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In the present study, a new gene cluster of Listeria monocytogenes EGD containing three internalin genes was identified and characterized. These genes, termed inlG, inlH and inlE, encode proteins of 490, 548 and 499 amino acids, respectively, which belong to the class of large, surface-bound internalins. Each of these proteins contains a signal peptide, two regions of repeats (Leucine-rich repeats and B repeats), an inter-repeat region and a putative cell wall anchor sequence containing the sorting motiv LPXTG. PCR analysis revealed the presence of the inlGHE gene cluster in most L. monocytogenes serotypes. A similar gene cluster termed inlC2DE localised to the same position on the chromosome was described in a different L. monocytogenes EGD isolate. Sequence comparison of the two clusters indicates that inlG is a new internalin gene, while inlH was generated by a site-specific recombination leading to an in-frame deletion which removed the 3'-terminal end of inlC2 and a 5'-portion of inlD. The genes inlG, inlH and inlE seem to be transcribed extracellularly and independent of PrfA. To study the function of the inlGHE gene cluster several in-frame deletion mutants were constructed which lack the genes of the inlGHE cluster individually or in combination with other inl genes. When tested in the mouse model, the inlGHE mutant showed a significant reduction of bacterial counts in liver and spleen in comparison to the wild type strain, indicating that the inlGHE gene cluster plays an important role in virulence of L. monocytogenes. The ability of this mutant to invade non-phagocytic cells in vitro was however two- to three-fold higher than that of the parental strain. To examine whether deletion of the single genes from the cluster has the same stimulatory effect on invasiveness as deletion of the complete gene cluster, the single in-frame deletion mutants inlG, inlH and inlE were constructed. These mutants were subsequently reverted to the wild type by introducing a copy of the corresponding intact gene into the chromosome by homologous recombination using knock-in plasmids. To determine a putative contribution of InlG, InlH and InlE in combination with other internalins to the entry of L. monocytogenes into mammalian cells, the combination mutants inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE were constructed. Transcription of the genes inlA, inlB and inlC in these mutants was studied by RT-PCR. Deletion of inlGHE enhances transcription of inlA and inlB, but not of inlC. This enhancement is not transient but can be observed at different time-points of the bacterial growth curve. Deletion of inlA also increases transcription of inlB and vice-versa. In contrast, the amounts of inlA and inlB transcripts in the single deletion mutants inlG, inlH and inlE were similar to those from the wild type.
Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle für die Virulenz von Legionella pneumophila
(2000)
Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein fakultativ intrazelluläres, ubiquitär vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilität der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen können, ist bisher noch nicht geklärt. Um etwas über noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region näher charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst kürzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide“-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adhärenz, Invasion, intrazellulärer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle für das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilitätsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gewählten Versuchsbedingungen bezüglich des Adhärenzvermögens der Stämme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz für die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgeprägt. Hinsichtlich der intrazellulären Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings führte vermutlich die Reduktion der Invasivität zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream“-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp überlappend, das Gen motB an, welches für den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilität an Vorgängen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adhärenz und die intrazelluläre Vermehrung nicht beeinträchtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst kürzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream“ auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabhängig reguliert werden.