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African trypanosomes cause sleeping sickness in humans and nagana in cattle. These unicellular parasites are transmitted by the bloodsucking tsetse fly. In the mammalian host’s circulation, proliferating slender stage cells differentiate into cell cycle-arrested stumpy stage cells when they reach high population densities. This stage transition is thought to fulfil two main functions: first, it auto-regulates the parasite load in the host; second, the stumpy stage is regarded as the only stage capable of successful vector transmission. Here, we show that proliferating slender stage trypanosomes express the mRNA and protein of a known stumpy stage marker, complete the complex life cycle in the fly as successfully as the stumpy stage, and require only a single parasite for productive infection. These findings suggest a reassessment of the traditional view of the trypanosome life cycle. They may also provide a solution to a long-lasting paradox, namely the successful transmission of parasites in chronic infections, despite low parasitemia.
The highly motile and versatile protozoan pathogen Trypanosoma brucei undergoes a complex life cycle in the tsetse fly. Here we introduce the host insect as an expedient model environment for microswimmer research, as it allows examination of microbial motion within a diversified, secluded and yet microscopically tractable space. During their week-long journey through the different microenvironments of the fly´s interior organs, the incessantly swimming trypanosomes cross various barriers and confined surroundings, with concurrently occurring major changes of parasite cell architecture. Multicolour light sheet fluorescence microscopy provided information about tsetse tissue topology with unprecedented resolution and allowed the first 3D analysis of the infection process. High-speed fluorescence microscopy illuminated the versatile behaviour of trypanosome developmental stages, ranging from solitary motion and near-wall swimming to collective motility in synchronised swarms and in confinement. We correlate the microenvironments and trypanosome morphologies to high-speed motility data, which paves the way for cross-disciplinary microswimmer research in a naturally evolved environment.
Background
Human African Trypanosomiasis (HAT) also called sleeping sickness is an infectious disease in humans caused by an extracellular protozoan parasite. The disease, if left untreated, results in 100% mortality. Currently available drugs are full of severe drawbacks and fail to escape the fast development of trypanosoma resistance. Due to similarities in cell metabolism between cancerous tumors and trypanosoma cells, some of the current registered drugs against HAT have also been tested in cancer chemotherapy. Here we demonstrate for the first time that the simple ester, ethyl pyruvate, comprises such properties.
Results
The current study covers the efficacy and corresponding target evaluation of ethyl pyruvate on T. brucei cell lines using a combination of biochemical techniques including cell proliferation assays, enzyme kinetics, phasecontrast microscopic video imaging and ex vivo toxicity tests. We have shown that ethyl pyruvate effectively kills trypanosomes most probably by net ATP depletion through inhibition of pyruvate kinase (Ki = 3.0\(\pm\)0.29 mM). The potential of ethyl pyruvate as a trypanocidal compound is also strengthened by its fast acting property, killing cells within three hours post exposure. This has been demonstrated using video imaging of live cells as well as concentration and time dependency experiments. Most importantly, ethyl pyruvate produces minimal side effects in human red cells and is known to easily cross the blood-brain-barrier. This makes it a promising candidate for effective treatment of the two clinical stages of sleeping sickness. Trypanosome drug-resistance tests indicate irreversible cell death and a low incidence of resistance development under experimental conditions.
Conclusion
Our results present ethyl pyruvate as a safe and fast acting trypanocidal compound and show that it inhibits the enzyme pyruvate kinase. Competitive inhibition of this enzyme was found to cause ATP depletion and cell death. Due to its ability to easily cross the blood-brain-barrier, ethyl pyruvate could be considered as new candidate agent to treat the hemo-lymphatic as well as neurological stages of sleeping sickness.
Die Afrikanische Schlafkrankheit ist eine tropische Infektionskrankheit und gehört zu den vernachlässigten Krankheiten. Am stärksten von Schlafkrankheit betroffen ist die Demokratische Republik Kongo. Anfang des 20. Jahrhunderts war ihre Bekämpfung von großem Interesse für die Kolonialmächte und eine wirkungsvolle Bekämpfung konnte erreicht werden. Nach der Unabhängigkeit der afrikanischen Staaten kam es jedoch erneut zu Ausbrüchen. Diese Arbeit analysiert die historische Entwicklung und den aktuellen Stand der Bekämpfung und Kontrolle der Schlafkrankheit in der DR Kongo und untersucht Charakteristiken und Aufgabenbereiche aktueller nationaler und internationaler Organisationen anhand von veröffentlichter Literatur, Site Visits und Experteninterviews vor Ort.
Die akute Form der afrikanischen Schlafkrankheit wird durch den Parasiten Trypanosoma brucei rhodesiense verursacht und führt unbehandelt zum exitus letalis. Da derzeit nur wenige, zum Teil hoch toxische Substanzen mit zunehmender Resistenzlage klinische Anwendung finden, ist die Entwicklung neuer Medikamente dringend erforderlich. Rhodesain ist eine essenzielle Cysteinprotease des Erregers und wird als potentielles Zielmolekül für die intelligente Wirkstoffentwicklung gehandelt. Inhibitoren, welche dieses Molekül im niedrigen mikromolaren Bereich inhibieren, konnten bereits vom Institut für Pharmazie der hiesigen Universität synthetisiert werden. Um die Inhibitoren hinsichtlich ihrer Selektivität, Affinität und Toxizität zu optimieren, ist deren röntgenstrukturbiologische Analyse im Komplex mit dem Zielmolekül Rhodesain notwendig. Rhodesain wurde in den Hefezellen Pichia pastoris, welche mit dem Vektor pPICZalphaB_RhodesainDeltaCmut transfiziert wurden, exprimiert und mittels Hydrophober-Wechselwirkungs- sowie Größenausschlußschromatographie gereinigt. Nadelförmige Kristalle konnten mit einer Reservoirlösung aus 1.6 M Ammoniumsulfat, 10% 1,4-Dioxan und 0.1 M MES pH6.9 sowie bei einer Temperatur von 20°C erhalten werden. Die Kristalle wurden mit dem Inhibitor UM112C getränkt und an der Europäischen Anlage für Synchrotronstrahlung ESRF (Grenoble) vermessen. Das Diffraktionsbild bei einer Wellenlänge von 0.97625 Å ergab ein für Proteine typisches Beugungsmuster mit einer Streuung bis 3.04 Å. Zur weiteren Analyse und Optimierung der Kristalle wurde das Projekt von Dipl.-Biol. Uwe Dietz im Rahmen seiner Dissertation und des Sonderforschungsbereichs SFB-630 übernommen.
Die afrikanische Schlafkrankheit füht unweigerlich zum Tod wenn sie unerkannt und somit unbehandelt bleibt. Zur Therapie stehen nur sehr wenige Medikamente zur Verfügung, wovon die meisten bereits seit mehr als 50 Jahren im Einsatz sind. Unter der Therapie treten in ca. 5-10% der Fälle Enzephalopathien auf, die in vielen Fällen tödlich verlaufen. Bisher ist nicht sicher, wie der dahinterstehende Pathomechanismus verläuft. Zu dieser Frage wurden Untersuchungen des Glukosemetabolismus an Patienten im 2. Stadium der Schlafkrankheit durchgeführt. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg des durchschnittlichen Glukoseniveaus im Verlauf der Therapie. Des weiteren wurden unterschiedliche Verläufe von arzneimittel-induzierter Enzephalopathie klinisch beobachtet und beschrieben.