegel waren zwischen gleichgeschlechtlichen Tieren der verschiedenen Genotypen unverändert. Der mittlere arterielle Blutdruck der weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tiere war signifikant reduziert, bei den männlichen Tieren fand sich kein Blutdruckunterschied. Dieser Befund könnte eine mögliche Erklärung für die verzögerte Plaqueentwicklung bei weiblichen Apolipoprotein E-Knockout/neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase-Knockout Tieren darstellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass ein Mangel an neuronaler Stickstoffmonoxid-Synthase zu einer deutlichen Zunahme der Atherosklerose führt, so dass ein atheroprotektiver Effekt der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase angenommen werden kann.
Insight into oxidative stress mediated by nitric oxide synthase (NOS) isoforms in atherosclerosis
(2008)
The principle product of each NOS is nitric oxide. However, under conditions of substrate and cofactor deficiency the enzymes directly catalyze superoxide formation. Considering this alternative chemistry of each NOS, the effects of each single enzyme on key events of atherosclerosis are difficult to predict. Here, we evaluate nitric oxide and superoxide production by all three NOS isoforms in atherosclerosis. ESR measurements of circulating and vascular wall nitric oxide production showed significantly reduced nitric oxide levels in apoE/eNOS double knockout (dko) and apoE/iNOS dko animals but not in apoE/nNOS dko animals suggesting that eNOS and iNOS majorly contribute to vascular nitric oxide production in atherosclerosis. Pharmacological inhibition and genetic deletion of eNOS and iNOS reduced vascular superoxide production suggesting that eNOS and iNOS are uncoupled in atherosclerotic vessels. Though genetic deletion of nNOS did not alter superoxide production, acute inhibition of nNOS showed that nNOS contributes significantly to superoxide production. In conclusion, uncoupling of eNOS occurs in apoE ko atherosclerosis but eNOS mediated superoxide production does not outweigh the protective effects of eNOS mediated nitric oxide production. We show that although nNOS is not a major contributor of the vascular nitric oxide formation, it prevents atherosclerosis development. Acute inhibition of nNOS showed a significant reduction of superoxide formation suggesting that nNOS is uncoupled. The exact mechanism of action of nNOS in atheroprotection is yet to be elucidated. Genetic deletion of iNOS reduced NADPH oxidase activity. Thus, iNOS has both direct and indirect proatherosclerotic effects, as it directly generates both nitric oxide and superoxide simultaneously resulting in peroxynitrite formation and indirectly modulates NADPH oxidase activity. We hypothesize that eNOS is coupled in the disease free regions of the vessel and contributes to nitric oxide generation whereas in the diseased region of the vessel it is uncoupled to produce superoxide (Figure 16). nNOS expressed in the smooth muscle cells of the plaque contributes to the local superoxide generation. iNOS expressed in smooth muscle cells and leukocytes of the plaque generates superoxide and nitric oxide simultaneously to produce the strong oxidant peroxynitrite.
Die Volkskrankheit Adipositas zieht eine Reihe von kostenträchtigen Komplikationen mit sich wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Endocannabinoidblocker Rimonabant ist hierbei ein viel versprechendes Medikament, mit dem nicht nur die Adipositas an sich, sondern zusätzlich auch ihre weit reichenden Komplikationen im kardiovaskulären Bereich reduziert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten an Hand 6 Monate alter diabetischer Ratten, welche für 10 Wochen mit Rimonabant behandelt wurden, aufgezeigt werden, dass Rimonabant auf verschiedenste Weise die Initialphase der Atherogenese positiv beeinflusst. Zum einen konnte die Anzahl der zirkulierenden Monozyten signifikant vermindert und auch die für die initiale Rekrutierung von Thrombozyten und Monozyten wichtigen Chemokine RANTES und MCP-1 reduziert werden. Zum anderen zeigten sich positive Effekte auf das Lipidprofil der Probanden. Ein besonderes Augenmerk lag auf dem Aktivitätszustand der Thrombozyten: Mit Rimonabant wurde sowohl die thrombozytäre Aktivierung minimiert als auch ein positiver Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion und -aggregation bestätigt. Folglich reduziert Rimonabant das kardiovaskuläre Risiko, indem es die pro-inflammatorischen und pro-atherosklerotischen Kaskaden vermindert.