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Sonstige beteiligte Institutionen
- Universitätsklinikum Münster (2)
- Genelux Corporation, San Diego Science Center, 3030 Bunker Hill Street, Suite 310, San Diego, California 92109, USA (1)
- Helmholtz Center for RNA-based Infection Research (1)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (MIB) der Universität Würzburg (1)
- MRB Forschungszentrum für Magnet-Resonanz-Bayern e.V., Am Hubland, D-97074 Würzburg (1)
- Research Center for Infectious Diseases (ZINF), University of Wuerzburg, Wuerzburg, Germany, (1)
- Research Center of Infectious Diseases (ZINF) of the University of Wurzburg, Germany (1)
- Zentrum für Infektionsforschung (ZINF): Nachwuchsgruppe 2 (1)
Wirtsspezifität der Gattung Legionella und Etablierung von Dictyostelium discoideum als Wirtsmodell
(2002)
Bei der Gattung Legionella handelt es sich um aquatische Stäbchenbakterien, die sich intrazellulär in verschiedenen Protozoen vermehren können. Neben der Nutzung des Protozoenwirtes können humanpathogene Legionella-Spezies in den Alveolarmakrophagen des menschlichen Respirationstraktes replizieren. Diese Besiedelung der Lunge kann zu einer atypischen Pneumonie, der Legionärskrankheit, führen. Humanpathogene Vertreter der Gattung Legionella weisen somit ein duales Wirtssystem auf. Die Wirtsspezifität phylogenetisch verschiedener Legionella Spezies wurde bislang nicht systematisch analysiert. Mit Hilfe von Infektionsversuchen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass für unterschiedlichste Legionella Spezies Acanthamoeba castellanii ein gut geeigneter Wirt darstellt. Hartmannella vermiformis und Naegleria gruberi ermöglichen dagegen nur einem eingeschränkten Legionella-Spektrum ein intrazelluläres Wachstum. Die jeweils höchsten Vermehrungsraten zeigten dabei in allen Amöben die Umweltisolate LLAP 10 und L. lytica sowie der humanpathogene Stamm L. pneumophila Corby. Außerdem scheint die Virulenz humanpathogener Legionellen-Spezies korreliert zu sein mit der Nutzung eines breiten Wirtsspektrums. Ciliaten wie Tetrahymena pyriformis sind im Gegensatz zu den Amöben als Wirte nicht so gut geeignet. Im Vergleich zu den Amöben ist sowohl die Anzahl der sich intrazellulär in T. pyriformis replizierenden Legionella-Spezies sowie deren Replikationsrate erniedrigt. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war es Dictyostelium discoideum als neues Wirtsmodell zu etablieren. Bei dieser gut erforschten Bodenamöbe stehen zahlreiche molekularbiologische Methoden für das Manipulieren des Genoms zur Verfügung. Somit ist es möglich, die während einer Infektion benötigten Wirtsfaktoren von Seiten der Amöbe näher zu untersuchen. Mittels Infektionsversuchen sowie fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Methoden konnte die intrazelluläre Replikation von LLAP 10, L. lytica und L. pneumophila in D. discoideum gezeigt werden. Für L. pneumophila konnte durch FACS-Analyse festgestellt werden, dass Bakterien dieser Legionella-Spezies genauso wie in den bisher untersuchten Wirtszellesystemen zu Beginn der Infektion in einem nicht angesäuerten Kompartiment vorliegen. Für alle weiteren verwendeten Legionella Spezies sowie hitzeabgetötete L. pneumophila und die Futterbakterien Klebsiella aerogenes konnte dagegen eine Ansäuerung des Phagosoms nachgewiesen werden. Kolokalisierungsstudien des lysosomalen Markers DdLIMP mit Legionellen bestätigte außerdem eine Inhibierung der Phagolysosomfusion bei L. pneumophila, nicht jedoch bei der sich nicht replizierenden Spezies L. hackeliae. Die Untersuchung einer spezifischen Profilin-minus Dictyostelium-Mutante offenbarte eine erhöhte Phagozytoserate von Legionellen durch die Wirtszellen. Daraus resultierte auch eine leicht gesteigerte intrazelluläre Vermehrungsrate dieser Bakterien. Profilin ist ein Aktin-bindendes Protein und an der Regulation von Aufnahmeprozessen beteiligt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung Bakterien-haltiger Phagosomen aus D. discoideum etabliert. Die magnetische Reinigung von Phagosomen über paramagnetische, Bakterien-konjugierte Beads erwies sich als nicht praktikabel. Die daraufhin entwickelte Anreicherung der Phagosomen über Dichtegradienten-Zentrifugation erforderte jedoch zusätzlich die Eliminierung kontaminierender Lysosomen und Mitochondrien. Die Analyse des phagosomalen Proteoms erfolgte mittels Messung von Enzymaktivitäten und Western-Blotting-Experimenten. Dabei konnten keine quantitativen Unterschiede typischer lysosomaler Marker zwischen gereiften und ungereiften Phagosomen mit lebenden bzw. toten L. pneumophila detektiert werden. Ebenso verlief der Vergleich von ungereiften LLAP 10-haltigen Phagosomen und gereiften Klebsiella-haltigen Phagosomen. Dagegen zeigte die 2D-Gelelektrophorese des phagosomalen Proteoms vier Proteine, die in Phagosomen mit toten L. pneumophila Corby stärker exprimiert waren als in Phagosomen mit lebenden Legionellen. Weiterhin wurde ein Protein detektiert, das für Phagosomen, die lebende L. pneumophila Bakterien beinhalten, spezifisch ist. Dabei könnte es sich um einen von L. pneumophila zur Replikationsvakuole rekrutierten Wirtsfaktor handeln.
Vibrio cholerae Phage K139
(2002)
Bisher sind ca. 190 verschiedene Vibriophagen beschrieben, nur 10 davon stellen filamentöse Phagen dar, der Rest gehört zu den sogenannten Caudovirales, d.h. sie weisen ein kubisches Nukleokapsid mit einem mehr oder weniger langen Schwanz auf. Der letzteren Gruppe ist auch der Phage K139 zuzurechnen. K139 ist ein temperenter Phage, dessen Wirtsspektrum sich nach bisherigen Erkenntnissen auf V. cholerae Stämme der Serogruppen O1 und O139 beschränkt. Als Rezeptor dient ihm dabei das O1 Lipopolysaccharid (LPS), Morphologisch ist er der Familie der Myoviridae zuzurechnen, innerhalb des Klassifikations-Schemas der Vibriophagen den Kappa-Phagen. Diese Phagengruppe weist eine hohe Assoziation mit epidemischen O1 El Tor Stämmen auf, es gibt aber keine Hinweise auf eine Beteiligung an der Virulenz von V. cholerae. In dieser Arbeit wurde die vollständige K139 Genomsequenz ermittelt. Diese besteht aus 33.1 kb ds DNA, die Sequenzierung deutet auf eine terminale Redundanz hin. Zusammen mit dem bereits bekannten Sequenzabschnitt ergab sich eine Zahl von insgesamt 44 offenen Leserastern (ORFs). Sowohl auf Sequenzebene als auch hinsichtlich der Organisation des Genoms konnte eine Verwandtschaft von K139 zu den P2-Phagen gefunden werden. Insgesamt weisen 26 ORFs Homologie zu P2 Genprodukten auf. Für 14 ORFs war eine Funktionszuordnung basierend auf der Homologie zu bereits bekannten Proteinen möglich. Auch über die Analyse der Sequenzmotive wurde versucht, Hinweise auf eine mögliche Funktion der putativen Proteine zu erhalten. Zur Unterstützung der bioinformatischen Auswertung wurden weiterführende Untersuchungen angestellt. So wurden die Proteine des Phagenpartikels mittels 2D SDS-PAGE und MALDI-TOF analysiert. Auf diese Weise konnten vier putative Kapsid- und drei putative Schwanz-Proteine als Bestandteil des Phagenpartikels ermittelt werden. Weiterhin wurde durch Überexpression und Restriktionsanalysen Orf8 als Adenin-spezifische Methyltransferase identifiziert. Als Methylierungssequenz wurde die Basenabfolge 5´-GATC-3´ ermittelt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Funktionszuordnung putativer Genregulatoren. Dies wurde einmal für die Proteine Orf2 und CI durch Überexpression und Konstruktion von Deletionsmutanten und deren phänotypischer Bestimmung in Plaque-Assays untersucht. Dabei konnte Orf2 eine mögliche Schutzfunktion vor superinfizierenden Phagen zugeschrieben werden. Widersprüchlich sind dagegen die Ergebnisse für die Funktion von CI, das aufgrund seiner Homologie als Repressor der Lyse dienen sollte. Zum zweiten wurde in einem Promotor-Test System der Einfluß der Proteine CI, Orf2, 8, 11, 12 und 13 auf vier verschiedene putative Promotor-Bereiche von K139 untersucht. Weiterhin wurde durch Southern Blot Analysen die Verbreitung von K139 innerhalb verschiedener V. cholerae Isolate untersucht. Dabei wurden in 50% der O1 und O139 und in 7% der Nicht-O1/O139 Stämme ein positives Hybridisierungssignal gefunden. Dabei zeigten der O1 klassische Stamm sowie zwei Nicht-O1/O139 Stämme ein verändertes Restriktionsmuster. Nähere Untersuchungen der verschiedenen Phagentypen mittels Southern-Blot und PCR zeigten eine hohe Verwandtschaft, lediglich eine Region, die der K139 Genomregion zwischen dem rep und dem orf15 Gen entspricht, zeigte auffällige Unterschiede. Die Sequenzierung ergab eine auffallend mosaikartige Struktur mit homologen und nicht-homologen Sequenzabschnitten im Vergleich der Phagen untereinander. Schließlich wurde noch eine weitere Genregion sequenziert, orf35 bis orf36, in der wirtsspezifische Sequenzunterschiede vermutet wurden. Für die Sequenz von orf35, das für das putative Schwanzfaser Protein kodiert, konnte eine mosaikartige Struktur ermittelt werden, die durch die Anwesenheit von zwei konservierten (C1 und C2) und zwei variablen (V1 und V2) Regionen zustande kommt. Die Kombination der variablen Bereiche ergab drei verschiedene Schwanzfaser-Protein Typen. Überraschenderweise korrelieren diese Typen nicht mit der Serogruppe des Wirtes. So konnte der gleiche Schwanzfaser-Typ in drei verschiedenen Serogruppen gefunden werden. Als Grund hierfür wird die Fähigkeit von V. cholerae diskutiert, durch horizontalen Gentransfer ein neues LPS Biosynthese-Cluster zu erwerben und damit die Serogruppe zu wechseln.
Staphylococcus epidermidis zählt zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen im Zusammenhang mit implantierten Fremdkörpern. Diese Bakterien zeigen eine außergewöhnliche phänotypische und genotypische Variabilität, von der auch die Expression wichtiger virulenz- und resistenzassoziierter Gene betroffen ist. Möglicherweise verfügen Staphylokokken damit über Anpassungsstrategien, die sie für das Überleben unter wechselnden Umweltbedingungen benötigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von bakteriellen Insertionssequenzen (IS) bei der Genomplastizität von Staphylococcus epidermidis untersucht. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei das Insertionselement IS256 und sein Einfluß auf die Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis. Die Fähigkeit von S. epidermidis, an Oberflächen zu haften und Biofilme zu bilden ist von der Präsenz und Expression des ica-Operons abhängig, das Enzyme für die Synthese eines Exopolysaccharids (PIA) kodiert. Die PIA-Produktion ist äußerst variabel und hat damit Einfluß auf das Virulenz- und Kolonisierungsverhalten dieser Bakterien. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die veränderliche PIA-Produktion bei S. epidermidis im wesentlichen auf drei Mechanismen zurückzuführen ist, an denen das IS-Element IS256 ursächlich beteiligt ist. Zunächst konnte durch den Vergleich der IS256-spezifischen Hybridisierungsmuster eines biofilmbildenden S. epidermidis-Wildtypstammes und dessen PIA-negativer Spontanvarianten gezeigt werden, daß die multiplen IS256-Kopien im Genom dieses Stammes außerordentlich aktiv sind. Die nähere Analyse der Varianten ergab bei einem Teil der PIA-negativen Abkömmlinge umfangreiche IS256-vermittelte genomische Umordnungen als Ursache für den Verlust der Biofilmbildung. Eine weitere Gruppe von Biofilm-negativen Varianten wies IS256-Insertionen im ica-Gencluster auf. Die Verteilung der Insertionsstellen im ica-Operon ließ darauf schließen, daß es sich bei dem icaC-Gen um einen Hot-spot für die Integration von IS256 handelt. Solche ica::IS256-Insertionen konnten bereits in zahlreichen S. epidermidis Stämmen nachgewiesen werden. Da diese Insertionen reversibel sind, bilden sie eine wesentliche Ursache für die Phasenvariation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Bei einer dritten Gruppe von Varianten konnten Deletionen verschieden großer DNA-Abschnitte im S. epidermidis-Chromosom beobachtet werden, die zu einem Verlust der ica-Gene und damit der Fähigkeit, Biofilme auszubilden, führte. Um die Frage zu klären, welche Gene in der Umgebung des ica-Operons liegen und durch die Deletion von bis zu 250 kb-großen DNA-Fragmenten verloren gehen, wurde eine Cosmid-Genbank des S. epidermidis –Wildtypstammes erstellt. Die durch Nukleotidsequenzierung erhaltenen Informationen wurden mit der in der Genom-Datenbank zur Verfügung stehenden Sequenz des 1. A ZUSAMMENFASSUNG 2 Referenzstammes S. epidermidis RP62A verglichen und in einer Genkarte zusammengefaßt. Neben einzelnen Unterschieden zwischen den beiden S. epidermidis-Stämmen fiel vor allem auf, daß mehrere der von der Deletion betroffenen Leseraster für Proteine mit Ähnlichkeiten zu oberflächenassoziierten Proteinen kodieren, die an der Adhärenz der Bakterien beteiligt sein könnten. Daneben finden sich aber auch Leserahmen mit Ähnlichkeiten zu Transportsystemen und zahlreiche mobile genetische Elemente. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das ica-Operon von S. epidermidis möglicherweise Teil einer Pathogenitätsinsel ist. Die Analyse der Deletionsrandbereiche einer Mutante ergab, daß der Verlust von mehr als 200 kb DNA durch homologe Rekombination zwischen zwei IS256-Elementen vermittelt wurde, die im Wildtypstamm in gleicher Orientierung zueinander vorlagen. Da IS256 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Genomplastizität von S. epidermidis spielt, konzentrierte sich der zweite Teil der Arbeit auf die Aufklärung des Transpositionsmechanismus dieses IS-Elements. Dabei konnte gezeigt werden, daß IS256 eine alternative Transpositionsreaktion nutzt, die durch die Bildung zirkulärer, extrachromosomaler DNA-Moleküle gekennzeichnet ist. Diese DNA-Zirkel bestehen aus einer vollständigen IS256-Kopie, bei der die beiden Enden des Elementes durch eine variable Anzahl von Nukleotiden fremder DNA als Brücke miteinander verbunden sind. Es konnte gezeigt werden, daß diese kurzen DNA-Abschnitte aus der Nachbarschaft der früheren IS256-Insertionsstelle stammen, wobei sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts liegende Nukleotidsequenzen nachgewiesen wurden. Neben diesen vollständigen IS256-Zirkeln wurden aber auch Moleküle gefunden, bei denen entweder das rechte oder das linke Ende von IS256 fehlten. Die Daten legen nahe, daß beide IS256-Enden an der Zirkelbildung teilnehmen können und im Unterschied zu anderen zirkelbildenden Insertionssequenzen, die Strangtransferreaktion während der Zirkularisierung mit geringer Spezifität verläuft. Ringförmige IS256-Moleküle konnten sowohl in S. epidermidis als auch in rekombinanten S. aureus und E. coli-Stämmen nachgewiesen werden, was auf eine untergeordnete Rolle speziesspezifischer Faktoren bei diesem Prozeß schließen läßt. Dagegen konnte durch die Einführung einer Mutation in das putative Transposasegen des Elementes gezeigt werden, daß dieses Genprodukt für die IS256-Zirkularisierung essentiell ist. Es ist zu vermuten, daß die Bildung zirkulärer IS256-Moleküle die Voraussetzung für die präzise Exzision des Elementes während der Phasenvariation der Biofilmproduktion bildet. Außerdem ist die Generierung stabiler Mutationen durch das Zurücklassen von Teilen der duplizierten Zielsequenz oder durch die Vermittlung kleinerer Deletionen während der Zirkelbildung vorstellbar. Darüber hinaus bilden die multiplen Kopien des Elementes im Genom Kreuzungspunkte für homologe Rekombinationsereignisse. IS256 stellt damit sehr wahrscheinlich einen wesentlichen Faktor für die Flexibilität des Genoms von S. epidermidis dar. Die detaillierte Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Transposition von IS256 beeinflussen, könnten daher wertvolle Einblicke in die genetischen Anpassungsstrategien dieses bedeutenden nosokomialen Pathogens geben.
Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können.
Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden.
Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberflächenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zusätzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Moleküle synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unverändertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgewählte spontan phagenresistente Stämme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen Stämme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit verändertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das für die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich für die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber verändertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeinträchtigt waren. Zusätzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zusätzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Phänotyp an abiotischen Oberflächen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose für die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen Mäusen ergaben, daß O-Antigen negative Stämme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im Dünndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte für den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zusätzlich wurde die Überlebensfähigkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen Dünndarm vorkommen, unter „in vitro“ Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegenüber schwachen organischen Säuren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallensäuren. O-Antigen negative Stämme waren dagegen weiterhin resistent gegenüber Gallensäuren und schwachen organischen Säuren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde für keine der LPS-Mutanten eine größere Beeinträchtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilität, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der äußeren Membran war offensichtlich nicht beeinträchtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verstärktem Maße periplasmatische Proteine in den Überstand diffundieren können. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur für eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund dafür ist höchstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen äußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des Dünndarms ermöglicht.
Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist.
H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien für Hämin unter aeroben Bedingungen und für Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es können zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten Stämme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren Stämme, die für Oberflächeninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig über die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des Häminaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der Hämin-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) für die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht fähig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, während die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu klären, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig für die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivität. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivität die einzige für die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminosäureaustausch die Phosphatase-Aktivität verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Phänotypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die Fähigkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Phänotypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die fähig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivität nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN für die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht fähig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschränkt, während mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR über einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der äußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren.
Einhundertvierundvierzig STEC-Stämme von Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom (68 Stämme), von Durchfallpatienten (42 Stämme) und von asymptomatischen Ausscheidern (44 Stämme) wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Antibiotika-empfindlichkeit hin untersucht. Zu den insgesamt 13 getesteten Antibiotika zählten die ß-Laktam Antibiotika Ampicillin, Piperacillin, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefotiam und Imipenem, die Aminoglykoside Gentamicin und Streptomycin, die Gyrasehemmer Ofloxacin und Ciprofloxacin sowie Tetracyclin, Chlorampenicol und die Sulfamethoxazol/Trimethoprim-Kombination Cotrimoxazol. Alle E. coli O157 Stämme, die von Patienten mit HUS isoliert wurden, waren sensibel gegen die getesteten Antibiotika. Lediglich ein E. coli O157 Stamm, der von einem Durchfall-Patienten isoliert wurde, zeigte eine Resistenz gegen Tetracyclin. Allgemein häufiger wurden Antibiotikaresistenzen bei non-O157 Stämmen gefunden. Fünf von 22 non-O157 Stämmen, die von HUS-Patienten isolierten wurden, zeigten mindestens eine Resistenz gegen die getesteten Antibiotika. Vierzehn von fünfunddreißig non-O157 E. coli Stämmen, die sowohl von Durchfall-Patienten als auch von asymptomatischen Ausscheidern stammten, konnten sowohl Einfachresistenzen als auch Multiresistenzen aufweisen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) zeigte, daß alle resistente Stämme einen extrem hohen Resistenzstatus besitzen. Sowohl ß-Laktam als auch Tetracyclin Resistenzen konnten mittels Konjugation auf einen E. coli-Laborstamm übertragen werden. Dies läßt die Anwesenheit von R-Plasmiden vermuten. Die Tatsache, daß über 12 Prozent Shigatoxin produzierender E. coli Stämme aus humanen Stuhlproben Antibiotikaresistenzen aufweisen, hat klinische und epidemiologische Bedeutung. Resistente STEC-Stämme hätten einen selektiven Vorteil gegenüber anderen koliformen Bakterien in Mastbetrieben, die Antibiotika dem Futtermittel beimengen. Hieraus wiederum steigt die Gefahr einer potentiellen Übertragung resistenter Pathogene auf den Menschen. Auf der anderen Seite könnte die ansteigende Anzahl Antibiotika-resistenter Stämme zu einer rasch durchführbaren epidemiologischen Nachweismethode führen.
Legionella pneumophila wurde 1976 als Erreger der Legionellose, einer schweren Form von Lungenentzündung, identifiziert. Die inzwischen 42 Arten umfassende Gattung ist weltweit in aquatischen Biotopen verbreitet. Die Bakterien leben vergesellschaftet mit anderen Mikroorganismen in Biofilmen oder intrazellulär in Protozoen. Sie haben ein duales Wirtssystem, das heißt, sie sind in der Lage, sich sowohl in Einzellern als auch in humanen Phagozyten zu vermehren. Für die Erweiterung ihrer Habitate spielen verschiedene Umweltfaktoren eine Rolle. Eine exakte und schnelle Detektion und Identifikation der humanpathogenen Keime ist sowohl für die Lokalisierung der Infektionsquelle als auch für eine rechtzeitige Therapie der Patienten von großer Bedeutung. Die Technik der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) basiert auf der Bindung einer spezifischen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde an eine komplementäre Zielsequenz der ribosomalen RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde für die in situ Hybridisierung eine neue 16S rRNA-gerichtete Sonde LEGPNE1 entwickelt, die spezifisch ist für L. pneumophila. In Versuchsreihen mit verschiedenen Bakterienkulturen wurden die Spezifität und Sensitivität der Gensonde ermittelt. LEGPNE1 erwies sich als artspezifisch und erkannte alle getesteten L. pneumophila-Stämme, ungeachtet ihrer Serogruppe. Nicht-pneumophila-Referenzstämme hybridisierten nicht mit der Sonde, ein einziger Basenaus-tausch in der Sequenz war für diese Unterscheidung ausreichend. Die Anwendung der Sonde wurde auch in Amöben-Infektionsassays und Umweltproben erfolgreich durchgeführt. Unterschiedliche, intrazellulär vorliegende Bakterien wurden von der Sonde spezifisch erkannt. Eine in situ Dokumentation der Infektions- und Vermehrungsrate war damit möglich. Durch die meist fakultativ intrazelluläre Lebensweise der Legionellen ist es wichtig, auch die Wirtszellen der Keime qualitativ zu detektieren und zu identifizieren. Die Entwicklung neuer Gensonden wurde daher auf die beiden bekannten Wirtsamöben Hartmannella und Naegleria ausgedehnt. Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die gattungsspezifischen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konstruiert und in Versuchsreihen mit Referenzstämmen bei steigender Stringenz etabliert. Mit ihrer Hilfe konnten die Ergebnisse der zeit- und arbeitsaufwendigen Determination unbekannter Amöben anhand morphologischer Merkmale bestätigt werden. In situ Hybridisierungen mit einer Kombination von 16S und 18S rRNA-gerichteten Sonden wurden in Amöben-Infektionsassays mit Hartmannella vermiformis und L. pneumophila erfolgreich durchgeführt. Eine Interferenz der Sonden fand nicht statt. Die in situ Untersuchung der Struktur und Funktion komplexer mikrobieller Lebensgemeinschaften erfordert eine kultivierungsunabhängige und hochauflösende Methode, wie sie die fluoreszierende in situ Hybridisierung darstellt. Mit dem Ziel, mögliche Präferenzen der Legionellen für bestimmte Parameter, wie pH, Temperatur, elektrische Leitfähigkeit, Strömungsverhältnisse, zu erkennen und zu definieren, wurden mit Hilfe der neu entwickelten 16S rRNA-gerichteten Sonde 21 verschiedene Kaltwasserhabitate auf die Verbreitung von Legionella untersucht. Die Bakterien zeigten jedoch ein breites Toleranzspektrum gegenüber den gemessenen Parametern. Sie waren in nahezu allen beprobten Gewässern zu finden und ließen sich unabhängig von der Jahreszeit nachweisen. Die neue Sonde LEGPNE1 zeigte sich in in situ Hybridisierungen der Umweltproben als hochspezifisch. Mit ihr konnten auch nicht kultivierbare Legionellen detektiert werden. In drei Legionella-positiven Gewässern wurde außerdem das Vorkommen von Amöben untersucht. Es konnten insgesamt acht Amöbengattungen isoliert, kultiviert und bestimmt werden. Dominierend waren Stämme des nicht humanpathogenen Naegleria gruberi-Komplexes, Echinamoeba spp. und Echinamoeba-like Amöben. In einzelnen Proben wurden Acanthamoeba spp. Gruppe II, Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata und Vexillifera spp. gefunden. Durch in situ Hybridisierung mit den neuen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konnten die Ergebnisse der morphologischen Bestimmung der Amöben bestätigt werden. Auch die Amöben zeigten keine Präferenzen bezüglich der in den Standorten gemessenen Wasserparameter. Die in situ Hybridisierung mit rRNA-gerichteten Gensonden erlaubt eine Analyse der Struktur und Dynamik von Biozönosen, ermöglicht aber keine Aussage über die speziellen Aktivitäten der nachgewiesenen Bakterien. Eine Lösung hierfür könnte der spezifische in situ Nachweis von mRNA-Molekülen darstellen. Ein Problem hierbei stellt ihre, im Vergleich zu anderen Molekülen wie rRNA, sehr kurze Halbwertszeit und das Vorhandensein von nur wenigen Kopien pro Zelle dar. Daher ist im Anschluss an die in situ Hybridisierung in den meisten Fällen eine Signalamplifikation nötig, um ein detektierbares Signal zu erhalten. In dieser Arbeit sollte die für das iap-Gen in Listeria monocytogenes entwickelte Methode zum Nachweis der mip-mRNA in L. pneumophila etabliert werden. Erste Anwendungen in Dot blot- und in situ Hybridisierungen mit mehrfach DIG-markierten Polyribonukleotidsonden bzw. mit simultan eingesetzten, einfach DIG-markierten Oligonukleotiden zeigten noch nicht die gewünschte Spezifität. Diese Ergebnisse stellen jedoch eine wichtige Grundlage für zukünftige Experimente dar.