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Die Erforschung viraler Proteine ist wichtig, um virale Infektionen besser verstehen und
damit therapieren zu können. Die Aufklärung der DUB-Funktion auf dem viralen
Herpesprotein pUL36 ermöglicht ein besseres Verständnis des Infektionshergangs und
könnte zur Entwicklung eines Enzyminhibitors führen, der nur an diesem Enzym ansetzt,
nachdem es sich von den zellulären DUBs unterscheidet (Kattenhorn et al., 2005). In
dieser Arbeit konnten die vorherigen Daten, die eine stärkere Hemmung der DUB-
Mutante unter Interferoneinfluss zeigten, in unterschiedlichen Assay-Designs bestätigt
werden. Auch Versuche mit einem anderen Herpes simplex Virus Strang, bestätigten die
vorherigen Daten. Die Ergebnisse zeigen, dass die DUB-Funktion für HSV-1 wichtig ist für
die virale Evasion der zellulären Immunantwort. Die genaue Funktion der DUB in der
Infektion ist jedoch unklar. Aufgrund der vorbestehenden Datenlage erschien am
wahrscheinlichsten, dass die DUB-Funktion vor Eindringen des Herpes Simplex Virus in
den Zellkern zum Tragen kommt, womit es nach Abnahme des Interferons nicht zu einer
viralen Reaktivierung käme. Deshalb wurden Untersuchungen unternommen, um eine
mögliche Reaktivierung nach Abnahme des Interferons näher zu untersuchen. Hierfür
wurden zwei verschiedene Experimente entwickelt. Einmal wurde das Interferon direkt
nach Infektion und einmal 3 Tage nach Infektion (3dpi) abgenommen. Die Ergebnisse
zeigten beide eine stärkere Hemmung der DUB-HSV-1-Mutante unter Interferoneinfluss.
Bei Abnahme des Interferons direkt nach Infektion lag bei Wildtyp und Mutante ein
leichter Anstieg der Plaquezahlen vor, wobei dieser Effekt von der Dosis des Interferons
abhängig war. Eine hohe Interferondosis begünstigte bei beiden eine stärkere Hemmung,
allerdings bei beiden auch eine leichte Erhöhung der Plaquezahl nach Abnahme. Bei
einer niedrigen Dosis konnte nur eine stärkere Hemmung der DUB-Mutante, jedoch
keine Reaktivierung bei Wildtyp und Mutante nach Abnahme des Interferons gezeigt
werden. Bei Abnahme drei Tage nach Infektion zeigte sich sowohl bei dem Wildtyp-Virus
als auch der DUB- Mutante kein Anstieg in den Plaquezahlen. Es sind, nachdem
Deubiquitinierung nicht nur eine Rolle in der Verhinderung des proteosomalen Abbaus
von in die Zelle eingedrungenem Virus spielt, sondern auch der Zellregulation, mehrere
Szenarien denkbar, die diesen Phänotyp erklären könnten. Die DUB-Funktion könnte
zwar den proteosomalen Abbau durch Deubiqutinierung und damit Verhinderung der
Markierung des Virus zum zellulären Abbau verhindern. Allerdings könnten sich durch
einen langsameren Transport aus der Zelle oder in den Nucleus auch weniger Plaques
bei der Mutante als wie beim Wildtyp unter Interferoneinfluss bilden, nachdem das Virus
dann leichter Ziel antiviraler Proteine werden könnte. Oder die DUB-Funktion spielt eine
Rolle beim Eintritt in den Kern durch Modifikationen anderer Proteine. Virengenome
könnten auch durch eine fehlende DUB-Funktion reprimiert werden oder die Zelle durch
Apoptose absterben. Interessanterweise konnte keine Hemmung der DUB-Mutante in
Interferon behandelten U-2 OS Zellen gezeigt werden, von denen ein Defekt im STING-
vermittelten Signalweg bekannt ist. Vielleicht zeigt dies, dass das STING-Protein an dem
gezeigten DUB-Phänotyp beteiligt ist. Nachgewiesen ist außerdem bereits eine Funktion
des Enzyms bei der zweiten Umhüllung der Kapside bei Pseudorabiesvirus (Möhl, 2011).
Weitere Untersuchungen unter Einsatz bspw. von Immunfluoreszenz,
Proteasominhibitoren oder weiteren Zelllinien wie Saos-2, sind nötig, um die genaue
Funktion zu klären.
Motor neuron diseases (MNDs) encompass a variety of clinically and genetically heterogeneous disorders, which lead to the degeneration of motor neurons (MNs) and impaired motor functions. MNs coordinate and control movement by transmitting their signal to a target muscle cell. The synaptic endings of the MN axon and the contact site of the muscle cell thereby form the presynaptic and postsynaptic structures of the neuromuscular junction (NMJ). In MNDs, synaptic dysfunction and synapse elimination precede MN loss suggesting that the NMJ is an early target in the pathophysiological cascade leading to MN death. In this study, we established new experimental strategies to analyze human MNDs by patient derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and investigated pathophysiological mechanisms in two different MNDs.
To study human MNDs, specialized cell culture systems that enable the connection of MNs to their target muscle cells are required to allow the formation of NMJs. In the first part of this study, we established and validated a human neuromuscular co-culture system consisting of iPSC derived MNs and 3D skeletal muscle tissue derived from myoblasts. We generated 3D muscle tissue by culturing primary myoblasts in a defined extracellular matrix in self-microfabricated silicone dishes that support the 3D tissue formation. Subsequently, iPSCs from healthy donors and iPSCs from patients with the progressive MND Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) were differentiated into MNs and used for 3D neuromuscular co-cultures. Using a combination of immunohistochemistry, calcium imaging, and pharmacological stimulations, we characterized and confirmed the functionality of the 3D muscle tissue and the 3D neuromuscular co-cultures. Finally, we applied this system as an in vitro model to study the pathophysiology of ALS and found a decrease in neuromuscular coupling, muscle contraction, and axonal outgrowth in co-cultures with MNs harboring ALS-linked superoxide dismutase 1 (SOD1) mutation. In summary, this co-culture system presents a human model for MNDs that can recapitulate aspects of ALS pathophysiology.
In the second part of this study, we identified an impaired unconventional protein secretion (UPS) of Sod1 as pathological mechanisms in Pleckstrin homology domain-containing family G member 5 (Plekhg5)-associated MND. Sod1 is a leaderless cytosolic protein which is secreted in an autophagy-dependent manner. We found that Plekhg5 depletion in primary MNs and NSC34 cells leads to an impaired secretion of wildtype Sod1, indicating that Plekhg5 drives the UPS of Sod1 in vitro. By interfering with different steps during the biogenesis of autophagosomes, we could show that Plekhg5-regulated Sod1 secretion is determined by autophagy. To analyze our findings in a clinically more relevant model we utilized human iPSC MNs from healthy donors and ALS patients with SOD1 mutations. We observed reduced SOD1 secretion in ALS MNs which coincides with reduced protein expression of PLEKHG5 compared to healthy and isogenic control MNs. To confirm this correlation, we depleted PLEKHG5 in control MNs and found reduced extracellular SOD1 levels, implying that SOD1 secretion depends on PLEKHG5. In summary, we found that Plekh5 regulates the UPS of Sod1 in mouse and human MNs and that Sod1 secretion occurs in an autophagy dependent manner. Our data shows an unreported mechanistic link between two MND-associated proteins.