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Cofilin
(1999)
This study has identified cofilin, an actin binding protein, as a control element in the reorganization of the actin cytoskeleton which is highly relevant for T lymphocyte activation. Cofilin is regulated in its activity by reversible phosphorylation which is inducible by stimulation through accessory receptors such as CD2 and CD28. First it could be demonstrated that accessory receptor triggering induces the transient association of cofilin with the actin cytoskeleton and that only the dephosphorylated form of cofilin possesses the capacity to bind cytoskeletal actin in vivo. PI3-kinase inhibitors block both the dephosphorylation of cofilin and its association with the actin cytoskeleton. Importantly, cofilin, actin, PI3-kinase and one of its substrates, namely phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) which can bind to cofilin, co-localize within CD2-receptor caps. The cofilin/F-actin interaction has been identified as a crucial regulatory element for receptor cap formation and the strength of signal transduction. To this end, appropriately designed cell permeable non-toxic peptides that are homologous to actin binding motifs of the human cofilin sequence were introduced into untransformed human peripheral blood T lymphocytes. These peptides competitively and dose dependently inhibit the activation induced interaction of cofilin with the actin cytoskeleton in vivo. By this approach it was possible to study, for the first time, the functional consequences of this interaction in immunocompetent T cells. The present data demonstrate that inhibition of the actin/cofilin interaction in human T lymphocytes by means of these cofilin derived peptides abolishes receptor cap formation and strongly modulates functional T cell responses such as T cell proliferation, interleukin-2 production, cell surface expression of CD69, gIFN production, and CD95L expression. Importantly, receptor independent activation by PMA and calcium ionophore circumvents these peptide produced inhibitory effects on lymphocyte stimulation and places the cofilin/actin interaction to a proximal step in the cascade of signaling events following T cell activation via surface signals. The present results are novel since as yet no information existed regarding the molecular elements which link cell surface receptor stimulation directly to the resulting reorganization of the actin cytoskeleton.
Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen generieren, wobei die unreifen Thymozytenpopulationen in Thymomen im Vergleich zum Thymus abnorm vermehrt und die reifen Populationen vermindert sind. Zusätzlich weist das Thymomgewebe im Vergleich zum Thymus weniger B-Zellen und Effektor-T-Zellen auf. Bisher ist unbekannt, welche Faktoren die veränderte intratumoröse Zusammensetzung der Zellpopulationen bedingen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Mikromilieufaktoren in Thymomen mit möglichen Auswirkungen auf die intratumoröse Thymopoese zu identifizieren und deren Einfluß auf das periphere Immunsystem zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde nach Ursachen für die abnorme Thymozytenreifung und die Generierung autoreaktiver T-Zellen in Thymomen gesucht. Als potentielles Autoantigen, das die positive Selektion in Thymomen beeinflussen könnte, wurde das in Thymomen exprimierte Protein p153 als Neurofilament mittleren Molekulargewichtes (NF-M) identifiziert. Mittels T-Zell-Proliferationstests konnte gezeigt werden, daß intratumoröse T-Zellen von Thymompatienten mit Myasthenia gravis (MG) nach Stimulation mit dem mittleren Fragment dieses Proteins (NF-M-B) signifikant höhere Antworten aufwiesen als Thymozyten von Thymitispatienten oder Thymompatienten ohne MG. NF-M-B-reaktive T-Zellen waren charakteristisch für die paraneoplastische MG, wohingegen T-Zell-Antworten gegen ein Azetylcholinrezeptor (AChR)-Fragment bei allen MG-Patienten (Thymitis und Thymom) erhöht waren. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, daß intratumoröses NF-M eine autoantigene Determinante speziell für die paraneoplastische MG darstellt. Das Mikromilieu von Thymomen wurde außerdem mittels cDNA-Arrays und RT-PCR analysiert. Als differentiell exprimierte Gene sind besonders das "Heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) und der "B-cell growth factor 1" (BCGF 1) hervorzuheben. Die Expression von HB-GAM zeigte sowohl eine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp (kortikal > gemischt / medullär) als auch vom MG-Status der Patienten (MG+ > MG-).Umgekehrt wurde für den Faktor BCGF 1 eine signifikante Erhöhung in Thymomen ohne MG gefunden und keine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp. Die Expression des Chemokins "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) war ebenfalls mit dem MG (+)-Status von Thymompatienten signifikant assoziiert. Diese Befunde machen eine Beteiligung von HB-GAM, BCGF 1 und I-TAC an der Pathogenese der paraneoplastischen MG wahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Chemokins "Thymus-expressed chemokine" (TECK) weder durch den histologischen Thymomtyp noch durch den MG-Status der Patienten beeinflußt. TECK ist vermutlich auch in Thymomen dafür verantwortlich, daß unreife Thymozyten nicht ins Blut gelangen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von FACS-Analysen und T-Zell-Proliferationsassays der Einfluß von Thymomen auf das periphere Immunsystem untersucht. Es zeigte sich, daß die veränderte Thymopoese und autoreaktive T-Zell-Funktion in Thymomen mit immunologischen Veränderungen im Blut korreliert waren. Der Anteil zirkulierender CD45RA+ CD8+ T-Zellen war bei Thymompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, in Übereinstimmung mit einer intratumorösen T-Zell-Reifung, die in Richtung der CD8+-Linie verschoben war. Auf funktioneller Ebene war die intratumorös nachweisbare, thymomtypische T-Zell-Autoreaktivität gegen NF-M-B und alpha-AChR (301-398) gleichermaßen im Thymom und Blut zu finden. Diese funktionellen Studien unterstützen die Hypothese, daß die in Thymomen stattfindende Thymopoese das periphere T-Zell-Repertoire verändert. Hinsichtlich des Importes von T-Zellen aus der Peripherie in das Thymom ergaben die funktionellen Assays dagegen, daß T-Zellen, die auf ein fremdes Antigen (Tetanus Toxoid) reagierten, nur innerhalb zirkulierender T-Zellen, nicht aber innerhalb intratumoröser Thymozyten nachweisbar waren. Ebenso fanden sich erhöhte autoreaktive T-Zell-Antworten gegen andere Fragmente des NF-M-Proteins (NF-M-A und NF-M-C) sowie für ein Fragment der delta-Untereinheit des AChR nur im Blut von Thymompatienten. Diese Befunde sprechen dafür, daß die Migration von Effektor-T-Zellen aus der Peripherie ins Thymom vermindert ist. Während die Mechanismen für diese gestörte T-Zell-Rezirkulation ins Thymom ungeklärt sind, bestand eine Korrelation zwischen der Expression des B-Zell-spezifischen Chemokins BLC (B-Lymphocyte chemoattractant) und der Anzahl der B-Zellen, die immunhistochemisch in den entsprechenden Geweben dargestellt wurden. Dieser Befund kann auf eine Rolle von BLC bei der Migration reifer B-Zellen in Thymus- bzw. Thymomgewebe hinweisen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Mikromilieufaktoren benannt werden, die von potentieller pathogenetischer Relevanz für die gestörte, nicht-tolerogene Thymopoese innerhalb von Thymomen sind. Zweitens konnte eindeutig gezeigt werden, daß die intratumoröse Thymopoese das periphere Immunsystem beeinflußt und bei MG-assoziierten Thymomen in Richtung auf ein höheres autoreaktives Potential verändert
T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains.
Mechanismen der TZR-abhängigen und -unabhängigen Aktivierung primärer T-Zellen der Ratte durch CD 28
(2000)
Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abhängig über den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt über kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molekülen ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivität einiger monoklonaler Antikörper (mAb) spezifisch für CD28 der Ratte, die alle ruhenden primären Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen können, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterstützt CD28 als kostimulatorisches Molekül nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenständiges Signalmolekül, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 könnte für die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verhältnis der Stärke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt.
Ziel dieser Arbeit war es, NF-AT1-Gen-defiziente Mauslinien zu erzeugen und die Folgen dieser genetischen Manipulation in vivo zu untersuchen. Die Untersuchung sollte die durch die Gendefizienz erwarteten Mängel während der Entwicklung (Embryogenese) und, im Besonderen, die Auswirkungen auf das Immunsytem und die Entwicklung und Differenzierung der T-Zellen aufzeigen. Zur Untersuchung der genomischen Organisation des Maus-NF-AT1-Gens wurde eine genomische l-Phagen-DNA-Bibliothek "gescreent" (durchgeführt von Dr. E. Jankevics, Universität von Riga, Lettland), die entsprechenden l-Phagen, die das NF-AT1-Gen enthielten, isoliert und die DNA präpariert. Nach Analyse der klonierten Phagen (Subklonierung und Sequenzierung) wurde eine Restriktionskarte der entsprechenden Bereiche erstellt und der "targeting-vector" erstellt. Der "targeting-vector" wurde durch Elektroporation in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingebracht und die Integration in das Genom ("Homologe Rekombination") durch Southern Blotting- bzw. PCR-Analyse untersucht. Manipulierte ES-Zellklone wurden in C57Bl/6-Blastozysten injiziert, diese in scheinschwangere Ammentiere transferiert und die Nachkommen nach Geburt anhand der Fellfarben klassifiziert. Nachkommen mit einem hohen Anteil hellen Fells wurden mit C57 Bl/6-Tieren verpaart und die Integration des manipulierten Zellklons in die Keimbahn wurde anhand der wildtypischen Fellfarbe und Genotypisierung nachgewiesen. Bezüglich des manipulierten NF-ATp-Gens heterozygote F1-Tiere wurden miteinander verpaart, um eine homozygote NF-ATp-defiziente Mäuse zu erhalten. Die Deletion des NF-ATp-Proteins wurde durch in Western-Blotting-Experimenten und EMSAs ("electrophoretic mobility shift assays") nachgewiesen. Die NF-ATp-/--Tiere zeigten keine augenscheinlichen Veränderungen während der Entwicklung und, bei jungen Tieren, keine offensichtlichen Veränderungen bei der Entwicklung des Immunsystems. In älteren Tieren (> 6 Wochen) war eine Hyperproliferation der Zellen des Immunsystems zu beobachten, was mit einer Splenomegalie, einer verstärkten Bildung von Keimzentren in lymphatischen Organen, vergrößerten Lymphknoten und einer verlangsamten Involution des Thymus einherging. Weitergehende Untersuchungen der Ursache dieser hyperproliferativen Erkrankung offenbarten eine verminderte klonale Deletion nach Aktivierung. Die Ursachen dieses überraschenden Effekts sind wahrscheinlich vielfältig, da NF-AT-Faktoren an der Regulation der Expression vieler Gene beteiligt sind, u.a. des Apoptose-assoziierten CD95-Liganden. Da sich bezüglich der IL-2-Expression keine Unterschiede zwischen NF-ATp-defizienten Tieren und Kontrollen zeigten, jedoch eine erhöhte IL-2-Konzentration im Medium kultivierter NF-ATp-defizienter T-Zellen beobachtet wurde, wurde die Bindung von NF-ATp an putative NF-AT-Bindungssequenzen des CD25-Promotors, die transkriptionelle Aktivierung des Promotors mittels Luciferase-Assays und die Expression der IL-2R-alpha-Kette (CD25) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß (1.) NF-ATp an zwei Regionen des CD25-Promotors bindet, (2.) der CD25-Promotor durch NF-ATp transkriptionell stark stimuliert wird und (3.) T-Zellen NF-ATp-defizienter Tiere nach Stimulation eine verminderte CD25-Expression zeigen. In NF-ATp-defizienten Tieren war die Expression von CD25 moderat reduziert, was eine Erklärung für den abgeschwächten Phänotyp dieser Tiere - im Vergleich zu IL-2- oder CD25-defizienten Tieren - sein kann. Die hyperproliferativen Erkrankungen dieser verschiedenen Mauslinien weisen auf eine Beteiligung der NF-AT-/IL-2-/IL-2R-Signalwege nicht nur während der T-Zell-Aktivierung hin, sondern auch auf eine Beteiligung an Signalwegen, die zur anschließenden Inaktivierung und Apoptose der T-Lymphozyten nötig sind.