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Charakterisierung von IL-9+ T-Zellen bei Patientinnen und Patienten mit Rheumatoider Arthritis
(2022)
Die Rheumatoide Arthritis ist eine chronische Autoimmunerkrankung, deren Pathogenese noch unvollständig verstanden ist. Eine Dysbalance von pro- und antiinflammatorischen T-Helferzellen ist an der Entzündungsreaktion wesentlich beteiligt. Die Rolle von proinflammatorischen Th17-Zellen und regulatorischen Tregs ist bereits recht gut erforscht und bietet bereits erfolgreiche Therapieansätze. Umstritten bleibt die Rolle der sogenannten Th9-Zellen, welche pro- und antiinflammatorische Wirkungen zu vereinen scheinen. Die vorliegende Untersuchung umfasst die Daten von 7 RA-Patientinnen und -Patienten und 10 gesunden Kontrollen. Nach Isolation von naiven CD4+ T-Zellen erfolgte eine durchflusszytometrische Phänotypisierung der T-Zellen. Diese Phänotypisierung zeigte keinen relevanten Unterschied zwischen Pat und HD. Im Anschluss an eine 3-tägige Zellkultur von naiven und nicht naiven CD4+ T-Zellen unter Th9- und Th17-Stimulation erfolgte eine Auswertung mittels Durchflusszytometrie, RT-PCR und ELISA. Hierbei wurde eine sehr ähnliche Wirkung beider Stimuli auf die T-Zelldifferenzierung, die Zytokinproduktion und die Expression von Oberflächenmarkern beobachtet. Insbesondere die IL-9-Produktion wurde durch beide Stimuli signifikant induziert. Es scheint, dass IL-9-produzierende Zellen durch unterschiedliche Differenzierungswege induziert werden. Dies unterstützt die kontroverse Hypothese, dass Th9-Zellen keinen eigenständigen T-Helferzellsubtyp darstellen. Im Vergleich zu den Pat in Remission war die induzierte Zytokinproduktion (IL-9, IL-17, IFNγ) bei den HD betont. Dies liegt vermutlich an unspezifischen Effekten durch die immunsuppressive Therapie. Bei den beiden Patientinnen und Patienten mit der höchsten Krankheitsaktivität jedoch wurde die höchste IL-9-Konzentration in den Überständen nach Stimulation festgestellt. Ein IL-9-Exzess bzw. eine IL-9-Blockade hatte keinen signifikanten Einfluss auf die T-Zelldifferenzierung, die Zytokinproduktion und die Expression der Oberflächenmarker und des Transkriptionsfaktors. Das Vorliegen eines relevanten IL-9-regulierenden, autokrinen Mechanismus ist daher unwahrscheinlich. Zusammenfassend ergeben sich Hinweise, dass es sich bei IL-9-produzierenden Zellen aufgrund der diversen Differenzierungswege nicht um einen eigenständige T-Helferzellsubtyp handelt. Es benötigt einen sehr gut ausbalancierten Zytokincocktail und vermutlich eine längere Kulturzeit, um tatsächlich Th9-Zellen zu polarisieren. Ob diese in vivo vorkommen und eine Rolle in der Pathogenese der RA spielen ist zum jetzigen Zeitpunkt ebenso unklar wie die Rolle des IL-9 in der Pathogenese der RA. Daher kommt IL-9 als therapeutisches Ziel nach jetziger Kenntnis nicht in Betracht.
Einfluss einer Prednisolon-Behandlung auf B-Zell-Populationen bei Patienten mit HIV-Infektion
(2021)
Die HIV-Infektion wird von einer Hyperimmunaktivierung begleitet, die vermutlich eine treibende Kraft in der Pathogenese der Entwicklung von AIDS darstellt. Die Rolle der B-Zellen im Rahmen dieser Veränderungen und dem Einfluss einer Prednisolontherapie wird durch die ProCort-Studie genauer beschrieben. Diese stellt eine zweijährige, Placebo-kontrollierte, randomisierte Doppelblindstudie dar, bei der die Patienten 5mg Prednisolon täglich einnahmen. Mittels durchflusszytometrischen Messungen wurden bestimmte B-Zellpopulationen differenziert und quantifiziert. Die resultierenden Ergebnisse wurden weiterhin mit bekannten Immunaktivierungsmarkern korreliert.
In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Studienteilnehmerinnen durch eine Prednisolontherapie signifikant mehr Memory-B-Zellen bzw. resting Memory-B-Zellen im Vergleich zur Placebogruppe aufweisen.
Ferner konnte die Bedeutung der B-Zellen als prognostischer Marker der HIV-Infektion dadurch unterstützt werden, dass die genannten B-Zellreihen signifikant negative Korrelationen zu anderen, bereits etablierten Progressionsmarkern (CD4/CD8-Ratio, CD8/CD38/HLADR-Aktivierung, suPAR, sCD14) vorlagen.
Zusammenfassend zeigt die Arbeit, dass die Veränderungen im B-Zellkompartment Teil des Immunaktiverungsprozesses im Rahmen der HIV- Infektion sind und Prednisolon modulierende Einflüsse darauf hat.
Übergewicht, das als Volkskrankheit ein wachsendes globales Problem darstellt, ist mit mehreren folgenreichen Komorbiditäten behaftet und die Assoziation der Erkrankung mit nachweisbarer Schädigung des Erbguts durch oxidativen Stress ist mittlerweile unangefochten. In der vorliegenden Studie wurden periphere Lymphozyten stark bis morbid adipöser Patienten mit Hilfe des Mikrokern-Assays untersucht und es konnte – begleitend zu der zu erwartenden BMI-Abnahme – eine signifikante Reduktion des Genomschadens durch Magenbypass bzw. Sleeve-Gastrektomie 12 Monate postoperativ detektiert werden. Daneben demonstrierte die Analyse zusätzlich erhobener Patientendaten, die u. a. Nüchternglucose, HbA1c, Blutdruck und Herzfrequenz sowie ein Blutbild der Patienten (inklusive CRP als Entzündungsmarker, Transaminasen, gGT sowie Lipidprofil) umfasste, eine deutliche Besserung vieler Parameter bis auf teilweise wieder physiologische Normwerte. All diese Ergebnisse stützen die These der metabolischen Wirksamkeit sowohl des Roux-en-Y-Magenbypass als auch der Sleeve- Gastrektomie. Ihre Bedeutung liegt nicht zuletzt in der angenommenen Reduktion des Krebserkrankungsrisikos, da jeweils ein Zusammenhang mit der Adipositas an sich, dem Diabetes und durch oxidativen Stress verursachter DNA-Schädigung besteht. Mit Blick auf eine gegenwärtig in der Forschung diskutierte potentielle therapeutische Anwendung von Antioxidantien zur Reduktion von Erbgutschädigungen, die durch oxidativen Stress zustande kommen, wurden die Substanzen Tricetinidin, Curcumin und Resveratrol im Rahmen des Mikrokerntests an HL60- und NRK-Zellen untersucht, in denen mit der Mischung aus Insulin und Angiotensin II eine gentoxische Wirkung erzielt worden war.
The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms.
Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten.
Analyse der ontogenetischen Veränderungen in B-Zell-Subpopulationen im Kindes- und Erwachsenenalter
(2011)
B-Lymphozyten sind die zellulären Träger der humoralen Immunität des adaptiven Immunsystems. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei Immundefekten und Autoimmunprozessen. In dieser Arbeit sollen Entwicklungsveränderungen der peripheren B-Zell-Populationen von der Kindheit bis zum Erwachsenenalter charakterisiert und altersabhängige Referenzwerte generiert werden. In einer durchflusszytometrischen Analyse wurden dafür sowohl relative als auch absolute Häufigkeiten für naive B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen, Transitionalzellen, Plasmablasten und CD21 low CD38 low B-Zellen untersucht. Die meisten B-Zell-Subpopulationen zeigen spezifische ontogenetische Veränderungen.
Newly isolated lymphocytes from mousespleensexpress the c-fos oncogene even in the absence of mitogen with maximal mRNA levels 60 min post preparation of single cell suspension, whereas c-myc mRNA Ievels increase only after mitogenic Stimulation with maximal mRNA Ievels 6 h post Stimulation. The half-lives of c-fos mRNA are generally very short; they increase from 14 min (after 30 min of culture) to 70 min (after 2 h of culture). The half-lives of c-myc mRNA decrease from 50 min (at 2 and 6 h post stimulation with concanavalin A) to 12 min (at 48 h post stimulation). The c-fos gene transcription is already tumed on in time-0 lymphocytes 10 min after disruption of the organ structure of the spleens and is down-regulated after 2 h and later. In nuclear run-on experiments with nonstimulated lymphocytes there is already significant transcription of the first exon of c-myc, but almost no elongation of the transcript to exon 2 and 3. In concanavalin A-treated lymphocytes elongation is stimulated about 5-fold within 6 h and returns to background levels at 48 h post Stimulation. · The nuclear run-on analyses of nonactivated lymphocytes showed a signal for RNA complementary to c-myc mRNA detected with a probe specific for the exon 1/intron 1 boundary of c-myc, which disappeared with increasing time of concanavalin A Stimulation. This anti-sense transcription may play a role in regulating the elongation of cmyc transcripts.