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The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization.
Genetische Inaktivierung des somatischen Cytochrom C Gens der Maus Cytochrom C wurde als ein Interaktionspartner im Apoptosom beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, die Rolle von Cytochrom C bei der Apoptose von Nervenzellen in vivo durch genetische Inaktivierung in der Maus zu untersuchen. Die homozygote Deletion des Cytochrom C Gens führt jedoch zu einem sehr frühen Entwicklungsdefekt: Schon am 8. Embryonaltag findet man nur noch Embryonen ohne erkennbare Körperachse. Im weiteren wurden daher heterozygote Tiere untersucht, die in bestimmten Geweben, wie Gehirn und Rückenmark, eine Reduktion der Menge von Cytochrom C aufweisen. Am ersten Tag nach der Geburt konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit einem oder zwei Cytochrom C Genen in Bezug die Anzahl von Motoneuronen gefunden werden. Auch nach perinataler Fazialisläsion war die Rate des Zelltods bei Tieren mit heterozygoter Deletion des Cytochrom C Gens unverändert. In vitro zeigte sich jedoch eine erhöhte Resitenz von Motoneuronen gegenüber Fas-induzierter Apoptose. Bei der Analyse der Apoptose von Thymozyten zeigte sich ein Trend, der eine kleine, aber reproduzierbare Verzögerung einer späten Zelltodphase nach UV-induzierter Apoptose nahelegt. Erste Experimente deuten außerdem auf einen Effekt der Cytochrom C Gendosis auf den Verlauf einer Experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE) hin. Charakterisierung der NFL-Cre Maus Die zelltypspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System umgeht einige der größten Probleme der klassischen Methode der Geninaktivierung in Mäusen, indem nur in bestimmten Geweben oder Zelltypen, eventuell sogar nur ab einem bestimmten Zeitpunkt, ein Gen gezielt ausgeschaltet werden kann. Allerdings hängt das Cre/loxP System von der Verfügbarkeit von brauchbaren Cre-transgenen Mauslinien mit entsprechenden Expressionsmustern und –kinetiken ab. Wir haben eine transgene Mauslinie etabliert und analysiert, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des humanen Neurofilament-L Promotors exprimiert. Das Expressionsmuster von Cre wurde in mehreren Geweben mit RT-PCR und durch Verkreuzung mit einer Reportergenmaus untersucht. Im Gehirn wurden Cre exprimierende Zelltypen mit in-situ Hybridisierung, Immunhistochemie und wiederum mit Hilfe der Reportermaus identifiziert. Dabei zeigte sich eine spezifische Cre Expression in bestimmten Neuronpopulationen wie hippocampalen Pyramidenzellen und spinalen und cranialen Motoneuronen. Unsere NFL-Cre Maus besitzt einige Eigenschaften, die bisher publizierte Cre-Linien nicht aufweisen, so z.B.eine starke Cre Expression in hippocampalen Pyramidenzellen, aber nicht in Körnerzellen des Gyrus dentatus; Expression in cortikalen Pyramidenzellen, aber keine Expression im Striatum; Expression in zerebellären Purkinje-, aber nicht Körnerzellen; sowie die Expression in spinalen und cranialen Motoneuronen, aber nicht in angrenzenden Interneuronen. Die Rolle von Stat3 für das Überleben von Motoneuronen Die Mitglieder der CNTF/LIF/Cardiotrophin Genfamilie sind potente Überlebensfaktoren für embryonale und lädierte Motoneurone sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Faktoren binden an Rezeptorkomplexe, die gp130 und LIFR als signaltransduzierende Komponenten enthalten. Im Gegensatz zu den Rezeptoren für andere neurotrophe Faktoren, führt die Aktivierung von gp130 und LIFR zur Phosphorylierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Stat3. Es war aber zu Beginn dieser Arbeiten unklar, ob die Aktivierung von Stat3 für den Überlebenseffekt der neuropoietischen Zytokine notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde Stat3 in Motoneuronen mit Hilfe des Cre/loxP Systems konditional inaktiviert. Stat3 ist nicht für das Überleben embryonaler Motoneurone essentiell, obwohl man in vitro eine Verschiebung der Dosis-Wirkungskurve für CNTF findet. In vivo hingegen kann kein erhöhter Zelltod von Motoneuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu, kommt es bei adulten Tieren mit Inaktivierung von Stat3 in Motoneuronen zu einem erhöhten Zelltod nach Fazialisläsion. Diese Neurone können wiederum durch die Applikation neurotropher Faktoren, einschließlich CNTF, gerettet werden. Durch semiquantitative RT-PCR kann man zeigen, daß Stat3-regulierte Gene, deren Expression nach Nervenläsion induziert wird, in Neuronen mit Inaktivierung von Stat3 weniger stark exprimiert werden. Zu diesen Genen gehören Reg-2, ein Mitogen für Schwannzellen, das von regenerierenden Neuronen exprimiert wird, und Bcl-xL, ein Gen, welches direkt in die Apoptoseregulation eingreift. Diese Daten zeigen, daß Stat3 Aktivierung eine essentielle Rolle für das Überleben nach Läsion von postnatalen Motoneuronen spielt, aber nicht während der Embryonalentwicklung. Das bedeutet, daß die Signalwege ein und desselben neurotrophen Faktors sich während der Entwicklung und reifung des Organismus verändern können.
Spinale Muskelatrophie (SMA), die häufigste autosomal rezessive neuromuskuläre Erkrankung bei Kindern und jungen Erwachsenen, wird durch Mutationen in der telomeren Kopie des survival motor neuron (SMN1) Gens auf dem humanen Chromosom 5 verursacht. Anders als bei Mäusen, welche nur ein Smn Gen haben, gibt es beim Menschen eine zweite Kopie (SMN2). Das Genprodukt dieser zweiten Kopie wird am C-Terminus bevorzugt alternativ gespleißt. Es bringt nur eine kleine Menge des vollständigen SMN Proteins hervor. Der Grund, warum eine reduzierte Menge des ubiquitär exprimierten SMN Proteins speziell zu einer Motorneuronendegeneration führt, ohne andere Zelltypen gleichermaßen zu betreffen ist noch immer nicht bekannt. Mit Hilfe der Yeast-Two-Hybrid Technik wurden die beiden heterogenen nukleären Ribonukleoproteine hnRNP-R und hnRNP-Q als neue SMN-bindende Proteine identifiziert. Diese beiden hochhomologen Proteine waren bereits bekannt und stehen in Verbindung mit dem RNA Metabolismus, im Speziellen: Editing, Transport und Spleißing. hnRNP-R und -Q interagieren mit Wildtyp Smn, aber nicht mit trunkierten oder mutierten Smn Formen, welche in SMA-Patienten gefunden wurden. Beide Proteine werden in den meisten Geweben exprimiert. Im Rückenmark von Mäusen ist die stärkste Expression am neunzehnten embryonalen Tag zu beobachten. Interessanterweise ist hnRNP-R hauptsächlich in den Axonen von Motoneuronen zu finden und kolokalisiert dort mit Smn. Im Mausmodell für die SMA konnte gezeigt werden, dass sich die Motoneurone von erkrankten Mäusen hinsichtlich der Morphologie ihrer Neuriten von solchen aus Wildtyp Mäusen unterscheiden. Werden hnRNP-R oder hnRNP-Q in kultivierten Nervenzellen exprimiert, so fördern sie das Wachstum von Neuriten. Bei SMA-Patienten ohne Mutation im SMN Gen konnte allerdings weder Mutation noch Deletion in hnRNP-R oder hnRNP-Q nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit können entscheidend zu einem besseren Verständnis der motoneuronen spezifischen Funktion von Smn bei der SMA beitragen.
Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF gehört neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle für Überleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich für die Regulation synaptischer Plastizität. Besonders im Hippocampus, dem Ort der höchsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorgängen von Lernen und Gedächtnis mit, welches als Phänomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-Techniken im Gehirn der Maus oder Ratte nur sehr schwer gelungen. In den meisten Arbeiten gelang die Lokalisation von BDNF über den Nachweis von mRNA oder im Western Blot, die Gruppe von Conner et al. konnte einen qualitativen Nachweis von BDNF-Protein mittels eines eigens hergestellten Antiserums erbringen (Conner et al. 1997). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Antiserums gegen BDNF zur subzellulären Lokalisation mittels Immunhistochemie. Durch die Verwendung von Immunfluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörpern sollte zum einen eine quantitative Bestimmung von BDNF möglich sein, zum anderen sollte durch die Möglichkeit einer nahezu dreidimensionalen Darstellung des Gewebes mittels Vibratomschnitten auch eine Aussage über eine genauere Lokalisation von BDNF gemacht werden können. Um den immunhistochemischen Nachweis von BDNF-Protein im Hippocampus der Maus mittels Immunfluoreszenz führen zu können, wurde zunächst ein geeignetes Anti-serum benötigt. Zwei zu Vergleichszwecken ausgetestete kommerzielle Antikörper zeigten keine Färbung. Nach dem Vorbild zweier Arbeitsgruppen (Yan et al. 1997b und Conner et al. 1996, 1997) wurde ein Antiserum gegen humanes rekombinantes BDNF in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum erhielt den Namen „BDNF RabbitB“. Die Spezifität des Antiserums wurde mittels Western Blot und in der Zellkultur anhand von Hühnchen-DRGs überprüft. Im Western Blot zeigte das Antiserum eine spezifische Anfärbung von rekombinantem BDNF sowie im Hippocampus-Proteinextrakt. In der Kontrolle mit Präimmunserum zeigte sich keine Anfärbung. In der Zellkultur mit Hühnchen-DRGs konnte eine blockierende Wirkung des Antiserums in Gegenwart von BDNF als neurotrophem Wachstumsfaktor im Zellkulturmedium nachgewiesen werden, es zeigte sich eine signifikante Reduktion des Überlebens von Zellen bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:1.000. Das Präimmunserum zeigte keine Wirkung. Eine Kreuzreaktivität mit NGF als strukturähnlichem Protein konnte ausgeschlossen werden, da das Antiserum in Gegenwart von NGF im Kulturmedium keine Wirkung zeigte. Anschließend galt es, die Methoden für die Immunhistochemie mit diesem Antiserum zu optimieren, da es Hinweise gab, daß gerade die Immunhistochemie neurotropher Faktoren sehr sensibel auf verschiedene Methoden reagiert. Daher wurden sowohl die Fixierungsmethode, unterschiedliche Gewebeschnitte, verschiedene Puffersysteme und immunhistochemische Färbemethoden untersucht und verglichen. Die Standard-Fixierungsmethode mit Phosphat-Puffer, modifiziert nach der Methode nach Yan et al. 1997b mit maximal 2 h Nachfixierung stellte sich als beste Methode heraus. Eine Kombination zweier verschiedener Puffer (TBS und PB) innerhalb der Fixierung ist ungünstig. Daher sollte innerhalb einer Methode immer bei einem Puffersystem geblieben werden, wobei hier insgesamt bei dem Vergleich von PBS, TBS und TRIS-Puffer sowohl in der Fixierung als auch in der Färbemethode dem Phosphat-Puffer der Vorzug gegeben wird, welches auch das Standard-System darstellt. Bei den Gewebeschnitten sind, wie ursprünglich geplant Vibratomschnitte zu bevorzugen. Insgesamt konnten jedoch mögliche Ursachen für die Anfälligkeit der BDNF-Immunreaktivität bei Fixierungs- und Färbemethoden hier nicht abschließend erklärt werden. Problematisch war die ausgeprägte Hintergrundfärbung des Antiserums v.a. in der Immunhistochemie, die nicht ausreichend behoben werden konnte. Insofern sollte das Antiserum für die Verwendung bei immunhistochemischen Färbungen noch weiter optimiert werden. Für die Verwendung in der Zellkultur ist das Antiserum auf Grund seiner BDNF-blockierenden Eigenschaften gut einsetzbar. Im Western Blot sollte „BDNF RabbitB“ in einer Verdünnung von 1:5.000, in Zellkultur mit 1:1.000 und in der Immunhistochemie mit Vibratomschnitten mit 1:2.000 eingesetzt werden.
Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als Überlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizität. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizität und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zunächst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum für die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bezüglich BDNF keine Veränderungen in Hippocampi CNTF-defizienter Mäuse gegenüber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten Mäusen eine eingeschränkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verständnis der – laut LTP-Untersuchungen – veränderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-Färbung nachweisbar. Zur Klärung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout Mäusen durchgeführt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in ähnlichem Maße hochreguliert, was für alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF&LIF-defizienten Mäusen, wobei LIF-defiziente Tiere keine veränderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorläuferzellen bestätigten die Hypothese, wonach cortikale Vorläuferzellen zunächst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorläuferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo für die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.
Bag-1 Defizienz in Mäusen führt in der embryonalen Entwicklung zu einem lethalen Phänotyp mit schweren Defekten in Nervensystem und Leber. Neben der Expression der Inhibitor of Apoptosis Proteinen (IAP), ist ein Komplex aus Akt, Hsp70, Bag-1 und B-Raf für die Phosphorylierung eines spezifischen AS-Restes des pro-apoptotischen Proteins Bad für das Überleben wichtig (Gotz und Wiese et al., 2005). Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Funktionen der Maus Bag-1 Isoformen in der neuronalen Entwicklung anhand von in vitro Modellen näher zu charakterisieren. Überexpression von Bag-1S und Bag-1L in PC12 Zellen zeigte, dass Bag-1S im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert wird, Bag-1L nur im Zellkern. Eine eingeführte Punktmutation, die die Interaktion mit Hsp70 verhindert, führte zu einer zytoplasmatischen Expression von Bag-1Sm. Die Mutante Bag-1Lm blieb nukleär lokalisiert. Überexpression von Bag-1S führte zu einer Reduktion der Neuritenlänge. Bag-1L und die mutanten Isoformen zeigten diesen Effekt nicht. Der inhibierende Einfluss von Bag-1S auf das Neuritenwachstum ist bislang spekulativ. Die Regulation erfolgt vermutlich über den Komplex Bag-1, Hsp70, Akt und B-Raf. Die Analyse von Bag-1 - /- Neuralen Stammzellen zeigte im Vergleich zu Bag-1 +/+ Neuralen Stammzellen eine erhöhte Apoptose. Wurde durch Vireninfektion Bag-1S oder Bag-1L zurück in die Zellen gebracht, waren diese wieder in der Lage zu überleben. Die Mutanten zeigten diese Effekte nicht, so dass Hsp70 ein notwendiger Interaktionspartner für die überlebensfördernde Wirkung von Bag-1 ist. Bag-1 -/- Neurale Stammzellen zeigten außerdem gliale Differenzierungsdefekte, die nicht durch eine Rückführung der Isoformen gerettet werden konnten. Zusätzliche Experimente, die Neurale Stammzellen gezielt in die gliale Differenzierung durch Gabe von CNTF oder LIF leiten, zeigten, dass Bag-1 -/- Neurale Stammzellen durchaus in der Lage sind, gliale Zellen zu bilden. Bag-1 gilt auch als Modulator nukleärer Rezeptoren, wie dem Glucocorticoid-Rezeptor (GR). Die Kotransfektion der Bag-1 Isoformen mit GR-GFP, zeigte Änderungen des Expressionsmusters bei Bag-1L und Bag-1Lm, jedoch nicht bei Bag-1S und Bag-1Sm. Die Etablierung einer Methode zur in vivo Analyse von Glucocorticoid-Signalwegen in der Neuroneogenese von adulten Mäusen, war in ihren ersten Ansätzen erfolgreich, so dass diese nach einigen Optimierungen für weitere Analysen genutzt werden kann.
Aufklärung des Pathomechanismus bei der pmn-Mausmutante, einem Mausmodell für Motoneuronerkrankungen
(2007)
Die pmn-Maus dient als Modell für degenerative Motoneuronerkrankungen: Während heterozygote Mäuse klinisch unauffällig sind, entwickeln homozygote einige Anzeichen, wie man sie auch bei humanen Motoneuronerkrankungen findet. Ab der 2. postnatalen Woche weisen sie eine progrediente Schwäche der Hinterläufe auf. Innerhalb kurzer Zeit sind auch andere Muskelgruppen betroffen, was zwischen der 4. und 6. postnatalen Woche zum Tod durch Atemversagen führt. Verantwortlich für die Erkrankung der pmn-Mäuse ist eine Punktmutation im Tubulin-spezifischen Chaperon E (tbce) Gen, die zu einem Aminosäureaustausch an einer evolutionär konservierten Aminosäure im TBCE-Protein führt. TBCE wird ubiquitär exprimiert und spielt eine Rolle bei der Assemblierung der Mikrotubuli. Phänotypisch sind von der Mutation spezifisch Motoneurone betroffen. Nach der Herstellung und Charakterisierung eines Antiserums gegen TBCE war es möglich, nach Unterschieden zwischen pmn-mutierten und wildtypischen Motoneuronen hinsichtlich der Stabilität und der subzellulären Lokalisation des TBCE Proteins zu suchen. Western Blot Analysen mit Rückenmarkslysaten von vier Wochen alten pmn-Mäusen zeigen eine deutliche Reduktion der TBCE-Expression. Mittels Immunfluoreszenz waren in isolierten embryonalen Motoneuronen indes keine Unterschiede hinsichtlich der Expressionsstärke und der subzellulären Lokalisation festzustellen. Das TBCE-Protein wird überwiegend im Zellsoma exprimiert und befindet sich dort im Golgi-Apparat und an den Centrosomen, die als Generatoren der axonalen Mikrotubuli angesehen werden. Obwohl mittels Immunfluoreszenz zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede detektierbar sind, weisen die pmn-mutierten Motoneurone nach sieben Tagen in Kultur einige axonale Pathologien auf, wenn sie in Gegenwart des neurotrophen Faktors BDNF kultiviert werden: Das Längenwachstum der Axone ist deutlich reduziert und entlang der Axone finden sich zahlreiche axonale Schwellungen mit Proteinaggregaten. Elektronenmikroskopisch findet sich eine Reduktion der Mikrotubulianzahl im proximalen Axonabschnitt, während die medialen und distalen Teile eine unveränderte Anzahl an Mikrotubuli aufweisen. Parallel findet sich in allen Axonabschnitten der pmn-mutierten Motoneurone eine deutliche Zunahme an Neurofilamenten. Neben den morphologischen Veränderungen weisen die Motoneurone aus pmn-Mäusen zu diesem Zeitpunkt auch eine Störung im axonalen Transport der Mitochondrien auf, die in den Axonen saltatorisch und bidirektional entlang von Mikrotubuli transportiert werden, auf. So ist die Anzahl stationärer Mitochondrien in pmn-mutierten Motoneuronen signifikant erhöht, während die Anzahl an transportierten Mitochondrien und deren maximale Transportgeschwindigkeit reduziert ist. Die morphologischen Veränderungen und die Störungen im axonalen Transport können kompensiert werden, wenn die pmn-mutierten Motoneurone statt mit BDNF mit dem neurotrophen Faktor CNTF kultiviert werden. Die Effekte von CNTF auf das Längenwachstum der Axone ist STAT3 vermittelt, da pmn-mutierte Motoneurone mit einer STAT3-Defizienz keine Reaktion mehr auf die Gabe von CNTF zeigen. Da STAT3 direkt mit Stathmin interagieren kann und dessen destabilisierende Wirkung auf Mikrotubuli dadurch verhindert, wurde angenommen, dass die STAT3 vermittelten CNTF Effekte auf eine lokale Wirkung von STAT3 in Axonen zurückzuführen ist. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass die Herunterregulation der Stathmin Expression in pmn-mutierten Motoneuronen den gleichen Effekt auf das Längenwachstum zeigt, wie eine CNTF Gabe während der Kultivierung.
Der adoptive Transfer myelinspezifischer, enzephalithogener T-Lymphozyten führt bei Lewis-Ratten zu einer monophasisch verlaufenden Enzephalomyelitis (AT-EAE). Das Tiermodell AT-EAE ist gut geeignet, um die Transmigration von Lymphozyten über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ins Hirngewebe zu untersuchen. Der Einwanderung aktivierter Lymphozyten in das ZNS-Parenchym geht eine komplexe Kaskade von Zell-Zell-Interaktionen zwischen Lymphozyten und Endothel der BHS voraus. Die endothelialen Adhäsionsmoleküle Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) und Vascular Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) sind entscheidend an diesem Prozess beteiligt. Mit einer kürzlich entwickelten, ultraschallbasierte molekularen Bildgebung und Quantifizierung ist die sequentielle Messung der Moleküle ICAM-1 und VCAM-1 im Verlauf der AT-EAE am lebenden Tier möglich. Schon vor dem Einsetzen der ersten klinischen Symptomatik zeigte sich bei den Versuchstieren ein Anstieg der Expression der Zelladhäsionsmoleküle ICAM-1- und VCAM-1.Diese Expression persistierte unerwartet über das Maximum der klinischen Symptomatik hinaus und bis in die Phasen der frühen Remission. Immunhistochemische Färbungen von Gehirn und Rückenmark bestätigten diese Expressionskinetik in situ. Darüber hinaus konnte histologisch und durchflusszytometrisch eine Persistenz CD4-positiver Lymphozyten in der frühen Remissionphase nachgewiesen werden. Hier war vor allem ein Anstieg der CD4- und FoxP3- positiven regulatorischen T-Zellen in der CD4 Subpopulation festzustellen. Diesen Zellen wird eine wichtige regulatorische Bedeutung für die Beendigung von Entzündungsreaktionen zugeschrieben. Ein experimentellen Beleg dafür, dass regulatorische Zellen in den Phasen der Remission die selben Migrationswege wie proinflammatorische Zellen nutzen, ergab sich durch die Blockade von ICAM-1 mit hohen Dosen eines monoklonalen Antikörpers. Wurde dieser AK in der Progressionsphase der Erkrankung gegeben, resultierte dies in einer signifikanten Reduktion der klinischen Symptomatik. Im Gegensatz dazu führte die spätere Gabe des Antikörpers in der frühen Remission zu einer signifikanten Verschlechterung des Krankheitverlaufes. In Zusammenschau legen diese Ergebnisse die Hypothese nahe, dass Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 nicht nur an der Einwanderung pathogener proinflammatorischer Zellen entscheidend beteiligt sind, sondern dass sie auch die Einwanderung antiinflammorischer und regulatorischer Zellen in das ZNS ermöglichen, die für eine Abschwächung der Gewebsentzündung und Zerstörung wichtig sind. Therapeutische Intervention an der BHS sind auf dem Boden dieser Erkenntnisse wahrscheinlich stadienabhängig wirksam und könnten bei falschem Einsatz mehr schaden als nutzen. Molekulare Bildgebungstechniken, wie hier paradigmatisch für die. ultraschallbasierten SPAQ-Technologie gezeigt, werden deshalb in Zukunft für die Bestimmung der geeigneten Phase einer entzündlichen ZNS Erkrankung und damit den geeigneten Zeitpunkt für eine therapeutische Intervention großes Potential erlangen.
Die proximale spinale Muskelatrophie (SMA) stellt eine der häufigsten erblichen Ursachen für den Tod im Kindesalter dar. Die Patienten leiden unter symmetrischer, langsam progredienter Muskelschwäche und in schweren Fällen auch an sensiblen Ausfällen. Die neurodegenerative Erkrankung wird autosomal-rezessiv durch Deletion bzw. Mutationen des SMN1-Gens (survival motor neuron 1-Gens) auf Chromosom 5q13 vererbt. Das SMN-Protein wird ubiquitär exprimiert und findet sich in allen untersuchten Geweben in einem Multiproteinkomplex, dem sogenannten SMN-Komplex, der die Zusammenlagerung von spleißosomalen Komplexen koordiniert. Die Funktion solcher Komplexe ist für alle Zelltypen essentiell. Deshalb stellt sich die Frage, welcher Pathomechanismus für die Erkrankung SMA verantwortlich ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Überlebensraten der Smn–/–;SMN2-Motoneurone 14 Tage alter Mausembryonen gegenüber Smn+/+;SMN2-Motoneuronen (Kontrollen) nicht reduziert waren. Bei der morphologischen Untersuchung der Zellen zum gleichen Entwicklungszeitpunkt zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede. Die Axonlängen der Smn-defizienten Motoneurone waren gegenüber Kontrollen signifikant verringert. Das Dendritenwachstum war nicht beeinträchtigt. Die Untersuchung der Wachstumskegel ergab bei den Smn–/–;SMN2 Motoneuronen eine signifikante Verminderung der Fläche gegenüber Kontrollen. Weiterhin zeigten sich Defekte im Zytoskelett. In den Motoneuronen von Kontrolltieren fand sich eine Anreicherung von beta-Aktin in perinukleären Kompartimenten sowie besonders stark in den Wachstumskegeln. Die beta-Aktin-Anreicherung nahm im Verlauf des Axons zu. In Smn–/–;SMN2-Motoneuronen war keine Anreicherung im distalen Axon oder in den Wachstumskegeln detektierbar. Eine gleichartige Verteilungsstörung fand sich für das SMN-Interaktionsprotein hnRNP R (heterogenous nuclear ribonucleoprotein R) und, wie andere Arbeiten zeigen konnten, auch für die beta-Aktin-mRNA, die spezifisch an hnRNP R bindet. In gleicher Weise wurden auch Veränderungen in den sensorischen Neuronen aus den Hinterwurzelganglien 14 Tage alter Mausembryonen untersucht. Bei Smn–/–;SMN2-Mäusen war die Neuritenlänge sensorischer Neurone im Vergleich zur Kontrolle gering, jedoch signifikant verkürzt und die Fläche der Wachstumskegel hochsignifikant verringert. Im Smn–/–;SMN2 Mausmodell für eine schwere Form der SMA fanden sich in den sensorischen Nervenzellen im Vergleich zu den Motoneuronen geringer ausgeprägte, jedoch gleichartige Veränderungen, was auf einen ähnlichen Pathomechanismus in beiden Zelltypen hinweist.
Differenzielle Wirkungen neurotropher Faktoren auf das Axon-und Dendritenwachstum von Motoneuronen
(2008)
In der vorliegenden Dissertation wurde die subzelluläre Lokalisation der Rezeptoren für die neurotrophen Faktoren BDNF, CNTF und GDNF in primären embryonalen und adulten Motoneuronen erstmalig genau charakterisiert. Die Rezeptoruntereinheiten des BDNF und CNTF Rezeptors, TrkB, p-TrkB, gp130 und p-Stat3, sind im Perikaryon, in Dendriten, im Axon und an den Axonterminalen bzw. Wachstumskegeln von Motoneuronen lokalisiert. Dabei sind die nativen Formen (TrkB, gp130) im Axon überwiegend membranständig, die aktivierten Formen (p-TrkB, p-Stat3) überwiegend im Inneren des Axons lokalisiert. Demgegenüber sind die Rezeptoruntereinheiten des GDNF Rezeptors, Ret und p-Ret, besonders stark in den Dendriten exprimiert. Auch im Perikaryon und an der neuromuskulären Endplatte sind Ret und p-Ret lokalisiert, nicht jedoch im Axon. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das durch neurotrophe Faktoren bedingte Neuritenwachstum genau quantifiziert. Dabei wurde zwischen einer Stimulation des Axon- bzw. des Dendritenwachstums differenziert. Die mit GDNF behandelten Dendriten werden etwa doppelt so lang wie die Dendriten, der mit BDNF oder CNTF behandelten Motoneurone. GDNF ist somit ein potenter Stimulator des Dendritenwachstums bei isolierten primären Motoneuronen. Dieser Befund korreliert gut mit der starken Expression von Ret und p-Ret in den Dendriten. Des Weiteren wurde eine Analyse der Interaktion der neurotrophen Faktoren mit dem glutamatergen AMPA Rezeptor in Hinblick auf das Neuritenwachstum durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Interaktion zwischen neurotrophen Faktoren und dem AMPA Rezeptor besonders für das Dendritenwachstum von Bedeutung ist. Die klinische Bedeutung neurotropher Faktoren und deren Rezeptoren wird im dritten Teil der Arbeit dargestellt. Die pmn Maus ist ein Mausmodell für humane degenerative Erkrankungen des Motoneurons, wie der ALS und der SMA. Pmn Motoneurone, die mit BDNF oder GDNF kultiviert werden, weisen den charakteristischen axonalen Wachstumsdefekt der pmn Motoneurone auf und werden nur etwa halb so lang wie gesunde Kontrollmotoneurone. Bemerkenswerterweise führt die Behandlung der pmn Motoneurone mit CNTF zu einer kompletten Remission des axonalen Wachstumsdefekts, so dass die Axone eine normale Axonlänge erreichen. Auch die Anzahl der pathologischen axonalen Schwellungen werden in vitro durch CNTF stark reduziert. CNTF scheint demnach der interessanteste neurotrophe Faktor für eine Behandlung degenerativer Motoneuronerkrankungen zu sein.