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Structure and dynamics of the plasma membrane: a single-molecule study in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
(2024)
The unicellular, flagellated parasite Trypanosoma brucei is the causative agent of human African sleeping sickness and nagana in livestock. In the last decades, it has become an established eukaryotic model organism in the field of biology, as well as in the interdisciplinary field of biophysics. For instance, the dense variant surface glycoprotein (VSG) coat offers the possibility to study the dynamics of GPI-anchored proteins in the plasma membrane of living cells. The fluidity of the VSG coat is not only an interesting object of study for its own sake, but is critically important for the survival of the parasite in the mammalian host. In order to maintain the integrity of the coat, the entire VSG coat is recycled within a few minutes. This is surprisingly fast for a purely diffusive process with the flagellar pocket (FP) as the sole site for endo- and exocytosis. Previous studies characterising VSG dynamics using FRAP reported diffusion coefficients that were not sufficient to to enable fast turnover based on passive VSG randomisation on the trypanosome surface.
In this thesis, live-cell single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) was employed to elucidate whether VSG diffusion coefficients were priorly underestimated or whether directed forces could be involved to bias VSGs towards the entrance of the FP. Embedding the highly motile trypanosomes in thermo-stable hydrogels facilitated the investigation of VSG dynamics on living trypanosomes at the mammalian host's temperature of 37°C. To allow for a spatial correlation of the VSG dynamics to the FP entrance, a cell line was employed harbouring a fluorescently labelled structure as a reference. Sequential two-colour SMFM was then established to allow for recording and registration of the dynamic and static single-molecule information.
In order to characterise VSG dynamics, an algorithm to obtain reliable information from short trajectories was adapted (shortTrAn). It allowed for the quantification of the local dynamics in two distinct scenarios: diffusion and directed motion. The adaptation of the algorithm to the VSG data sets required the introduction of an additional projection filter. The algorithm was further extended to take into account the localisation errors inherent to single-particle tracking. The results of the quantification of diffusion and directed motion were presented in maps of the trypanosome surface, including an outline generated from a super-resolved static structure as a reference. Information on diffusion was displayed in one map, an ellipse plot. The colour code represented the local diffusion coefficient, while the shape of the ellipses provided an indication of the diffusion behaviour (aniso- or isotropic diffusion). The eccentricity of the ellipses was used to quantify deviations from isotropic diffusion. Information on directed motion was shown in three maps: A velocity map, representing the amplitude of the local velocities in a colour code. A quiver plot, illustrating the orientation of directed motion, and a third map which indicated the relative standard error of the local velocities colour-coded. Finally, a guideline based on random walk simulations was used to identify which of the two motion scenarios dominated locally. Application of the guideline to the VSG dynamics analysed by shortTrAn yielded supermaps that showed the locally dominant motion mode colour-coded.
I found that VSG dynamics are dominated by diffusion, but several times faster than previously determined. The diffusion behaviour was additionally characterised by spatial heterogeneity. Moreover, isolated regions exhibiting the characteristics of round and elongated traps were observed on the cell surface. Additionally, VSG dynamics were studied with respect to the entrance of the FP. VSG dynamics in this region displayed similar characteristics compared to the remainder of the cell surface and forces biasing VSGs into the FP were not found.
Furthermore, I investigated a potential interference of the attachment of the cytoskeleton to the plasma membrane with the dynamics of VSGs which are anchored to the outer leaflet of the membrane. Preliminary experiments were conducted on osmotically swollen trypanosomes and trypanosomes depleted for a microtubule-associated protein anchoring the subpellicular microtubule cytoskeleton to the plasma membrane. The measurements revealed a trend that detachment of the cytoskeleton could be associated with a reduction in the VSG diffusion coefficient and a loss of elongated traps. The latter could be an indication that these isolated regions were caused by underlying structures associated with the cytoskeleton.
The measurements on cells with an intact cytoskeleton were complemented by random walk simulations of VSG dynamics with the newly determined diffusion coefficient on long time scales not accessible in experiments. Simulations showed that passive VSG randomisation is fast enough to allow for a turnover of the full VSG coat within a few minutes. According to an estimate based on the known rate of endocytosis and the newly determined VSG diffusion coefficient, the majority of exocytosed VSGs could escape from the FP to the cell surface without being immediately re-endocytosed.
Einflüsse der Photophysik und Photochemie von Cyaninfarbstoffen auf die Lokalisationsmikroskopie
(2023)
In den letzten Jahren haben sich hochauflösende Fluoreszenzmikroskopiemethoden, basierend auf der Lokalisation einzelner Fluorophore, zu einem leistungsstarken Werkzeug etabliert, um Fluoreszenzbilder weit unterhalb der Auflösungsgrenze zu generieren. Hiermit können räumliche Auflösungen von ~ 20 nm erzielt werden, was weit unterhalb der Beugungsgrenze liegt. Dabei haben zahlreiche Optimierungen und Entwicklungen neuer Methoden in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie die Genauigkeit der orstspezifischen Bestimmung einzelner Fluorophore auf bis zu ~ 1 – 3 nm erhöht. Eine Auflösung im molekularen Bereich, weit unterhalb von ~ 10 nm bleibt allerdings herausfordernd, da die Lokalisationsgenauigkeit nur ein Kriterium hierfür ist. Allerdings wurde sich in den letzten Jahren überwiegend auf die Verbesserung dieses Parameters konzentriert. Weitere Kriterien für die fluoreszenzmikroskopische Auflösung sind dabei unter anderem die Markierungsdichte und die Kopplungseffizienz der Zielstruktur, sowie der Kopplungsfehler (Abstand zur Zielstruktur nach Farbstoffkopplung), die sich herausfordernd für eine molekulare Auflösung darstellen. Auch wenn die Kopplungseffizienz und -dichte hoch und der Kopplungsfehler gering ist, steigt bei Interfluorophordistanzen < 5nm, abhängig von den Farbstoffen, die Wahrscheinlichkeit von starken und schwachen Farbstoffwechselwirkungen und damit von Energieübertragungsprozessen zwischen den Farbstoffen, stark an. Daneben sollten Farbstoffe, abhänging von der Lokalisationsmikroskopiemethode, spezifische Kriterien, wie beispielsweise die Photoschaltbarkeit bei dSTORM, erfüllen, was dazu führt, dass diese Methoden häufig nur auf einzelne Farbstoffe beschränkt sind. In dieser Arbeit konnte mithilfe von definierten DNA-Origami Konstrukten gezeigt werden, dass das Blinkverhalten von Cyaninfarbstoffen unter dSTORM-Bedingungen einer Abstandsabhängigkeit aufgrund von spezifischen Energieübertragungsprozessen folgt, womit Farbstoffabstände im sub-10 nm Bereich charakterisiert werden konnten. Darüber hinaus konnte diese Abstandsabhängigkeit an biologischen Proben gezeigt werden. Hierbei konnten verschiedene zelluläre Rezeptoren effizient und mit geringem Abstandsfehler zur Zielstruktur mit Cyaninfarbstoffen gekoppelt werden. Diese abstandsabhänigen Prozesse und damit Charakterisierungen könnten dabei nicht nur spezifisch für die häufig unter dSTORM-Bedingungen verwendeten Cyaninfarbstoffen gültig sein, sondern auch auf andere Farbstoffklassen, die einen Auszustand zeigen, übertragbar sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass hochauflösende dSTORM Aufnahmen unabhängig vom Farbstoffkopplungsgrad der Antikörpern sind, welche häufig für Standardfärbungen von zellulären Strukturen verwendet werden. Dabei konnte durch Photonenkoinzidenzmessungen dargelegt werden, dass aufgrund komplexer Farbstoffwechselwirkungen im Mittel nur ein Farbstoff aktiv ist, wobei höhere Kopplungsgrade ein komplexes Blinkverhalten zu Beginn der Messung zeigen. Durch die undefinierten Farbstoffabstände an Antikörpern konnte hier kein eindeutiger Energieübertragungsmechanismus entschlüsselt werden. Dennoch konnte gezeigt werden, dass Farbstoffaggregate bzw. H-Dimere unter dSTORM-Bedingungen destabilisiert werden. Durch die zuvor erwähnten DNA-Origami Konstrukte definierter Interfluorophordistanzen konnten Energieübertragungsmechanismen entschlüsselt werden, die auch für die Antikörper diverser Kopplungsgrade gültig sind. Des Weiteren konnten, ausgelöst durch komplexe Energieübertragungsprozesse höherer Kopplungsgrade am Antikörper, Mehrfarbenaufnahmen zellulärer Strukturen generiert werden, die über die spezifische Fluoreszenzlebenszeit separiert werden konnten. Dies stellt hier eine weitere Möglichkeit dar, unter einfachen Bedingungen, schnelle Mehrfarbenaufnahmen zellulärer Strukturen zu generieren. Durch die Verwendung des selben Farbstoffes unterschiedlicher Kopplungsgrade kann hier nur mit einer Anregungswellenlänge und frei von chromatischer Aberration gearbeitet werden. Neben den photophysikalischen Untersuchungen der Cyaninfarbstoffe Cy5 und Alexa Fluor 647 wurden diese ebenso photochemisch näher betrachtet. Dabei konnte ein neuartiger chemischer Mechanismus entschlüsselt werden. Dieser Mechanismus führt, ausgelöst durch Singulett-Sauerstoff (1O2), zu einer Photozerschneidung des konjugierten Doppelbindungssystems um zwei Kohlenstoffatome, was zu strukturellen und spektroskopischen Veränderungen dieser Farbstoffe führt. Auf Grundlage dieses Mechanismus konnte eine neue DNA-PAINT Methode entwickelt werden, die zu einer Beschleunigung der Aufnahmezeit führt.
One rarely finds practical guidelines for the implementation of complex optical setups. Here, we aim to provide technical details on the decision making of building and revising a custom sensor-based adaptive optics (AO) direct stochastic optical reconstruction microscope (dSTORM) to provide practical assistance in setting up or troubleshooting similar devices.
The foundation of this report is an instrument constructed as part of a master's thesis in 2021, which was built for deep tissue imaging. The setup is presented in the following way: (1) An optical and mechanical overview of the system at the beginning of this internship is given. (2) The optical components are described in detail in the order at which the light passes through, highlighting their working principle and implementation in the system. The optical component include (2A) a focus on even sample illumination, (2B) restoring telecentricity when working with commercial microscope bodies, (2C) the AO elements, namely the deformable mirror (DM) and the wavefront sensor, and their integration, and (2D) the separation of wavefront and image capture using fluorescent beads and a dichroic mirror. After addressing the limitations of the existing setup, modification options are derived. The modifications include the implementation of adjustment only light paths to improve system stability and revise the degrees of freedom of the components and changes in lens choices to meet the specifications of the AO components. Last, the capabilities of the modified setup are presented and discussed: (1) First, we enable epifluorescence imaging of bead samples through 180 µm unstained murine hippocampal tissue with wavefront error correction of ~ 90 %. Point spread function, wavefront shape and Zernike decomposition of bead samples are presented. (2) Second, we move from epifluorescent to dSTORM imaging of tubulin stained primary mouse hippocampal cells, which are imaged through up to 180 µm of unstained murine hippocampal tissue. We show that full width at half maximum (FWHM) of prominent features can be reduced in size by nearly a magnitude from uncorrected epiflourescence images to dSTORM images corrected by the adaptive optics. We present dSTORM localization count and FWHM of prominent features as as a function of imaging depth.
Point-spread function engineering for single-molecule localization microscopy in brain slices
(2022)
Single-molecule localization microscopy (SMLM) is the method of choice to study biological specimens on a nanoscale level. Advantages of SMLM imply its superior specificity due to targeted molecular fluorescence labeling and its enhanced tissue preservation compared to electron microscopy, while reaching similar resolution. To reveal the molecular organization of protein structures in brain tissue, SMLM moves to the forefront: Instead of investigating brain slices with a thickness of a few µm, measurements of intact neuronal assemblies (up to 100 µm in each dimension) are required. As proteins are distributed in the whole brain volume and can move along synapses in all directions, this method is promising in revealing arrangements of neuronal protein markers. However, diffraction-limited imaging still required for the localization of the fluorophores is prevented by sample-induced distortion of emission pattern due to optical aberrations in tissue slices from non-superficial planes. In particular, the sample causes wavefront dephasing, which can be described as a summation of Zernike polynomials. To recover an optimal point spread function (PSF), active shaping can be performed by the use of adaptive optics. The aim of this thesis is to establish a setup using a deformable mirror and a wavefront sensor to actively shape the PSF to correct the wavefront phases in a super-resolution microscope setup. Therefore, fluorescence-labeled proteins expressed in different anatomical regions in brain tissue will be used as experiment specimen. Resolution independent imaging depth in slices reaching tens of micrometers is aimed.
The development of cellular life on earth is coupled to the formation of lipid-based biological membranes. Although many tools to analyze their biophysical properties already exist, their variety and number is still relatively small compared to the field of protein studies. One reason for this, is their small size and complex assembly into an asymmetric tightly packed lipid bilayer showing characteristics of a two-dimensional heterogenous fluid. Since membranes are capable to form dynamic, nanoscopic domains, enriched in sphingolipids and cholesterol, their detailed investigation is limited to techniques which access information below the diffraction limit of light. In this work, I aimed to extend, optimize and compare three different labeling approaches for sphingolipids and their subsequent analysis by the single-molecule localization microscopy (SMLM) technique direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). First, I applied classical immunofluorescence by immunoglobulin G (IgG) antibody labeling to detect and quantify sphingolipid nanodomains in the plasma membrane of eukaryotic cells. I was able to identify and characterize ceramide-rich platforms (CRPs) with a size of ~ 75nm on the basal and apical membrane of different cell lines. Next, I used click-chemistry to characterize sphingolipid analogs in living and fixed cells. By using a combination of fluorescence microscopy and anisotropy experiments, I analyzed their accessibility and configuration in the plasma membrane, respectively. Azide-modified, short fatty acid side chains, were accessible to membrane impermeable dyes and localized outside the hydrophobic membrane core. In contrast, azide moieties at the end of longer fatty acid side chains were less accessible and conjugated dyes localized deeper within the plasma membrane. By introducing photo-crosslinkable diazirine groups or chemically addressable amine groups, I developed methods to improve their immobilization required for dSTORM. Finally, I harnessed the specific binding characteristics of non-toxic shiga toxin B subunits (STxBs) and cholera toxin B subunits (CTxBs) to label and quantify glycosphingolipid nanodomains in the context of Neisseria meningitidis infection. Under pyhsiological conditions, these glycosphingolipids were distributed homogenously in the plasma membrane but upon bacterial infection CTxB detectable gangliosides accumulated around invasive Neisseria meningitidis. I was able to highlight the importance of cell cycle dependent glycosphingolipid expression for the invasion process. Blocking membrane accessible sugar headgroups by pretreatment with CTxB significantly reduced the number of invasive bacteria which confirmed the importance of gangliosides for bacterial uptake into cells. Based on my results, it can be concluded that labeling of sphingolipids should be carefully optimized depending on the research question and applied microscopy technique. In particular, I was able to develop new tools and protocols which enable the characterization of sphingolipid nanodomains by dSTORM for all three labeling approaches.
Die Entwicklung hochauflösender Fluoreszenzmikroskopiemethoden hat die Lichtmikroskopie revolutioniert. Einerseits ermöglicht die höhere erzielte räumliche Auflösung die Abbildung von Strukturen, die deutlich unterhalb der beugungsbedingten Auflösungsgrenze liegen. Andererseits erhält man durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopiemethoden
wie dSTORM (Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Informationen, welche man für quantitative Analysen heranziehen kann. Aufgrund der sich dadurch bietenden neuen Möglichkeiten, hat sich die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie rasant entwickelt und kommt mittlerweile zur Untersuchung einer Vielzahl biologischer und medizinischer Fragestellungen zum Einsatz. Trotz dieses Erfolgs ist jedoch nicht zu verleugnen, dass auch diese neuen Methoden ihre Nachteile haben. Dazu zählt die Notwendigkeit relativ hoher Laserleistungen, welche Voraussetzung für hohe Auflösung ist und bei lebenden Proben zur Photoschädigung führen kann.
Diese Arbeit widmet sich sowohl dem Thema der Photoschädigung durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie,
als auch der Anwendung von dSTORM und SIM (Structured Illumination Microscopy) zur Untersuchung neurobiologischer Fragestellungen auf Proteinebene.
Zur Ermittlung der Photoschädigung wurden lebende Zellen unter typischen Bedingungen bestrahlt und anschließend für 20−24 h beobachtet. Als quantitatives Maß für den Grad der Photoschädigung wurde der Anteil sterbender Zellen bestimmt. Neben der zu erwartenden Intensitäts- und Wellenlängenabhängigkeit, zeigte sich, dass die Schwere der Photoschädigung auch von vielen weiteren Faktoren abhängt und dass sich Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie bei Berücksichtigung der gewonnenen Erkenntnisse durchaus mit Lebendzellexperimenten vereinbaren lässt.
Ein weiteres Projekt diente der Untersuchung der A- und B-Typ-Glutamatrezeptoren an der neuromuskulären Synapse von Drosophila melanogaster mittels dSTORM. Dabei konnte eine veränderte Anordnung beider Rezeptortypen infolge synaptischer Plastizität beobachtet, sowie eine absolute Quantifizierung des A-Typ-Rezeptors durchgeführt werden.
Im Mittelpunkt eines dritten Projekts standen Cadherin-13 (CDH13) sowie der Glucosetransporter Typ 3 (GluT3), welche beide mit der Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung in Verbindung gebracht werden. CDH13 konnte mittels SIM in serotonergen Neuronen, sowie radiären Gliazellen der dorsalen Raphekerne des embryonalen Mausgehirns nachgewiesen werden. Die Rolle von GluT3 wurde in aus induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierten Neuronen analysiert, welche verschiedene Kopienzahlvariation des für GluT3-codierenden SLC2A3-Gens aufwiesen. Die Proteine GluT3, Bassoon und Homer wurden mittels dSTORM relativ quantifiziert. Während die Deletion des Gens zu einer erwartenden Verminderung von GluT3 auf Proteinebene führte, hatte die Duplikation keinen Effekt auf die GluT3-Menge. Für Bassoon und Homer zeigte sich weder durch die Deletion noch die Duplikation eine signifikante Veränderung.
Ziel dieser Dissertation war es zu einem besseren Verständnis hinsichtlich folgender Themen beizutragen und Möglichkeiten aufzuzeigen, mit welchen die Voraussetzungen für Anwendungen von einzelnen, funktionalisierten Kohlenstoffnanoröhren, wie u.a. Einzelphotonenquellen, erfüllt werden können.
Eine wesentliche Voraussetzung für die Funktionalisierung von einzelnen Kohlenstoffnanoröhren ist zunächst eine Probenpräparation, welche SWNT-Suspensionen mit einem hohen Anteil an vereinzelten SWNTs hoher PL-Intensität bereitstellen kann. Um solche SWNT-Suspensionen herstellen zu können, wurden drei verschiedene Rohmaterialien und Dispergiermittel auf deren Entbündelungseffizienz- und relativer Photolumineszenzquantenausbeute untersucht. Anhand von photolumineszenzspektroskopischen Untersuchungen und Messungen der Extinktion stellte sich heraus, dass in Kombination des unaufbereiteten CVD-Kohlenstoffnanorohrrußes mit dem Copolymer PFO:BPy als Dispergiermittel und einem speziell in dieser Dissertation entwickelten Herstellungsverfahren für die Mikroskopieproben, stabile (6,5)-SWNT-Suspensionen mit einem großen Anteil an einzelnen SWNTs hoher PL-Intensität, hergestellt werden können.
Letztere Suspension diente als Ausgangsmaterial für die, in dieser Dissertation neuartige, entwickelte Methodik zur Differenzierung zwischen einzelnen SWNTs und Aggregaten mittels PL- und Ramanmessungen an einem PL-Mikroskopie-Aufbau, welche eine weitere Voraussetzung für Einzelpartikelstudien darstellt. Hierbei wurden im Rahmen einer statistischen Messreihe PL- und Ramanspektren von 150 SWNT-Objekten aufgenommen und hieraus resultierend die Parameter FWHM, Energie des S1-Emissions-Zustands und relative Photolumineszenzquantenausbeute ermittelt. Schließlich konnten die zwischen einer einzelnen SWNT und einem Aggregat charakteristischen Differenzen anhand der Korrelationen zwischen den drei Parametern dargestellt werden. Zudem erfolgte eine statistische Analyse zur Bestimmung der statistischen Signifikanz dieser Korrelationen. Hierbei wurde anhand der nicht-parametrischen Spearman-Korrelationskoeffizienten und der p-Werte gezeigt, dass in Kombination dieser drei Messparameter mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zwischen einer einzelnen SWNT und einem Aggregat differenziert werden kann. Demnach konnte eine neuartige, im Vergleich zur Literatur, praktikable Methodik zur Differenzierung zwischen einzelnen SWNTs und Aggregaten, etabliert werden, welche die Voraussetzung für Einzelrohrstudien ist.
Der Fokus dieser Dissertation ist die Entschlüsselung der Reaktionsmechanismen der Arylierung und reduktiven Alkylierung von (6,5)-SWNTs im Ensemble und auf Einzelrohrbasis. Durch diese kovalenten Funktionalisierungsverfahren entstehen neue fluoreszierende Defekt-Zustände, deren zeitabhängiges Intensitätsverhalten in der vorliegenden Arbeit näher untersucht wurde. Hinsichtlich der Arylierung von SWNTs mit Diazoniumsalzen postulieren Studien einen zweistufigen Reaktionsmechanismus, welcher durch eine kombinatorische, spektroskopische Gesamtbetrachtung im Rahmen dieser Dissertation bestätigt werden konnte. Auch konnte erstmalig in der Literatur gezeigt werden, dass die Reaktion in hohem Maße reproduzierbar ist.
Reproduzierbarkeitsstudien wurden auch im Falle der reduktiven Alkylierung unternommen, wobei erstmalig festgestellt wurde, dass diese Reaktion lediglich im hohen Maße reproduzierbar ist, sofern die Reduktionslösung mindestens 17 Stunden vor Reaktionsstart angesetzt wird. Basierend auf diesem Resultat, wurden reproduzierbare Messreihen zur Untersuchung der Reaktionsbedingungen und des Reaktionsmechanismus unternommen, da diesbezüglich unzureichend Kenntnis in der Literatur vorhanden ist.
Zur Klärung des Reaktionsmechanismus, von welchem lediglich Annahmen existieren, wurde zum einen der Einfluss der Laseranregung auf die Reaktion untersucht. Da lediglich für den Falle des Ansetzens der Reduktionslösung unmittelbar vor Messbeginn, wobei die reaktiven SO2- -Radikale erzeugt werden, ein Einfluss der Laseranregung festgestellt werden konnte, nicht jedoch im weiteren Reaktionsverlauf, ist von keiner radikalischen Reaktion im Funktionalisierungsschritt auszugehen. Dies konnte durch den Einsatz von Konstitutionsisomeren des Iodbutans bestätigt werden, wobei das Iodbutanisomer, welches im Fall einer radikalischen Reaktion die höchste Reaktivität zeigen sollte, zu keiner Funktionalisierung der SWNTs führte. Im Gegensatz hierzu, konnte durch das 1-Iodbutan, mit dem primären C-Atom, eine hohe PL-Intensität der defekt-induzierten Zustände E11- und T- verzeichnet werden, was die weitere Annahme einer SN2-Reaktion stützt.
Im Rahmen dieser Dissertation konnte zudem erstmalig entdeckt werden, dass unter deren alkalischen, reduktiven Bedingungen, eine Funktionalisierung mit Acetonitril erfolgen kann, was durch die Durchstimmung der PL-Intensität des Defektzustands bei Variation des Volumenanteils von Acetonitril bestätigt werden konnte. Hierbei gilt es jedoch weiter zu analysieren, auf welche Art die Koordination bzw. Funktionalisierung von Acetonitril an den SWNTs erfolgt, was u.a. durch Ramanmessungen untersucht werden könnte.
Auch konnten neuartige Kenntnisse bezüglich der Reaktionskinetik basierend auf den Studien dieser Dissertation erhalten werden, wobei festgestellt wurde, dass das Reaktionsprofil mit dem einer komplexen Folgereaktion angenähert werden kann.
Zudem konnten neuartige Kenntnisse aus der Thermodynamik, wie die Ermittlung der Aktivierungsenergie der Adsorption von DOC-Molekülen auf der SWNT-Oberfläche, durch die Zugabe des Tensids DOC zum Reaktionsansatz und dem hieraus resultierenden Reaktionsabbruch, erhalten werden.
Schließlich fand eine Übertragung der Ergebnisse aus den Ensemblestudien der reduktiven Alkylierung auf Einzelpartikeluntersuchungen statt, wobei letztere erstmalig im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden. Aus der statistischen Analyse, welche von Martina Wederhake durchgeführt wurde, resultierte durch Erhöhung des Stoffmengenverhältnisses von 1-Iodbutan zu Kohlenstoff eine inhomogene Steigerung des Funktionalisierungsgrades. Ausblickend gilt es nun zu prüfen, ob die zeitlichen Reaktionsverläufe der photolumineszierenden Zustände, welche aus den Ensemble-Studien erhalten wurden, auf Einzelrohrbasis reproduziert werden können.
Es lässt sich demnach festhalten, dass mithilfe der Studien dieser Dissertation ein Probenherstellungsverfahren, welches stabile SWNT-Suspensionen mit einem großen Anteil an einzelnen Kohlenstoffnanoröhren, hoher PL-Intensität ermöglicht, etabliert werden konnte. Zudem wurde eine neuartige, praktikable und statistisch signifikante Methodik zur Differenzierung zwischen einzelnen Kohlenstoffnanoröhren und Aggregaten entwickelt. Schließlich konnten neue, essentielle Informationen bezüglich des Reaktionsmechanismus und den Reaktionsbedingungen der Arylierung und reduktiven Alkylierung von halbleitenden (6,5)-SWNTs erhalten werden. Wie in der Einleitung bereits erwähnt, sind sowohl der Erhalt einer stabilen SWNT-Suspension mit einem großen Anteil an einzelnen Nanoröhren hoher PL-Intensität, die Möglichkeit der Identifizierung einzelner SWNTs, als auch ein ausgiebiges Verständnis der Reaktionsmechanismen der Funktionalisierungsreaktionen, essentielle Voraussetzungen für die Verwirklichung von Einzelphotonenquellen auf Basis einzelner, funktionalisierter Kohlenstoffnanoröhren. Diese können aufgrund derer geeigneter Emissionseigenschaften als vielversprechende Kandidaten für das Ausgangsmaterial von Einzelphotonenquellen in der Quanteninformationstechnologie angesehen werden.
Single molecule localization microscopy has seen a remarkable growth since its first
experimental implementations about a decade ago. Despite its technical challenges,
it is already widely used in medicine and biology and is valued as a unique tool
to gain molecular information with high specificity. However, common illumination techniques do not allow the use of single molecule sensitive super-resolution
microscopy techniques such as direct stochastic optical reconstruction microscopy
(dSTORM) for whole cell imaging. In addition, they can potentially alter the
quantitative information.
In this thesis, I combine dSTORM imaging in three dimensions with lattice lightsheet illumination to gain quantitative molecular information from cells unperturbed by the illumination and cover slip effects. Lattice light-sheet illumination
uses optical lattices for beam shaping to restrict the illumination to the detectable
volume. I describe the theoretical background needed for both techniques and detail
the experimental realization of the system as well as the software that I developed
to efficiently evaluate the data.
Eventually, I will present key datasets that demonstrate the capabilities of the
developed microscope system with and without dSTORM. My main goal here was
to use these techniques for imaging the neural cell adhesion molecule (NCAM, also
known as CD56) in whole cells. NCAM is a plasma membrane receptor known to
play a key role in biological processes such as memory and learning. Combining
dSTORM and lattice light-sheet illumination enables the collection of quantitative
data of the distribution of molecules across the whole plasma membrane, and shows
an accumulation of NCAM at cell-cell interfaces. The low phototoxicity of lattice
light-sheet illumination further allows for tracking individual NCAM dimers in living cells, showing a significant dependence of its mobility on the actin skeleton of
the cell.
The molecular chaperone Hsp90 facilitates the folding and activation of a wide array of structurally and functionally diverse client proteins. Hsp90 presents a central node of protein homeostasis and is frequently involved in the development of many human diseases. Although Hsp90 is a promising target for disease treatment, the mechanism by which Hsp90 facilitates client recognition and maturation is poorly understood.
The shape of the homodimeric protein resembles a molecular clamp that opens and closes in response to binding and hydrolysis of ATP. Structural studies reveal a network of distinct local conformational rearrangements that coordinate the slow transition into the hydrolysis-active, closed state configuration (time order of minutes). However, the kinetics of local conformational changes remain elusive because spectroscopic tools that can detect them have been missing so far.
Fluorescence quenching of extrinsic fluorophores by the natural amino acid Tryptophan is based on a photoinduced electron transfer (PET) reaction, which requires sub-nanometer contact between fluorophore and Tryptophan. This quenching mechanism has been developed into a 1-nm spectroscopic tool for the detection of rapid protein folding dynamics. Within the scope of this doctoral thesis, PET-reporter systems were designed to investigate the kinetics of local conformational motions that are part of the mechanistic core of the Hsp90 chaperone cycle. ATP-triggered kinetics of closure of the ATP-lid as well as swapping of the N-terminal ß-strand across subunits and association of the N-terminal and middle-domain were estimated in solution. Bulk experiments revealed that local motions occur on similar timescales and are in good agreement with the ATP-hydrolysis rate. Functional mutations demonstrated that local motions act cooperatively. Furthermore, the lid was shown to close via a two-step process consisting of a rapid lid-reconfiguration in direct response to ATP-binding, followed by slow closure of the lid. The co-chaperone Aha1 seems to act early in the chaperone cycle by remodelling of the lid and by stabilization of apo Hsp90 in a NM-domain pre-associated conformation.
A two-colour single-molecule PET microscopy method was developed to observe local motions at remote positions simultaneously and in real-time. Thus, directionality within the network of local conformational changes could be revealed. In a first attempt, the feasibility of detecting PET-complexes on the single-molecule surface was tested on Hsp90 constructs that report on only one motion (one-colour single-molecule PET microscopy). PET-quenched complexes could be distinguished from photobleached fluorophores through oxidation by molecular oxygen, resulting in fluorescence recovery. In two-colour experiments, a dimmed state was identified for PET-quenched complexes, but not for all of the used PET-reporter systems. Results suggest that local motions occur simultaneously within the time-resolution of the experiment (0.3 sec). Furthermore, bi-exponential kinetics of transition into the closed clamp configuration indicate a more complex mechanism of clamp-closure than of clamp-opening, which could be well described by a mono-exponential function.
Sharpening super-resolution by single molecule localization microscopy in front of a tuned mirror
(2020)
The „Resolution Revolution" in fluorescence microscopy over the last decade has given rise to a variety of techniques that allow imaging beyond the diffraction limit with a resolution power down into the nanometer range. With this, the field of so-called super-resolution microscopy was born. It allows to visualize cellular architecture at a molecular level and thereby achieve a resolution level that had been previously only accessible by electron microscopy approaches.
One of these promising techniques is single molecule localization microscopy (SMLM) in its most varied forms such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) which are based on the temporal separation of the emission of individual fluorophores. Localization analysis of the subsequently taken images of single emitters eventually allows to reconstruct an image containing super-resolution information down to typically 20 nm in a cellular setting. The key point here is the localization precision, which mainly depends on the image contrast generated the by the individual fluorophore’s emission. Thus, measures to enhance the signal intensity or reduce the signal background allow to increase the image resolution achieved by dSTORM. In my thesis, this is achieved by simply adding a reflective metal-dielectric nano-coating to the microscopy coverslip that serves as a tunable nano-mirror.
I have demonstrated that such metal-dielectric coatings provide higher photon yield at lower background and thus substantially improve SMLM performance by a significantly increased localization precision, and thus ultimately higher image resolution. The strength of this approach is that ─ except for the coated cover glass ─ no specialized setup is required. The biocompatible metal-dielectric nano-coatings are fabricated directly on microscopy coverslips and have a simple three-ply design permitting straightforward implementation into a conventional fluorescence microscope. The introduced improved lateral resolution with such mirror-enhanced STORM (meSTORM) not only allows to exceed Widefield and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM performance, but also offers the possibility to measure in a simplified setup as it does not require a special TIRF objective lens.
The resolution improvement achieved with meSTORM is both spectrally and spatially tunable and thus allows for dual-color approaches on the one hand, and selectively highlighting region above the cover glass on the other hand, as demonstrated here.
Beyond lateral resolution enhancement, the clear-cut profile of the highlighted region provides additional access to the axial dimension. As shown in my thesis, this allows for example to assess the three-dimensional architecture of the intracellular microtubule network by translating the local localization uncertainty to a relative axial position. Even beyond meSTORM, a wide range of membrane or surface imaging applications may benefit from the selective highlighting and fluorescence enhancing provided by the metal-dielectric nano-coatings. This includes for example, among others, live-cell Fluorescence Correlation Spectroscopy and Fluorescence Resonance Energy Transfer studies as recently demonstrated.