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Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine seltene, heterogene Erbkrankheit. Sie weist ein sehr variables klinisches Erscheinungsbild auf, das sich aus angeborenen Fehlbildungen, hämatologischen Funktionsstörungen, einem erhöhten Risiko für Tumorentwicklung und endokrinen Pathologien zusammensetzt. Die Erkrankung zählt zu den genomischen Instabilitätssyndromen, welche durch eine fehlerhafte DNA-Schadensreparatur gekennzeichnet sind. Bei der FA zeigt sich dies vor allem in einer charakteristischen Hypersensitivität gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen (z. B. Mitomycin C, Cisplatin). Der zelluläre FA-Phänotyp zeichnet sich durch eine erhöhte Chromosomenbrüchigkeit und einen Zellzyklusarrest in der G2-Phase aus. Diese Charakteristika sind bereits spontan vorhanden und werden durch Induktion mit DNA-quervernetzenden Substanzen verstärkt. Der Gendefekt ist dabei in einem der 22 bekannten FA-Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) oder in noch unbekannten FA-Genen zu finden. Die FA-Gendefekte werden mit Ausnahme von FANCR (dominant-negative de novo Mutationen) und FANCB (X-chromosomal) autosomal rezessiv vererbt. Die FA-Genprodukte bilden zusammen mit weiteren Proteinen den FA/BRCA-Signalweg. Das Schlüsselereignis dieses Signalwegs stellt die Monoubiquitinierung von FANCD2 und FANCI (ID2-Komplex) dar. Ausgehend davon lässt sich zwischen upstream- und downstream-gelegenen FA-Proteinen unterscheiden. Letztere sind direkt an der DNA-Schadensreparatur beteiligt. Zu den upstream-gelegenen Proteinen zählt der FA-Kernkomplex, der sich aus bekannten FA-Proteinen und aus FA-assoziierten-Proteinen (FAAPs) zusammensetzt und für die Monoubiquitinierung des ID2-Komplexes verantwortlich ist. Für FAAPs wurden bisher keine pathogenen humanen Mutationen beschrieben. Zu diesen Proteinen gehört auch FAAP100, das mit FANCB und FANCL innerhalb des FA-Kernkomplexes den Subkomplex LBP100 bildet.
Durch die vorliegende Arbeit wurde eine nähere Charakterisierung dieses Proteins erreicht. In einer Amnion-Zelllinie konnte eine homozygote Missense-Mutation identifiziert werden. Der Fetus zeigte einen typischen FA-Phänotyp und auch seine Zellen wiesen charakteristische FA-Merkmale auf. Der zelluläre Phänotyp ließ sich durch FAAP100WT komplementieren, sodass die Pathogenität der Mutation bewiesen war. Unterstützend dazu wurden mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems weitere FAAP100-defiziente Zelllinien generiert. Diese zeigten ebenfalls einen typischen FA-Phänotyp, welcher sich durch FAAP100WT komplementieren ließ. Die in vitro-Modelle dienten als Grundlage dafür, die Funktion des FA-Kernkomplexes im Allgemeinen und die des Subkomplexes LBP100 im Besonderen besser zu verstehen. Dabei kann nur durch intaktes FAAP100 das LBP100-Modul gebildet und dieses an die DNA-Schadensstelle transportiert werden. Dort leistet FAAP100 einen essentiellen Beitrag für den FANCD2-Monoubiquitinierungsprozess und somit für die Aktivierung der FA-abhängigen DNA-Schadensreparatur. Um die Funktion von FAAP100 auch in vivo zu untersuchen, wurde ein Faap100-/--Mausmodell generiert, das einen mit anderen FA-Mausmodellen vergleichbaren, relativ schweren FA-Phänotyp aufwies. Aufgrund der Ergebnisse lässt sich FAAP100 als neues FA-Gen klassifizieren. Zudem wurde die Rolle des Subkomplexes LBP100 innerhalb des FA-Kernkomplexes weiter aufgeklärt. Beides trägt zu einem besseren Verständnis des FA/BRCA-Signalweges bei. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von FAAP100138, einer bisher nicht validierten Isoform von FAAP100. Durch dieses Protein konnte der zelluläre FA-Phänotyp von FAAP100-defizienten Zelllinien nicht komplementiert werden, jedoch wurden Hinweise auf einen dominant-negativen Effekt von FAAP100138 auf den FA/BRCA-Signalweg gefunden. Dies könnte zu der Erklärung beitragen, warum und wie der Signalweg, beispielsweise in bestimmtem Gewebearten, herunterreguliert wird. Zudem wäre eine Verwendung in der Krebstherapie denkbar.
Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können.
Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können.
Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens.
Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen.
The Fanconi anemia (FA) pathway is a replication-dependent DNA repair mechanism which is essential for the removal of interstrand crosslink (ICL) DNA damages in higher eukaryotes (Moldovan and D’Andrea, 2009). Malfunctions in this highly regulated repair network lead to genome instability (Deans and West, 2011). Pathological phenotypes of the disease FA which is caused by mutations in the eponymous pathway are very heterogeneous, involving congenital abnormalities, bone-marrow failure, cancer predisposition and infertility (Auerbach, 2009). The FA pathway comprises a complex interaction network and to date 16 FA complementation groups and associated factors have been identified (Kottemann and Smogorzewska, 2013). Additionally, components of nucleotide excision repair (NER), homologous recombination repair (HRR), and translesion synthesis (TLS) are involved and coordinated by the FA proteins (Niedzwiedz et al., 2004; Knipscheer et al., 2009). One of the FA proteins is the DEAH helicase FANCM. In complex with its binding partners FAAP24 and MHF1/2 it binds the stalled replication fork and activates the FA damage response (Wang et al., 2013). However, the exact steps towards removal of the ICL damage still remain elusive.
To decipher the underlying process of FA initiation by FANCM, this thesis mainly focuses on the archaeal FANCM homolog helicase-associated endonuclease for fork-structured DNA (Hef). Hef from the archaeal organism Thermoplasma acidophilum (taHef) differs from other archaeal Hef proteins and exclusively comprises an N-terminal helicase entity with two RecA and a thumb-like domain while others additionally contain a nuclease portion at the C-terminus. I solved the crystal structure of full-length taHef at a resolution of 2.43 Å. In contrast to the crystal structure of the helicase domain of Hef from Pyrococcus furiosus (pfHef), taHef exhibits an extremely open conformation (Nishino et al., 2005b) which implies that a domain movement of the RecA-like helicase motor domains of 61° is possible thus highlighting the flexibility of helicases which is required to translocate along the DNA. However, small-angle x-ray scattering (SAXS) measurements confirm an intermediate conformation of taHef in solution indicating that both crystal structures represent rather edge states. Most
importantly, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was identified as an interaction partner of Hef. This interaction is mediated by a highly conserved canonical PCNA interacting peptide (PIP) motif. Intriguingly, the presence of PCNA does not alter the ATPase nor the helicase activity of taHef, thus suggesting that the interaction is entirely dedicated to recruit taHef to the replication fork to fulfill its function. Due to a high level of flexibility the taHef-taPCNA complex could not be crystallized and therefore SAXS was utilized to determine a low-resolution model of this quaternary structure.
This newly discovered PCNA interaction could also be validated for the eukaryotic FANCM homolog Mph1 from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum (ctMph1). As the first step towards the characterization of this interaction I solved the crystal structure of PCNA from Chaetomium thermophilum (ctPCNA).
Furthermore, it was possible to achieve preliminary results on the putative interaction between the human proteins FANCM and PCNA (hsFANCM, hsPCNA). In collaboration with Detlev Schindler (Human Genetics, Würzburg) and Weidong Wang (National Institute on Aging, Baltimore, USA) co-immunoprecipitation (CoIP) experiments were performed using hsFANCM and hsPCNA expressed in HEK293 cells. Although an interaction was reproducibly observed in hydroxyurea stimulated cells
further experiments and optimization procedures are required and ongoing.
Es werden die Parameter Summe-G2/GF und G0/G1 der hochauflösenden, zweiparametrigen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Fanconi-Anämie-Patienten, bei denen mehrere Meßwerte vorliegen, im Hinblick auf Schwankungen untersucht. Nach Auswertung der Daten stellen die Werte keine konstanten Parameter für den einzelnen Patienten dar. Die Langzeitanalyse des Zellzyklusverhaltens peripherer Blutlymphozyten reflektiert jedoch weitgehend die klinische Situation der Patienten.
Fanconi Anemia Core Complex Gene Promoters Harbor Conserved Transcription Regulatory Elements
(2011)
The Fanconi anemia (FA) gene family is a recent addition to the complex network of proteins that respond to and repair certain types of DNA damage in the human genome. Since little is known about the regulation of this novel group of genes at the DNA level, we characterized the promoters of the eight genes (FANCA, B, C, E, F, G, L and M) that compose the FA core complex. The promoters of these genes show the characteristic attributes of housekeeping genes, such as a high GC content and CpG islands, a lack of TATA boxes and a low conservation. The promoters functioned in a monodirectional way and were, in their most active regions, comparable in strength to the SV40 promoter in our reporter plasmids. They were also marked by a distinctive transcriptional start site (TSS). In the 59 region of each promoter, we identified a region that was able to negatively regulate the promoter activity in HeLa and HEK 293 cells in isolation. The central and 39 regions of the promoter sequences harbor binding sites for several common and rare transcription factors, including STAT, SMAD, E2F, AP1 and YY1, which indicates that there may be cross-connections to several established regulatory pathways. Electrophoretic mobility shift assays and siRNA experiments confirmed the shared regulatory responses between the prominent members of the TGF-b and JAK/STAT pathways and members of the FA core complex. Although the promoters are not well conserved, they share region and sequence specific regulatory motifs and transcription factor binding sites (TBFs), and we identified a bi-partite nature to these promoters. These results support a hypothesis based on the co-evolution of the FA core complex genes that was expanded to include their promoters.
Die Fanconi Anämie (FA) ist eine seltene autosomal und X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die zur Gruppe der Chromosomeninstabilitäts-Syndrome gehört. Klinisch manifestiert sich die FA durch kongenitale Fehlbildungen, progressives Knochenmarkversagen und eine Prädisposition für die Entwicklung von malignen Neoplasien in frühen Jahren. Am häufigsten ist unter FA-Patienten die Entstehung einer aplastischen Anämie zu beobachten mit einer kumulativen Inzidenz von 90% im Alter von 40 Jahren (Huck et al., 2006). Vom frühen Erwachsenenalter an stellen solide Tumoren, vornehmlich Plattenepithel-Karzinome des Oropharygeal- und Genitaltraktes, das Hauptproblem dar. Auf zellulärer Ebene ist die FA durch eine hohe spontane Chromosomenbrüchigkeit verbunden mit einer erhöhten chromosomalen Sensibilität gegenüber genotoxischen Substanzen und reaktiven Sauerstoffspezies gekennzeichnet. Seit einer stetigen Verbesserung der hämatopoietischen Stammzelltransplantation durch spezifische Konditionierungsprotokolle erreichen immer mehr FA-Patienten das Erwachsenenalter. In der Literatur häufen sich Berichte von FA-Patienten, die erstmalig im Erwachsenenalter durch ein frühes Auftreten von Malignomen oder Komplikationen in der Behandlung von Neoplasien diagnostiziert werden. Neben einer erfolgreichen HSZT können auch „ milde“ Mutationen oder die Bildung eines somatischen Mosaiks für das Überleben der FA Patienten in das Erwachsenenalter verantwortlich sein. Dies bedeutet, dass sich die FA als bisher rein pädiatrisch angesehenes Krankheitsbild mehr und mehr zu einer auch das Erwachsenenalter betreffenden Entität entwickelt. In der vorliegenden Arbeit wurden 131 FA-Patienten mit einem Alter von über 20 Jahren identifiziert und in verschiedene Gruppen eingeteilt. Damit wurde es möglich, die Verteilung der Patienten hinsichtlich ihres Geschlechts, der Komplementationsgruppe sowie der vermutlichen Ursachen für ein verlängertes Überleben dokumentieren zu können. 42 Patientenbeispiele stammen aus Literaturberichten von 1964 bis 2008, Informationen über 36 Patienten wurden dem US-amerikanischen Fanconi Anemia Research Fund („FARF“) entnommen und für 53 Patienten dienten die Krankenunterlagen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg als Grundlage. Es konnte gezeigt werden, dass etwa doppelt soviel Frauen wie Männer mit FA ein Alter jenseits des 20. Lebensjahres erreichten. Eine Zuordnung zu einer Komplementationsgruppe war bei 66 Patienten möglich. Diese ließ erkennen, dass im erwachsenen Patientenkollektiv die Komplementationsgruppen FA-A, FA-C, FA-D2, FA-G, FA-I und FA-J, jedoch keine der Gruppen FA-B, FA-D1, FA-E, FA-F, FA-L, FA-M und FA-N vertreten sind. Weiterhin wurden die erwachsenen FA-Patienten in vier verschiedene Gruppen nach der wahrscheinlichen Ursache ihres Überlebens eingeteilt werden: 26% erhielten eine erfolgreiche hämatopoietische Stammzelltransplantation, 17% entwickelten im Verlauf ein Mosaik, 4% konnten als Träger einer milden Mutation identifiziert werden. Die genaue Ursache für ein verlängertes Überleben bleibt jedoch bei 53% der FA-Patienten unbekannt, da Informationen bezüglich früherer Therapien und vor allem die Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen fehlen. Bemerkenswert ist, dass der Großteil der über 50Jährigen ein Mosaik aufwies, während in dieser Altersgruppe Patienten mit erfolgreicher HSZT oder einer milden Mutation nur zu einem geringen Teil vertreten sind. Die für die FA charakteristische genetische Instabilität spiegelt sich in der hohen Anzahl (64%) von FA-Patienten wider, die auch ohne vorhergehende HSZT ein Plattenepithel-Karzinom (SCC) entwickelten. Nach HSZT manifestierte sich bei 25% der erwachsenen FA-Patienten ein SCC. Die Beachtung der medizinischen Besonderheiten des Erwachsenenalters ist von großer Bedeutung in der Prävention und Therapie von Komplikationen der FA und erfordert modifizierte Behandlungsstrategien für erwachsene FA-Patienten. Sorgfältig dokumentierte Langzeitbeobachtungen sowie die Identifizierung von Komplementationsgruppen und Mutationen bei jedem einzelnen FA-Patienten bilden die Grundlage für prognostische Aussagen, die derzeit nur beschränkt möglich sind. In zukünftigen Untersuchungen werden eine Reihe bisher ungelöster Fragen zu beantworten sein. Hierzu gehören die mögliche Rolle der Androgentherapie hinsichtlich der Förderung einer Mosaikbildung, die Faktoren, welche zu der auffälligen Geschlechterverteilung im Erwachsenenalter beitragen, sowie die Erforschung der Bedeutung „milder“ Mutationen und somatischer Reversionen. Die insgesamt sehr beeindruckenden Langzeitverläufe sowie die hohe Inzidenz von nicht-hämatologischen Komplikationen/Malignomen zeigen deutlich, dass sich die Fanconi Anämie zunehmend auch zu einer internistisch/onkologischen Krankheit entwickelt.
Die Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch äußerst heterogene, autosomal rezessiv und X-chromosomal vererbte Erkrankung dar. Sie ist gekennzeichnet durch chromosomale Instabilität, ein chronisch progredientes Knochenmarkversagen, multiple kongenitale Fehlbildungen und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Auf zellulärer Ebene ist die FA durch eine erhöhte spontane Chromosomenbrüchigkeit sowie einer Hypersensitivität gegenüber DNA-schädigenden Agenzien charakterisiert. Bislang konnten 13 Komplementations-gruppen (FA-A bis FA-N) und ihre jeweiligen Gene identifiziert werden. Die FA-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrang-brüchen. Die breite genetische Heterogenität der Fanconi Anämie und die große Anzahl privater Mutationen, aufgrund derer kaum interindividuelle Vergleiche möglich sind, erschweren eine Genotyp-Phänotyp Korrelation ebenso wie der compound-heterozygote Mutationsstatus vieler FA-Patienten. Bisherige Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Art der jeweiligen Mutation einen größeren Einfluß auf die phänotypische Ausprägung der Erkrankung hat als die Art des betroffenen Gens. Zusätzlich zeichnet die Fanconi Anämie eine große phänotypische Variabilität aus, die sich in höchst unterschiedlichen Krankheitsausprägungen und –verläufen äußert. Um aussagekräftige Genotyp-Phänotyp Korrelationen etablieren zu können, bedarf es einer ausreichenden Anzahl von FA-Patienten, bei denen sowohl die Komplementationsgruppe als auch die zugrunde liegende Mutation eindeutig definiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden exemplarisch die Krankheitsverläufe einiger Patienten (4 x FA-A, 1 x FA-B, 3 x FA-C, 1 x FA-D2 und 2 x FA-G) analysiert und mit den jeweiligen molekulargenetischen Befunden korreliert. Im Anschluss daran wurden in der Literatur beschriebene Genotyp-Phänotyp Korrelationen erläutert, verschiedene Mechanismen der phänotypischen Variabilität dargestellt und abschließend prägnante Kasuistiken nochmals hervorgehoben.
In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5’-3’ helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as “partner and localizer of BRCA2”. In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research.
Unter Fanconi Anämie versteht man eine rezessiv vererbbare Multisystem-Erkrankung, die einhergeht mit erhöhter spontaner Chromosomenbrüchigkeit, sowie erhöhter Anfälligkeit für toxische Substanzen, wie Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybutan (DEB).Gentherapeutische Versuche scheitern bei FA letztlich daran, dass bei fortgeschrittener aplastischer Anämie (= Knochenmarkversagen) die Gewinnung der zur erfolgreichen Transduktion erforderlichen Mengen an CD34 positiven Stamm-Blutzellen schwierig bis unmöglich ist. Die Fortschritte bei den Fremdspender-Transplantationen lassen erwarten, dass zukünftig nahezu alle FA-Patienten mit dieser Therapieform mit guten Erfolgsaussichten behandelt werden können. Insofern ist auch zu erwarten, dass die Option einer somatischen Gentherapie - trotz vielversprechenden Ergebnissen - zukünftig wieder an Bedeutung verlieren wird.
Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex.