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Das Multiple Myelom stellt in Deutschland die zweithäufigste hämatologische Neoplasie dar. Im Rahmen der Induktionstherapie mit anschließender autologer Stammzelltransplantation werden gehäuft kardiotoxische Substanzen eingesetzt; eine der schwerwiegendsten kardialen Nebenwirkung hierdurch ist die Chemotherapie-induzierte Herzinsuffizienz. In bis zu 10 % der Fälle ist das Multiple Myelom mit einer kardialen Amyloidose (AL-Amyloidose) assoziiert. Deren klinischen Symptomatik kann gehäuft ebenfalls mit Zeichen der Herzinsuffizienz einhergehen. Die Echokardiographie stellt für die Diagnostik der Herzinsuffizienz den Goldstandard dar.
Ziel dieser retrospektiven Kohortenstudie (AmcorRetro-Studie) war es durch den Vergleich der echokardiographischen Parameter vor/nach Induktionstherapie mögliche kardiotoxische Effekte und prognostischer Relevanz während der Therapie zu bestimmen. Des Weiteren erfolgte die Evaluation der Prävalenz der kardialen Amyloidose. In einer weiteren Analyse erfolgte pulmonaler Parameter mittels Lungenfunktionsdiagnostik während des Therapieverlaufes. Initial waren 325 Patienten, die im Rahmen der Therapie des Multiplen Myeloms in den Jahren von 2004 bis 2011 mindestens einmal an der Universitätsklinik Würzburg autolog stammzelltransplantiert wurden, eingeschlossen. In der hier vorliegenden Arbeit mit dem Schwerpunkt der echokardiographischen Endpunkte befinden sich 100 Patienten in der Kohorte, bei denen mindestens zwei serielle Echokardiographien (vor und nach Induktion) vorlagen.
In der Analyse der echokardiographischen Parameter (Follow-up im Median 13 Monaten) konnte eine signifikante Reduktion der linken Vorhofparameter nachgewiesen werden (LADs: -1,5 mm, p = 0,009; Septumdicke: - 1 mm, p = 0,001). Es gab keine signifikanten Einflüsse auf die linksventrikuläre Pumpfunktion (vor/nach der Therapie ≥ 55%, p = 0,24), allerdings entwickelten drei Patienten eine Abnahme der systolischen Funktion < 50 % (p = 0,08). Im Gegensatz dazu zeigte sich eine signifikante Zunahme der diastolischen Dysfunktion um 16,5 % (p = 0,002). In der univariaten Cox-Regressionsanalyse war eine höhere systolische Pumpfunktion mit einem signifikanten Überleben assoziiert (HR= 0,89; p = 0,05).
In unser Kohorte hatten sieben Patienten (N = 7/100) vor Induktion den histologischen Nachweis einer Amyloidose (Prävalenz 7 %), in zwei Fällen mit kardialer Beteiligung (N= 2/100).
Im Vergleich der Lungenfunktionsdiagnostik (vor/nach Induktion) zeigte sich eine signifikante Zunahme des Residualvolumens (p = 0,04). In der univariaten Cox- Regressionsanalyse war eine hohe Vitalkapazität sowie hohe Einsekundenkapazität mit einem signifikanten Überlebensvorteil assoziiert. Dieser Trend zeigte sich ebenfalls auch nach trivariater Adjustierung für Alter und Geschlecht (VC in %: HR= 1,0; p= 0,03 und FEV1 in %: HR= 1,0; p = 0,07).
Die Studie konnte mit der hier nachgewiesenen Prävalenz von 7 % bestätigen, dass die kardiale Amyloidose eine seltene Folgeerkrankung des Multiplen Myeloms ist. Die Stammzell-transplantation hat sowohl positive (Reduktion LADs, Septumdicke) als auch negative Auswirkungen (Anstieg diastolische Dysfunktion, im Trend Zunahme der Patienten mit eingeschränkter systolischer Funktion) auf die kardiale Funktion. Die systolische Funktion war als einziges prognoserelevant. Unter der Chemotherapie konnte eine Zunahme des Residualvolumens und somit eine direkte Lungenschädigung beobachtet werden.
Das multiple Myelom ist trotz intensiver Forschung eine bisher unheilbare maligne Plasmazellerkrankung. Für jüngere Patienten ohne relevante Komorbiditäten ist die Behandlung mit einer Hochdosistherapie gefolgt von einer autologen Stammzelltransplantation der Goldstandard. Bei einer geringen Rate an therapiebedingter Mortalität erzielt diese eine hohe Rate an kompletten Remissionen und damit die Wahrscheinlichkeit für ein längeres Überleben. Um die optimale Konditionierungstherapie zu finden, wurde eine Vielzahl von Chemotherapeutika, teilweise gekoppelt mit Ganzkörperbestrahlung, getestet.
In dem in dieser Dissertation schwerpunktmäßig analysierten Langzeit-Datensatzes der „DSMM I“-Studie erfolgte der prospektive Vergleich einer Doppelhochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und zweimaliger autologer Stammzelltransplantation und einer Einfachhochdosis-Therapie mit modifizierter Ganzkörperbestrahlung, Busulfan und Cyclophosphamid und einfacher autologer Stammzelltransplantation. Es wurde untersucht, ob sich eines der beiden Konditionierungsschemata hinsichtlich des ereignisfreien Überlebens, des Gesamtüberlebens, des maximalen Ansprechens auf die Therapie oder der Toxizität überlegen zeigte. Bisher publizierte Studien wiesen einen Vorteil der Tandem-Hochdosistherapie gegenüber der Einfachhochdosis-Therapie nach. In dieser Studie hatten beide Therapiegruppen ein exzellentes Gesamtüberleben. Es zeigte sich jedoch keine Überlegenheit einer der Therapien für das ereignisfreie und Gesamtüberleben, trotz signifikant höherer Ansprechrate unter Melphalan. Nach modifizierter Ganzkörperbestrahlung war, wie bereits in anderen Studien beschrieben, die Rate an Nebenwirkungen signifikant erhöht. Die Patienten litten vor allem unter Mukositis, Schmerzen und Pneumonitis. Somit ist die Doppelhochdosistherapie mit Melphalan Therapie der Wahl.
Die mediane Nachbeobachtungszeit von knapp 7 Jahren ist im Gegensatz zu vielen anderen Publikationen sehr viel länger als das mediane ereignisfreie Überleben. Dies spricht für die Validität der Daten.
Das Multiple Myelom ist eine hämatologische Erkrankung, die durch die Proliferation von Plasmazellen und die Produktion von Antikörpern oder deren Leichtketten gekennzeichnet ist. Eine frühe Diagnosestellung durch Detektion sowohl intra- als auch extramedullärer Manifestationen ist für die Einleitung einer effektiven Therapie von entscheidender Bedeutung. Ebenso bedeutsam ist ein wirksames Therapiemonitoring. Wichtige diagnostische Modalitäten sind bei beiden Fragestellungen tomografische, bildgebende Verfahren. Hierbei wurde die Effektivität der 18F-FDG-PET/CT im Rahmen der Diagnose, des Stagings und der Prognoseabschätzung bereits nachgewiesen. Dennoch ist ihr klinischer Nutzen durch die geringe Sensitivität bei Detektion von diffusem Knochenmarksbefall und Vorliegen sowohl falsch positiver als auch falsch negativer Befunde limitiert.
Die vorliegende Arbeit hat untersucht, ob der aminosäurebasierte Tracer 11C-MET über spezifische Eigenschaften verfügt, die eine höhere Sensitivität und Spezifität in der Detektion von Myelomzellen ermöglichen und ob der Radioligand dem etablierten Glukoseanalogon 18F-FDG überlegen ist. Hierfür wurden drei etablierte humane Myelomzelllinien, sowohl nativ als auch nach 48-stündiger Therapie mit dem Proteasominhibitor Carfilzomib, mit 18F-FDG und 11C-MET inkubiert und mithilfe eines Gammastrahlungszählers beurteilt. Zudem wurde untersucht, ob die Traceraufnahme mit spezifischen Charakteristika der Tumorbiologie korreliert. So wurde die Oberflächenexpression von CD138 und CXCR4, die intrazelluläre Expression der Leichtketten κ/λ und die Proliferation der Zelllinien mittels Durchflusszytometrie vor und nach Behandlung mit Carfilzomib eruiert.
Die unbehandelten Zellen zeigten, verglichen zu 18F-FDG, bereits nach kürzester Inkubationsdauer eine 3-3,5-fach höhere 11C-MET Retention. Weiterhin zeigte sich die 11C-MET-Aufnahme nach Behandlung aller Zellreihen insgesamt marginal höher als die 18F-FDG-Aufnahme, während die Reduktion der 11C-MET-Anreicherung im prä- zu posttherapeutischen Vergleich für alle drei Zelllinien signifikant war.
Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtungen liefert die Myelombiologie: eine erhöhte Aufnahme der radioaktiv markierten Aminosäure durch MM-Zellen könnte durch eine Zunahme der Zellproliferation und insbesondere durch eine Steigerung der Proteinsynthese im Rahmen der überschießenden Produktion von M-Protein bedingt sein. In Zusammenschau könnte 11C-MET mit höherer Sensitivität Myelommanifestationen detektieren, wodurch ggf. Läsionen mit geringem Metabolismus dargestellt und eine bessere Beurteilung des Krankheitspogresses erfolgen könnte. Zudem bietet für den klinischen Einsatz die – verglichen zu 18F-FDG – größere Differenz der 11C-MET-Retention zwischen prä- und posttherapeutischer Messung die Möglichkeit einer besseren Beurteilbarkeit des Therapieansprechens. 11C-MET birgt ggf. das Potential auch minimale aktive Restherde zu detektieren und damit Patienten einem individualisierten Therapiekonzept zuzuführen.
Ein Zusammenhang zwischen den untersuchten Biomarkern und der 11C-MET Retention bzw. deren Abnahme nach Behandlung konnte nicht gezeigt werden. Somit sollten für 11C-MET andere Biomarker herangezogen werden, um diese mit der Bildgebung zu korrelieren und zu bewerten.
Im Zuge der Bemühungen um neue, tumorspezifische Therapieansätze für die Myelomerkrankung hat sich der C-X-C-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) aufgrund seiner zentralen Rolle in der Tumorgenese als vielversprechender Angriffspunkt hervorgetan. Im Sinne eines theranostischen Konzepts wird der Rezeptor mithilfe eines radioaktiv markierten Liganden quantifiziert und anschließend von rezeptorspezifischen Radiotherapeutika als Zielstruktur genutzt. Die CXCR4-Expression ist allerdings ein höchst dynamischer Prozess mit großer inter- und intraindividueller Heterogenität, der u.a. durch eine begleitende Chemotherapie beeinflusst werden kann. Ob sich therapieinduzierte Veränderungen der Rezeptorexpression gezielt nutzen lassen, um die CXCR4-Expression zu optimieren und so die Effektivität der CXCR4-gerichteten Strategien zu steigern, wurde bislang nicht untersucht.
Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene, in der Myelomtherapie etablierte Substanzen sowohl einzeln als auch in Kombination hinsichtlich ihres Einflusses auf die CXCR4-Expression von MM-Zelllinien und primären MM-Zellen unter in vitro Bedingungen analysiert.
In den durchgeführten Experimenten zeigte sich eine hohe Variabilität der CXCR4-Expression der MM-Zellen nach Therapieinduktion, die sich als substanz-, dosis- und zeitabhängig herausstellte. Die Ergebnisse bestätigten das große Potenzial der therapieinduzierten Modulation der CXCR4-Expression. Im weiteren Verlauf sind translationale Forschungsansätze gerechtfertigt, die die Übertragbarkeit der in vitro gewonnenen Ergebnisse auf die komplexen Vorgänge im lebenden Organismus überprüfen. Langfristiges Ziel ist der Entwurf eines patientenzentrierten, multimodalen Therapiekonzepts, welches das CXCR4-gerichtete theranostische Konzept mit einer individuell angepassten, medikamentösen MM-Therapie kombiniert.
Trotz einer Vielzahl neuer Therapieansätze in den letzten Jahren, die ein längeres Überleben der Patienten ermöglichen, stellt das multiple Myelom weiterhin eine unheilbare Krankheit dar. Der Großteil der Patienten entwickelt letztlich ein rezidiviertes oder refraktäres multiples Myelom (RRMM). Bei Erstdiagnose und bei RRMM sind immunmodulierende Medikamente (IMiDs), wie Lenalidomid, eine bedeutende Therapieoption. Durch die Bindung von Lenalidomid an den CRL4CRBN Ligase Komplex entwickelt dieser eine modifizierte Substratspezifität: die Transkriptionsfaktoren IKZF1 (Ikaros) und IKZF3 (Aiolos) werden ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut. Von Krönke et al. (2014) wurde eine 30 Aminosäuren lange Sequenz (Degron) am N-Terminus von IKZF1/3 definiert, die essenziell für die Lenalidomid-Sensitivität ist. Durch Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien wurde ein signifikanter Anstieg der Mutationsfrequenz unter Therapie verzeichnet und vier Missense-Mutationen in IKZF1 und eine in IKZF3 bei Patienten mit RRMM identifiziert. Die Mutationen IKZF1-A152T und IKZF3-G159R sind innerhalb der Degron-Sequenz lokalisiert, IKZF1-E170D liegt unmittelbar daneben und IKZF1-Y413C bzw. IKZF1-R439H befinden sich am C-Terminus des Proteins. Für diese mutierten IKZF-Proteine wurden im Rahmen dieser Arbeit Expressionsvektoren kloniert und stabil in humane Myelomzelllinien transfiziert. Durch Western Analysen und funktionelle Assays der Zellviabilität (alamarBlue) bzw. des Zelltods (Annexin V-PI) wurden diese polyklonalen Sublinien bezüglich ihrer Implikationen für die Lenalidomid-Sensibilität untersucht. Nur die IKZF1-Mutationen A152T und E170D führten zu einer verminderten, bei A152T geradezu aufgehobenen, Degradierung von Ikaros nach Lenalidomid-Behandlung. In den funktionellen Analysen führte A152T ebenfalls zu stark verminderter Lenalidomid-Aktivität und zu deutlich höherem Überleben. Obwohl Sleeping Beauty Vektoren mit unterschiedlichen Expressionskassetten für Aiolos eingesetzt wurden, war keine eindeutige Überexpression von IKZF3 feststellbar, daher sind diese Ergebnisse nur eingeschränkt zu verwerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in vivo bei Patienten aufgetretene und in vitro analysierte Mutationen, gezeigt an der in der Degron-Sequenz lokalisierten Mutation IKZF1-A152T, im Zellmodell eine Resistenz vermitteln und damit Einfluss auf mögliche Therapieresistenzen haben können.
Obwohl es in den letzten 10-15 Jahren gelang, multiple MM-Genome mittels NGS auf eine kosteneffiziente Art und mit geringem Zeit- und Materialaufwand zu sequenzieren und hierdurch zum Teil bahnbrechende Erkenntnisse gewonnen werden konnten, sind molekulargenetische Untersuchungen im diagnostischen Workflow des MMs bisher nicht ausreichend implementiert, um eine personalisierte Therapieentscheidung zu ermöglichen.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit eine Gruppe an Patienten mit NDMM und RRMM anhand klinischer Parameter charakterisiert und durch Verwendung des M³P-Panels auf das Vorliegen bestimmter molekulargenetischer Veränderungen untersucht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Analyse die bisher veröffentliche M³P-Prävalenz in MM-Tumorproben bestätigt. Zu den am häufigsten mutierten Genen gehörten KRAS, NRAS, DIS3, ATM und BRAF. In der Gruppe der Patienten mit NRAS-Mutation oder del17p war die Zahl der relevanten Mutationen deutlich höher als ohne Vorliegen der entsprechenden Veränderung. Der Nachweis eines Double-Hit-Myeloms war erwartungsgemäß der stärkste ungünstige Faktor in unserer Kohorte. Unter den Patienten mit CRBN-Mutation waren alle IMiD-vorbehandelt und zeigten im Verlauf eine Refraktärität gegenüber dieser Substanzgruppe auf. Bezüglich der Überlebensanalysen bestätigten unsere Ergebnisse bereits bekannte prognostische Risikofaktoren wie Hochrisikozytogenetik, insbesondere del17p und gain1q, eine TP53-Mutation sowie ISS- und R-ISS-Stadium III.
Die Ergebnisse der Mutationsanalysen dieser Arbeit verdeutlichen den großen wissenschaftlichen und therapeutischen Nutzen, der von molekulargenetischen Untersuchungen ausgeht. Zukünftig werden auch beim MM Therapieentscheidungen auf Grundlage genetischer Diagnostik getroffen werden, mit dem Ziel die Behandlung für MM-Patienten weiter zu verbessern.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne B-Zell-Erkrankung, welche von einer großen Heterogenität auf der biologischen und klinischen Ebene sowie in der Therapieantwort geprägt ist. Durch die biologische Interpretation von whole exome sequencing (WES)-Daten der Tumor- und Normalproben von fünf MM-Patienten und sechs MM-Zelllinien (ZL) sowie dem Einbezug von publizierten next generation sequencing (NGS)-Daten von 38 MM-Patienten konnten in dieser Dissertation sowohl somatische tumorrelevante Mutationen identifiziert als auch ein MM-spezifisches Signaltransduktionsnetzwerk definiert werden. Interessanterweise wurde in fast 100 % der MM-Patienten mindestens eine Mutation und in ~50 % der MM-Patienten sogar mehr als eine Mutation innerhalb dieses Netzwerkes beobachtet, was auf eine inter- und intra-individuelle Signalweg-Redundanz hinweist, die für die individuelle Therapieentscheidung möglicherweise von Bedeutung sein könnte. Außerdem konnte bestätigt werden, dass identische, positionsspezifische und genspezifische Mutationen im MM selten wiederholt auftreten. Als häufig mutierte Gene im MM konnten KRAS, NRAS, LRP1B, FAM46C, WHSC1, ALOX12B, DIS3 und PKHD1 identifiziert werden. Interessanterweise wurde die DIS3-Mutation in der MM-ZL OPM2 gemeinsam mit einer copy neutral loss of heterozygosity (CNLOH) im DIS3-Lokus detektiert, und in der MM-ZL AMO1 wurde eine noch nicht näher charakterisierte KRAS-Mutation in Exon 4 in Verbindung mit einem copy number (CN)-Zugewinn und einer erhöhten KRAS-Genexpression gefunden. DIS3 ist ein enzymatisch aktiver Teil des humanen RNA-Exosom-Komplexes und KRAS ein zentrales Protein im RTK-Signalweg, wodurch genetische Aberrationen in diesen Genen möglicherweise in der Entstehung oder Progression des MMs eine zentrale Rolle spielen. Daher wurde die gesamte coding sequence (CDS) der Gene DIS3 und KRAS an Tumorproben eines einheitlich behandelten Patientensets der DSMM-XI-Studie mit einem Amplikon-Tiefen-Sequenzierungsansatz untersucht. Das Patientenset bestand aus 81 MM-Patienten mit verfügbaren zytogenetischen und klinischen Daten. Dies ergab Aufschluss über die Verteilung der Mutationen innerhalb der Gene und dem Vorkommen der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen des Tumors. Des Weiteren wurde die Assoziation der Mutationen mit weiteren klassischen zytogenetischen Alterationen (z.B. Deletion von Chr 13q14, t(4;14)-Translokation) untersucht und der Einfluss der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen auf den klinischen Verlauf und die Therapieantwort bestimmt. Besonders hervorzuheben war dabei die Entdeckung von sieben neuen Mutationen sowie drei zuvor unbeschriebenen hot spot-Mutationen an den Aminosäure (AS)-Positionen p.D488, p.E665 und p.R780 in DIS3. Es wurde des Weiteren die Assoziation von DIS3-Mutationen mit einer Chr 13q14-Deletion und mit IGH-Translokationen bestätigt. Interessanterweise wurde ein niedrigeres medianes overall survival (OS) für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation sowie auch eine schlechtere Therapieantwort für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation im Nebenklon im Vergleich zum Hauptklon beobachtet. In KRAS konnten die bereits publizierten Mutationen bestätigt und keine Auswirkungen der KRAS-Mutationen in Haupt- oder Nebenklon auf den klinischen Verlauf oder die Therapieantwort erkannt werden. Erste siRNA vermittelte knockdown-Experimente von KRAS und Überexpressionsexperimente von KRAS-Wildtyp (WT) und der KRAS-Mutationen p.G12A, p.A146T und p.A146V mittels lentiviraler Transfektion zeigten eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 von dem KRAS-Mutationsstatus.
Zusammenfassend liefert die vorliegende Dissertation einen detaillierten Einblick in die molekularen Strukturen des MMs, vor allem im Hinblick auf die Rolle von DIS3 und KRAS bei der Tumorentwicklung und dem klinischen Verlauf.
Die Bedeutung des seriell bestimmten Spender-Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation beim Multiplen Myelom wurde in der vorliegenden Arbeit analysiert. Die Analyse der Spenderchimärismen nach einer allogenen Stammzelltransplantation zur Messung der Krankheitslast und zur Detektion oder Prognose eines Rezidives wurde bereits in mehreren Studien für Leukämien und Lymphome untersucht, nun wurde erstmalig eine Patientengruppe mit Multiplen Myelom isoliert untersucht.
Insgesamt waren von 155 Patienten aus drei Transplantationszentren (Uniklinikum Würzburg, Uniklinikum Dresden und HELIOS Klinik Wiesbaden) 2324 Chimärismusproben (2198 aus dem peripheren Blut und 126 aus dem Knochenmark) zur Auswertung verfügbar. Die Chimärismusanalyse wurde durch die AgenDix GmbH – Applied Genetic Diagnostics – in Dresden durchgeführt und freundlicherweise bereitgestellt.
Abgesehen von der Überprüfung des Engraftments scheint die Analyse des seriell bestimmten Spender-Chimärismus nur einen begrenzten Aussagewert für das Krankheitsmanagement beim Multiplen Myelom zu haben. Durch die Analyse konnte nur in etwas mehr als einem Drittel der Fälle der Krankheitsprogress detektiert werden, obwohl knapp die Hälfte der Patienten einen Krankheitsprogress nach der allogenen Stammzelltransplantation aufwiesen. Insbesondere die Patienten mit einer extramedullären Manifestation als Rezidiv und einer geringen Knochenmarkfiltration wurden nicht ausreichend erfasst.
Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer Kälteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abhängigkeit von seiner Lokalisation übernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in primären MM-Zellen exprimiert ist. Für die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zunächst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminosäure 102) in der Kälteschockdomäne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukleäres YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse stützen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 könnte über diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress schützen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpräzipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem primären Maus-Plasmazelltumor durchgeführt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs gehören Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus bestätigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die für den malignen Phänotyp von MM-Zellen wichtig sein können: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedullären MM-Zellen, während MYC erst in extramedullärem MM-Tumormaterial verstärkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 für die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 führte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das Überleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgeführt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilität von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC für das Überleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivität und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 für die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine trägt zum Wachstum und Überleben von malignen Plasmazellen bei.
Das Multiple Myelom (MM) ist ungeachtet neuer medikamentöser Therapien weiterhin eine für die allermeisten Patienten unheilbare Erkrankung. Aktuelle Whole-Genome-Sequenzierungen konnten die Annahme, dass hierfür die genetische Heterogenität des MM verantwortlich ist, bestätigen. Um dieses onkogene Signalnetzwerk auf effiziente Weise zu untersuchen, wurde ein induzierbares Knock-down-System basierend auf der weitverbreiteten RNA-Interferenz und dem neuen, innovativen Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) entwickelt. Die Etablierung des SBTS im MM zeigte, dass die CMV-Promotor-vermittelte EGFP-Expression über 231 Tage stabil ist. Die Verwendung des SBTS ermöglicht es, Zellen bei niedrigster biologischer Schutzstufe (S1) stabil zu transfizieren. Am Beispiel des MAPK-Signalweges konnten stabile shRNA-vermittelte Knock-downs in verschiedenen MM-Zelllinien erfolgreich durchgeführt werden. Um ein induzierbares Tet-On-System zur shRNA-Expression zu erstellen, wurden zum einen dem verwendeten H1-Promotor zwei TetO-Sequenzen hinzugefügt. Zum anderen wurde durch die Verwendung eines zweiten, neu konstruierten SBTS Vektors mit anderer Selektionsresistenz in den verwendeten Zellen das Tet-Repressor-Protein (TetR) stabil exprimiert. Die notwendige Expression von TetR konnte nur mittels CAG-Promotors erreicht werden. Am Beispiel von ERK2 konnte gezeigt werden, dass es durch die stabile Transfektion und die Induktion des Knock-downs mit Doxycyclin möglich ist, den Knock-down Effekt zu erzielen. Das etablierte Plasmid-basierte System stellt somit ein versatiles, einfach anwendbares, kostengünstiges und zeitsparendes Werkzeug dar, induzierbare Knock-downs durch RNA-Interferenz für einzelne oder mehrere Proteine gleichzeitig zu erzielen. Es ist davon auszugehen, dass die Anwendung aufgrund der Verwendung etablierter Techniken und der leichten Modifizierbarkeit nicht nur auf das MM begrenzt sein wird.