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Proteine sind dynamische makromolekulare Systeme, die nativ in verschiedenen Konfor-mationen vorliegen. Besonders Proteine mit einer ausgeprägten intrinsischen Flexibilität stellen als biologische Zielstrukturen für das computergestützte strukturbasierte Wirkstoff-design auch heute noch eine große Herausforderung dar. Die vorliegende Arbeit thematisiert die computergestützte Identifizierung neuer Liganden mit inhibitorischer Aktivität für zwei strukturell sehr flexible Enzyme, die bei verschiedenen Krankheiten eine pathophysio-logische Rolle spielen. Ein Schwerpunkt lag in diesem Zusammenhang auf der Entwicklung virtueller Screeningverfahren, die es ermöglichten, die Flexibilität der Proteine adäquat zu berücksichtigen.
Der erste Teil der Arbeit beschreibt ein virtuelles Screeningverfahren für die Identifizierung von Liganden einer neuen, durch Molekulardynamik (MD) Simulationen generierten Proteinkonformation der Aldose Reduktase (AR), einem Enzym, das im Zusammenhang mit der Entstehung von Folgeerkrankungen bei Diabetes mellitus steht. Die angewandte Vorgehensweise zeigt Möglichkeiten auf, wie eine ausgeprägte Proteinflexibilität mit Hilfe computerbasierter Methoden im Rahmen eines virtuellen Screenings explizit berücksichtigt werden kann. Die Studie war auf der einen Seite hinsichtlich methodischer Aspekte von Interesse, da dadurch sowohl eine Beurteilung der Aussagekraft computergenerierter Proteinkonformationen, als auch eine Überprüfung der prinzipiellen Eignung MD-generierter Enzymkonformationen als Template für strukturbasierten Ligandendesignstudien, erfolgen konnte. Auf der anderen Seite war diese Studie aufgrund einer möglichen Erweiterung des bekannten Konformationsraumes der AR auch aus strukturbiologischer Sicht von Interesse.
Bei der Suche nach geeigneten Liganden in Moleküldatenbanken kommerziell erhältlicher Verbindungen wurde eine protein- und eine ligandbasierte Strategie verfolgt. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine vergleichende Strukturanalyse verschiedener AR-Ligand-Komplexstrukturen, um Informationen hinsichtlich experimentell aufgeklärter Bindemotive, Protein-Ligand-Interaktionen sowie bestehender struktureller Differenzen zwischen der MD-Konformation und anderen Bindetaschenkonformationen der AR zu sammeln. Anschließend wurde die Bindetasche der MD-generierten Proteinstruktur hinsichtlich günstiger Interaktionspunkte analysiert, um aus den Erkenntnissen Pharmako-phormodelle als Filter für die nachfolgenden virtuellen Datenbanksuchen zu entwickeln.
Als Ergänzung zum proteinbasierten Ansatz wurde eine ligandbasierte Strategie für die Identifizierung potenzieller Kandidatenmoleküle verfolgt. Dabei diente ein bekannter AR-Inhibitor als Templatstruktur, bei dem aufgrund zuvor durchgeführter Dockingexperimente die begründete Annahme bestand, dass dieser die Bindetaschenform der MD-Proteinkonfor-mation stabilisieren könnte. Hierbei wurde zunächst eine Moleküldatenbank aus kommerziell erhältlichen Verbindungen, die alle über eine bestimmte Substruktur als Ankergruppe verfügten, aufgebaut und anschließend durch Berechnung molekularer Ähnlichkeiten zu der Templatstruktur auf mögliche Kandidatenmoleküle durchsucht.
Die virtuell identifizierten Moleküle der beiden Ansätze wurden im Anschluss mit Hilfe von Dockingsimulationen in die Bindetasche der MD-generierten Proteinkonformation gedockt und die berechneten Bindeposen mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren bewertet. Im nächsten Schritt erfolgte eine Untersuchung der Selektivität der Kandidatenmoleküle anhand eines Cross-Dockingexperiments an verschiedenen Bindetaschenkonformationen der AR. Auf der Grundlage aller durch das virtuelle Screeningverfahren gesammelten Informationen wurde eine finale Molekülauswahl getroffen und sechs kommerziell verfügbare Moleküle für experimentelle Untersuchungen bezogen. Die experimentelle Bestimmung der Enzyminhibition wurde dabei von Kooperationspartnern mit Hilfe eines in vitro Assays untersucht. Aufgrund einer unzureichenden Löslichkeit von vier Substanzen unter den Assaybedingungen konnte lediglich das Inhibitionspotenzial von zwei Verbindungen untersucht werden. Eine der Verbindungen zeigte bemerkenswerterweise eine inhibitorische Aktivität im einstelligen mikromolaren Bereich. Eine finale Beurteilung, ob die Zielsetzung dieser Studie, eine neue computergenerierte Bindetaschenkonformation der AR experi-mentell zugänglich zu machen, durch die vorgeschlagenen Verbindungen erfüllt werden konnte, konnte zum Zeitpunkt der Anfertigung der Dissertation aufgrund ausstehender Kristallstrukturen der jeweiligen AR-Ligand-Komplexe nicht erfolgen und bleibt das Ziel zukünftiger Arbeiten.
Die Studie zeigte jedoch deutlich, dass nicht nur experimentell aufgeklärte Proteinstrukturen sondern auch die Nutzung von mit Hilfe computerbasierter Verfahren, wie z.B. mittels MD Simulationen, berechneter Proteinkonformationen als Templatstrukturen für die Identifi-zierung neuer Liganden hilfreich sein kann und daher deren Verwendung für diese Zielsetzung ihre Berechtigung hat.
Der zweite Teil der Arbeit handelt von der computergestützten Identifizierung nieder-molekularer Liganden einer neuen potenziellen Bindestelle der biologischen Zielstruktur Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren. Hsp70 spielt eine pathophysiologische Rolle bei verschiedenen Krebserkrankungen sowie diversen weiteren Erkrankungen, wie z.B. neurodegenerativen Erkrankungen und Infektions-krankheiten. Bei der neuen potenziellen Bindestelle, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit näher untersucht wurde, handelte es sich um das Interdomäneninterface, der Schnittstelle zwischen der Nukleotid- und Substratbindedomäne von Hsp70.
Zum Zeitpunkt der Arbeit waren keine Liganden dieser Proteinregion in der Literatur beschrieben, weshalb es zunächst galt, die Hypothese der Adressierbarkeit dieser Zielregion durch niedermolekulare Liganden zu verifizieren. Hierfür wurde ein virtuelles Screening durchgeführt, bei dem protein- sowie ligandbasierte Suchstrategien zum Einsatz kamen. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine Analyse der Hsp70 Tertiär-struktur auf potenziell vorhandene Ligandenbindestellen. Im Anschluss wurde das Interdomäneninterface auf günstige Interaktionspunkte für bestimmte Atomtypen und funktionelle Gruppen zukünftiger Liganden untersucht. Basierend auf diesen Informationen wurde ein Pharmakophormodell als Filter für nachfolgende virtuelle Datenbanksuchen entwickelt.
Bei dem ligandbasierten Ansatz fungierte der bekannte Hsp70-Ligand Apoptozol als Templatstruktur für die virtuelle Datenbanksuche, da die Ergebnisse eines vorab durchge-führten Cross-Dockingexperiments deutlich auf eine Bindung des Moleküls an das Interdomäneninterface hinwiesen. Diese Dockingstudie lieferte erste wertvolle Hinweise hinsichtlich der Bindestelle und potenzieller Bindemodi des Moleküls an Hsp70.
Im Anschluss an die virtuellen Datenbanksuchen wurden die identifizierten Kandidaten-moleküle hinsichtlich möglicher Bindemodi und Bindungsaffinitäten mittels Docking-simulationen in Verbindung mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren untersucht. Abschließend wurden neun ausgewählte Kandidatenmoleküle von kommerziellen Anbietern bezogen und mit Hilfe von in vitro Assays von Kooperationspartnern innerhalb der Klinischen Forschergruppe 216 auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber Multiplen Myelomzellen untersucht. Dabei konnte für fünf der neun getesteten Verbindungen bereits bei Konzentrationen im ein- bzw. zweistelligen mikromolaren Bereich eine Aktivität gemessen werden, was einer formalen Trefferquote von 56% entspricht. Weiterhin wurde und wird in Folgearbeiten von Kooperationspartnern versucht, eine Bindung der ausgewählten Kandidatenmoleküle an Hsp70 näher zu charakterisieren und sowohl am separierten Protein, als auch in der Targetzelle nachzuweisen.
Darüber hinaus wurde zusätzlich ein fragmentbasierter Ansatz, basierend auf einer bestimmten Substruktur, die als eine Art Ankergruppe fungieren sollte, verfolgt. Dabei diente bei der virtuellen Suche in Moleküldatenbanken kommerzieller Anbieter ein Molekülfragment als Suchanfrage. Aus dem identifizierten Molekülsatz wurden Verbindungen unterschied-lichster struktureller Klassen für nachfolgende Dockingexperimente ausgewählt. Die berechneten Bindeposen wurden einem Re-Scoringverfahren für eine zusätzliche Abschätzung der Bindungsaffinität unterzogen. Schließlich wurden die fünf vielver-sprechendsten Verbindungen für nachfolgende experimentelle Untersuchungen kommerziell bezogen. Die Ergebnisse der nachfolgenden röntgenkristallographischen Aufklärung der Protein-Ligand-Komplexe lagen bei der Anfertigung der vorliegenden Dissertation noch nicht abschließend vor und sind Bestandteil aktueller Forschungarbeiten.
Mit den durchgeführten virtuellen Screeningverfahren konnten erstmals potenzielle Liganden des Hsp70-Interdomäneninterfaces als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren identifiziert werden. Weiterhin können die identifizierten, zytotoxisch aktiven Verbindungen als Leitstrukturen zukünftiger Inhibitordesignstudien dienen, mit dem Ziel sowohl die Zytotoxizität dieser Moleküle zu optimieren, als auch Struktur-Wirkungsbeziehungen für die Entwicklung von Inhibitoren mit verbesserten biologischen Aktivitätsprofilen abzuleiten.
Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der computerbasierten Charakterisierung der Proteinflexibilität von Hsp70 mit Hilfe von MD Simulationen. In diesem Zusammenhang erfolgte eine Untersuchung intrinsischer Proteinbewegungen sowie des Konformations-raumes anhand von verschiedenen Hsp70-Enzymstrukturen. Die durchgeführten MD Simulationen waren zum Zeitpunkt der Arbeit die ersten Untersuchungen dieser Art, die nicht nur an einer einzelnen Domäne, sondern an ganzen Zweidomänenstrukturen von Hsp70 erfolgten. Die generierten Trajektorien bestätigten die überdurchschnittlich hohe Flexibilität der Zielstruktur Hsp70. Die im Rahmen der Studie identifizierten, zum Zeitpunkt der Arbeit noch nicht beschriebenen Proteinkonformere erweiterten das Spektrum der bekannten Hsp70-Proteinkonformationen erheblich und lieferten mögliche Enzymkonformationen, die als Templatstrukturen für zukünftige strukturbasierte Wirkstoffdesignstudien dienen können. Darüber hinaus stützten die Beobachtungen die Hypothese der prinzipiellen Eignung des Interdomäneninterfaces von Hsp70 als eine Bindestelle für neue Inhibitoren. Auf der Grundlage der gewonnenen Informationen war es weiterhin möglich, eine erste Hypothese hinsichtlich eines potenziellen inhibitorischen Wirkmechanismus der Liganden des Interdomäneninterfaces zu formulieren.
Abschließend lässt sich festhalten, dass durch die vorliegende Arbeit viele neue strukturbiologische Erkenntnisse über Hsp70 gewonnen wurden. Dennoch besteht weiterer Forschungsbedarf, um die Strukturbiologie von Hsp70 umfassend aufzuklären. Möglicher-weise können in zukünftigen Studien Enzymstrukturen aufgeklärt werden, die die Existenz der in silico erzeugten und in der Arbeit beschriebenen Proteinkonformere bestätigen.
Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der technischen Qualität von Wurzelkanalfüllungen an simulierten gekrümmten Kanälen in Abhängigkeit von der Wurzelfülltechnik. Im Zentrum stand die Frage, ob die laterale Verdichtung besser mit ISO-genormten Spreadern / Hilfsspitzen oder Spreadern / Hilfsspitzen größerer Konizität (ABCD-Kodierung) erfolgen soll.
Material und Methoden
Es wurden insgesamt 40 Simulationsmodelle mit gekrümmten Wurzelkanal mit Mtwo® NiTi maschinell aufbereitet. Die Wurzelkanalfüllungen erfolgten in Gruppe 1 mittels kalt-lateraler Verdichtung unter Verwendung von Spreadern und Hilfsspitzen der ISO-Norm; in Gruppe 2 mittels kalt-lateraler Verdichtung unter Verwendung von Spreadern und Hilfsspitzen der ABCD-Kodierung; in Gruppe 3 mittels Einstifttechnik und in Gruppe 4 mit einem trägerbasiertem System. Zur Beurteilung der technischen Qualität der Wurzelkanalfüllungen wurden Schliffbilder des gesamten Kanalverlaufs hinsichtlich der prozentualen Flächenanteile von Guttapercha [PGFA], Sealer [PSFA] sowie Defekten [PDFA] ausgewertet. Des Weiteren wurden die maximale Eindringtiefe der Hilfsspitzen, die Defekthäufigkeit sowie die Defektart erfasst. Die erhobenen Daten wurden mittels parameterfreier Tests (Kruskal-Wallis-Test, Mann-Whitney-U-Test) sowie Chi-Quadrat Test hinsichtlich statistischer Signifikanz überprüft.
Ergebnisse
Mit der trägerbasierten Technik (Gruppe 4) wurden im koronalen und mittleren Kanaldrittel der größte PGFA sowie niedrigste PSFA beobachtet (p<0.001). Die geringsten PGFA wurden mit beiden lateralen Verdichtungsmethoden erzielt. Dabei bestehen zwischen Gruppe 1 und 2 keine statistisch signifikanten Unterschiede (nur vereinzelte Ausnahmen im mittleren und koronalen Kanaldrittel).
Der PDFA zeigte über den gesamten Kanalverlauf nur vereinzelt größere Defektflächenanteile in Gruppe 1.
Die ersten beiden Hilfsspitzen penetrierten in Gruppe 1 tiefer als in Gruppe 2 (1.HS p<0.01; 2.HS p<0.001). Die häufigsten Defekte wurden quantitativ in Gruppe 1 gefolgt von der Gruppe 3, 2 und 4 beobachtet (p<0.001). In Bezug auf die Defektart traten in allen Gruppen besonders häufig Defekte auf, die sich über mehrere Schliffebenen verteilten.
Schlussfolgerung
Insbesondere im Hinblick auf die quantitativ geringere Defektanzahl scheint die laterale Verdichtung mit Spreadern und Hilfsspitzen nach ABCD-Kodierung effektiver zu sein als die laterale Verdichtung mit Spreadern und Hilfsspitzen nach ISO-Norm.
In Bezug auf den PGFA und PFSA lieferten in dieser Arbeit die trägerbasierte Technik und die Zentralstifttechnik bessere Ergebnisse als die beiden lateralen Verdichtungsmethoden. Unter Erwartung eines nach abschließender Präparation nahezu runden Kanalquerschnitts kann die Zentralstifttechnik mit Mtwo® Guttapercha (VDW) sowie das trägerbasierte Obturationsystem (VDW) eine sehr gute Alternative darstellen.
This thesis deals with value sets, i.e. the question of what the set of values that a set of functions can take in a prescribed point looks like.
Interest in such problems has been around for a long time; a first answer was given by the Schwarz lemma in the 19th century, and soon various refinements were proven.
Since the 1930s, a powerful method for solving such problems has been developed, namely Loewner theory. We make extensive use of this tool, as well as variation methods which go back to Schiffer to examine the following questions:
We describe the set of values a schlicht normalised function on the unit disc with prescribed derivative at the origin can take by applying Pontryagin's maximum principle to the radial Loewner equation.
We then determine the value ranges for the set of holomorphic, normalised, and bounded functions that have only real coefficients in their power series expansion around 0, and for the smaller set of functions which are additionally typically real.
Furthermore, we describe the values a univalent self-mapping of the upper half-plane with hydrodynamical normalization which is symmetric with respect to the imaginary axis can take.
Lastly, we give a necessary condition for a schlicht bounded function f on the unit disc to have extremal derivative in a point z where its value f(z) is fixed by using variation methods.
> In oxidischen Heterostrukturen kann es zur Ausbildung unerwarteter elektronischer und magnetischer Phasen kommen. Ein bekanntes Beispiel ist das Heterostruktursystem LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\), an dessen Grenzfläche ein zweidimensionalen Elektronensystem (2DES) entsteht, sofern die LaAlO\(_3\)-Filmdicke einen kritischen Wert von mindestens vier Einheitszellen aufweist. Ähnliches Verhalten konnte an der Heterostruktur γ-Al\(_2\)O\(_3\)/SrTiO\(_3\) beobachtet werden. Die gemessenen Elektronenbeweglichkeiten und Flächenladungsträgerdichten übertreffen hierbei die in LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\) um mehr als eine Größenordnung. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung sowie der Analyse dieser beiden Heterostruktursysteme. Die Hauptaspekte sind dabei die Untersuchung der physikalischen Eigenschaften an der Grenzfläche sowie das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen.
>
> Im Hinblick auf das Wachstum wird demonstriert, dass die für LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\) etablierte Wachstumsroutine der gepulsten Laserablation sowie die zur Überwachung des Schichtwachstums verwendete Methode der Beugung hochenergetischer Elektronen in Reflexion (RHEED) für das γ-Al\(_2\)O\(_3\)-Wachstum modifiziert werden müssen. So kann gezeigt werden, dass durch eine geeignete Variation der Wachstumsgeometrie die Resonanz von Oberflächenwellen, welche im Falle des γ-Al\(_2\)O\(_3\)-Wachstums die Beobachtung von RHEED-Oszillationen erschwert, vermieden werden kann und somit auch hier die Überwachung des heteroepitaktischen Schichtwachstum mittels Elektronenbeugung möglich wird.
>
> Für die Ausbildung des 2DES in LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\) wird das Szenario der elektronischen Rekonstruktion als mögliche Ursache diskutiert, wonach das divergierende Potential innerhalb des polaren LaAlO\(_3\)-Films durch einen Ladungstransfer von der Probenoberfläche in die obersten Atomlagen des unpolaren SrTiO\(_3\)-Substrats kompensiert wird. Zudem sind die Eigenschaften der Heterostruktur von den Wachstumsparametern abhängig. So wird in der vorliegenden Arbeit eine deutliche Zunahme der Ladungsträgerkonzentration und der räumliche Ausdehnung der leitfähigen Schicht insbesondere für Proben, welche bei sehr niedrigen Sauerstoffhintergrunddrücken gewachsen wurden, gezeigt und auf die Erzeugung von Sauerstofffehlstellen innerhalb des Substrats zurückgeführt. Darüber hinaus wird erstmalig die Herstellung atomar scharfer Grenzflächen mit sehr geringer Defektdichte selbst bei sehr niedrigen Wachstumsdrücken belegt und erstmals auch direkt elektronenmikroskopisch nachgewiesen. Es werden allenfalls vernachlässigbare Effekte der Sauerstoffkonzentration auf charakteristische, strukturelle Merkmale der Probe beobachtet. Desweiteren zeigt diese Arbeit erstmalig eine von den Wachstumsbedingungen abhängige Gitterverzerrung des Films, was in Übereinstimmung mit Rechnungen auf Basis der Dichtefunktionaltheorie einen Hinweis auf ein komplexes Zusammenspiel von elektronischer Rekonstruktion, Sauerstofffehlstellen an der LaAlO\(_3\)-Oberfläche und einer Verzerrung der Kristallstruktur als Ursache für die Entstehung des 2DES in LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\) liefert.
>
> Neben der mikroskopischen Analyse des 2DES in LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\) wird die elektronische Struktur dieses Systems zudem mithilfe der resonanten inelastischen Röntgenstreuung charakterisiert. Die vorliegende Dissertation zeigt dabei, neben dem Nachweis lokalisierter Ladungsträger vor dem Einsetzen metallischen Verhaltens ab einer kritischen Schichtdicke von vier Einheitszellen, die Existenz eines Raman- und eines fluoreszenzartigen Signals in Abhängigkeit der verwendeten Photonenenergie, was wiederum auf einen unterschiedlichen elektronischen Charakter im Zwischenzustand zurückgeführt werden kann. Gestützt wird diese Interpretation durch vergleichbare Messungen an γ- Al\(_2\)O\(_3\)/SrTiO\(_3\). In diesem System finden sich zudem ebenfalls Anzeichen lokalisierter Ladungsträger unterhalb der kritischen Schichtdicke für metallisches Verhalten, was ein Hinweis auf einen mit LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\) vergleichbaren Grundzustand sein könnte.
>
> Weitere Messungen mithilfe der resonanten Photoelektronenspektroskopie ermöglichen zudem eine direkte Beobachtung und Analyse der Ti 3d-Valenzelektronen. Messungen an LaAlO\(_3\)/SrTiO\(_3\) und γ-Al\(_2\)O\(_3\)/SrTiO\(_3\) liefern dabei Hinweise auf verschiedene elektronische Ti 3d-artige Zustände. Diese werden zum einen den mobilen Ladungsträgern des 2DES zugeschrieben, zum anderen als lokalisierte Elektronen in der Nähe von Sauerstofffehlstellen identifiziert. Eine Analyse des Resonanzverhaltens sowie der spektralen Form der beobachteten Signale zeigt quantitative Unterschiede, was auf einen unterschiedlichen treibenden Mechanismus in beiden Systemen hindeutet und im Hin- blick auf den Einfluss von Sauerstofffehlstellen auf das System diskutiert wird. Zudem zeigen impulsaufgelöste Messungen der Zustände am chemischen Potential eine unterschiedliche Intensitätsverteilung im k -Raum. Dies wird im Zusammenhang mit Matrixelementeffekten diskutiert und kann vermutlich auf Photoelektronendiffraktion bedingt durch die unterschiedliche Kristallstruktur des Filmmaterials, zurückgeführt werden.
Die vorliegende Arbeit untesucht die Darstellung tumoröser und entzündlicher muskuloskelettaler Läsionen mit der diffusionsgewichteten MRT-Bildgebung bei Kindern und Jugendlichen. Es sollten die Machbarkeit und die Zuverlässigkeit der Methode in der klinischen Routinebildgebung überprüft werden. Zusätzlich untersuchten wir den Einsatz von ADC-Werten zur Differenzierung von malignen und benignen Tumoren sowie bei inflammatorischen Knochen- und Weichteilbefunden. Wie die klassische MRT, ist die diffusionsgewichtete Bildgebung nicht-invasiv: da der
Bildkontrast allein mittels magnetischer Feldgradienten erzielt wird, erfordert sie weder eine Injektion von Kontrastmitteln, noch den Einsatz von ionisierender Strahlung. Sie garantiert eine schnelle Aquisitionstechink um Artefakte zu begrenzen und die Untersuchungen kindergerechter zu
gestalten. Die von uns erfassten Daten wurden in zwei unterschiedlichen Studien aufgeteilt. Die Erste Studie erfasst Ergebnisse bzgl. der Detektion und Dignitätsabschätzung kinderlicher muskuloskelettaler Tumoren mittels diffusionsgewichteten MRT Bilder. Das zweite Forschungsprojekt, befasst sich mit dem erstmaligen Einsatz der diffusionsgewichteten MRT zur Identifikation und Differenzierung von Knochenmarködem, Weichteilödem und Synovitis bei
pädiatrischen Patienten.
Transkraniale Gleichstromstimulation (tDCS) stellt eine neue Therapieoption für Patienten mit neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen dar. tDCS ist eine nichtinvasive Methode, mit der das Membranpotential von Nervenzellen verändert wird. Eine Depolarisation führt zu einer Erhöhung des Potentials, eine Hyperpolarisation bewirkt eine Senkung. Diesen neuromodulatorischen Effekt hat man sich in der vorliegenden Arbeit zunutze gemacht.
Im Versuchsaufbau wurde die Modulation von „sustained fear“ durch tDCS getestet. Das angewandte Paradigma ist nach dem Prinzip des NPU-Tests von Grillon aufgebaut. Mithilfe von vorhersehbaren und unvorhersehbaren aversiven Reizen (menschlicher Schrei) ist eine Einschätzung von kurz- („phasic“) und langanhaltenden („sustained“) Angstreaktionen möglich. Der Startle Reflex wurde zur Erfassung dieses Angstzustands aufgezeichnet. Gesunde Probanden (n=74) erfuhren eine 20-minütige tDCS Stimulation mit einer Stromstärke von 1 mA bei einer Elektrodengröße von 35 cm². Es ergab sich somit eine Stromdichte von 0,0286 mA/cm².
Es konnte ein signifikanter Effekt von tDCS auf „sustained fear“ nachgewiesen werden. Die neuromodulatorische Wirkung stellte sich bei anodaler Stimulation durch veränderte Startle Statistiken im Vergleich zur Sham Kontrollgruppe dar. „Phasic fear“ zeigte keine nachweisbare Wirkung der Gleichstromstimulation.
Gegenstand der Arbeit war außerdem die Untersuchung des Paradigmas zur Analyse von „phasic“ und „sustained fear“ auf subjektiver und psychophysiologischer Ebene. Mithilfe von Startle Daten und dreier spezieller Fragebögen war dies möglich (STAI X1, PANAS, SAM).
Die Startle Daten bewiesen eine Einflussnahme der Bedingungen (vorhersehbar, unvorhersehbar, neutral). Zudem war der Reflex davon abhängig, ob den Probanden eine Vorwarnung angezeigt wurde (ITI, Cue). Eine Vorankündigung der aversiven Reize bewirkte eine erhöhte Anspannung, weshalb die Startle Reaktion bei der vorhersehbaren Bedingung am stärksten ausfiel. Ohne Vorwarnung (ITI) war die durchschnittliche Reaktion auf einen unvorhersehbaren Schrei am größten. Nicht angekündigte Stimuli lösten eine starke Stressreaktion aus, woraufhin eine anhaltende Alarmbereitschaft bei den Probanden entstand. „Sustained fear“ ergab sich aus den unvorhersehbaren Bedingungen mit und ohne Warnhinweise (ITI U-Cue U).
Nach subjektiver Einschätzung der Versuchsteilnehmer/-innen bestätigte der STAI X1 und der PANAS einen Anstieg der emotionalen Anspannung durch das Paradigma. Der psychologische Einfluss des Paradigmas spiegelte sich auch im Rating des SAM-Tests wider. Vor allem der Effekt vorhersehbarer und unvorhersehbarer Ereignisse ergab übereinstimmend signifikante Werte, analog zu den Startle Daten.
Die statistische Auswertung zeigt Erfolg versprechende Ansätze in Bezug auf den Einfluss der Gleichstromstimulation auf das Angstverhalten. Durch den Versuchsaufbau einer plazebokontrollierten, randomisierten Doppelblindstudie kann von sehr verlässlichen Ergebnissen mit großer Aussagekraft ausgegangen werden.
Die nachgewiesene tDCS Wirkung gilt es nun anhand weiterführender Studien genauer zu untersuchen. Variable Parameter wie Stromintensität, Stimulationsdauer, Elektrodengröße und -position, aber auch interindividuelle Aspekte wie Alter, Geschlecht oder genetische Unterschiede müssen in Vergleichsuntersuchungen möglicherweise mit einem größeren Probandenkollektiv überprüft werden. Darüber hinaus wurde die Studie zunächst an gesunden Probanden getestet. Für eine Anwendung von tDCS bei Angststörungen müssen gesondert Versuche durchgeführt werden.
Die Daten liefern einen wichtigen Beitrag zur tDCS Forschung und haben weitreichende Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten im klinischen Alltag.
A large fraction of human tumors exhibits aberrant expression of the oncoprotein MYC. As a transcription factor regulating various cellular processes, MYC is also crucially involved in normal development. Direct targeting of MYC has been a major challenge for molecular cancer drug discovery. The proof of principle that its inhibition is nevertheless feasible came from in vivo studies using a dominant-negative allele of MYC termed OmoMYC. Systemic expression of OmoMYC triggered long-term tumor regression with mild and fully reversible side effects on normal tissues.
In this study, OmoMYC’s mode of action was investigated combining methods of structural biology and functional genomics to elucidate how it is able to preferentially affect oncogenic functions of MYC.
The crystal structure of the OmoMYC homodimer, both in the free and the E-box-bound state, was determined, which revealed that OmoMYC forms a stable homodimer, and as such, recognizes DNA via the same base-specific DNA contacts as the MYC/MAX heterodimer. OmoMYC binds DNA with an equally high affinity as MYC/MAX complexes. RNA-sequencing showed that OmoMYC blunts both MYC-dependent transcriptional activation and repression. Genome-wide DNA-binding studies using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing revealed that OmoMYC competes with MYC/MAX complexes on chromatin, thereby reducing their occupancy at consensus DNA binding sites. The most prominent decrease in MYC binding was seen at low-affinity promoters, which were invaded by MYC at oncogenic levels. Strikingly, gene set enrichment analyses using OmoMYC-regulated genes enabled the identification of tumor subgroups with high MYC levels in multiple tumor entities. Together with a targeted shRNA screen, this identified novel targets for the eradication of MYC-driven tumors, such as ATAD3A, BOP1, and ADRM1.
In summary, the findings suggest that OmoMYC specifically inhibits tumor cell growth by attenuating the expression of rate-limiting proteins in cellular processes that respond to elevated levels of MYC protein using a DNA-competitive mechanism. This opens up novel strategies to target oncogenic MYC functions for tumor therapy.
Neben Infektionen und Graft-versus-Host-Reaktionen nach allogener Stammzelltransplantation, stellen das Rezidiv der Grunderkrankungen und die Transplantatabstoßung die schwerwiegendsten Probleme bei diesem Patientenklientel dar. Um jene frühzeitig zu erkennen, werden Chimärismusanalysen eingesetzt, mit deren Hilfe das Auftauchen kleinster Mengen an Empfängerknochenmarkszellen im peripheren Blut nachgewiesen werden können.
Hierfür stehen verschiedene Möglichkeiten mit unterschiedlichen Sensitivitäten und Anwendungsbereichen zur Verfügung, wie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), die Amplifikation von short tandem repeats (STR) mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und die allelspezifische quantitative Real-time-PCR (qRT-PCR) mittels TaqMan, um die es in dieser Arbeit geht.
Mit Hilfe von speziellen Zielsequenzen auf unterschiedlichen Allelen, die Alizadeh et al. 2002 veröffentlichten, kann in der qRT-PCR bereits eine von 1000 Zellen nachgewiesen werden und somit zu einem frühen Zeitpunkt ein mögliches Rezidiv oder eine Abstoßung erkannt werden.
In dieser Arbeit wurden für die beschriebenen Allele und das SRY-Gen Standardreihen mit unterschiedlichen Konzentrationsstufen erstellt, mit Hilfe derer man die Ergebnisse der PCR aus Patientenproben einordnen und den Chimärismus berechnen konnte. Eine zusätzliche Kalibrierung der Proben wurde mit Standardreihen vorbestimmter Konzentrationsstufen des Housekeeping-Gens HCK durchgeführt, das auch bei der Auswertung der Patientenproben zum Einsatz kam.
Somit war es im Rahmen der Etablierung der PCR an der Uniklinik Würzburg möglich, in dieser Arbeit 395 Proben zu bestimmen, von denen 127 Proben von 26 Patienten ausgewertet und mit extern ermittelten STR-PCR-Ergebnissen verglichen werden konnten.
Die hieraus gewonnenen Daten wurden mit den von Alizadehet al.[59] veröffentlichten Daten verglichen bezüglich der Anwendbarkeit der allelspezifischen PCR auf das Patientenkollektiv der Uniklinik Würzburg und der Auswertung ihrer Sensitivität sowie klinischen Verwendbarkeit.
50
Um die ermittelten Chimärismen in einen klinischen Zusammenhang zu stellen, erfolgte die Zuordnung zu vier Gruppen mit verschiedenen Prozentspannen, bei denen unterschiedliche Szenarien in der klinischen Bewertung durchgespielt wurden.
Die Schwächen der etablierten PCR bestanden vor allem darin, dass 12,5% der Proben dieser Methode nicht zugänglich waren und angenommen werden muss, dass der Assay z.T. zu sensitiv war. Gerade in einem Bereich von > 5%igen Chimärismen stimmten die erhobenen Daten nicht mehr mit den Kontrollen überein, sondern gaben möglicherweise falsch hohe Chimärismen an.
Fehlende prospektive Daten machten es nicht möglich, in der Arbeit unstimmige Werte durch Beobachtung des weiteren klinischen Verlaufs auf ihre Richtigkeit zu prüfen.
Für die weitere Bewertung des Assays wäre es wichtig, dies in zukünftige Untersuchungen mit einzubeziehen.
Anxiety disorders (AD) are common, disabling mental disorders, which constitute the most prevalent mental health condition conveying a high individual and socioeconomic burden. Social anxiety disorder (SAD), i.e. fear in social situations particularly when subjectively scrutinized by others, is the second most common anxiety disorder with a life time prevalence of 10%. Panic disorder (PD) has a life time prevalence of 2-5% and is characterized by recurrent and abrupt surges of intense fear and anticipatory anxiety, i.e. panic attacks, occurring suddenly and unexpected without an apparent cue.
In recent years, psychiatric research increasingly focused on epigenetic mechanisms such as DNA methylation as a possible solution for the problem of the so-called “hidden heritability”, which conceptualizes the fact that the genetic risk variants identified so far only explain a small part of the estimated heritability of mental disorders.
In the first part of this thesis, oxytocin receptor (OXTR) gene methylation was investigated regarding its role in the pathogenesis of social anxiety disorder. In summary, OXTR methylation patterns were implicated in different phenotypes of social anxiety disorder on a categorical, neuropsychological, neuroendocrinological as well as on a neural network level. The results point towards a multilevel role of OXTR gene hypomethylation particularly at one CpG site (CpG3, Chr3: 8 809 437) within the protein coding region of the gene in SAD.
The second part of the thesis investigated monoamine oxidase A (MAOA) gene methylation regarding its role in the pathogenesis of panic disorder as well as – applying a psychotherapy-epigenetic approach – its dynamic regulation during the course of cognitive behavioural therapy (CBT) in PD patients. First, MAOA hypomethylation was shown to be associated with panic disorder as well as with panic disorder severity. Second, in patients responding to treatment MAOA hypomethylation was shown to be reversible up to the level of methylation in healthy controls after the course of CBT. This increase in MAOA methylation along with successful psychotherapeutic treatment was furthermore shown to be associated with symptom improvement regarding agoraphobic avoidance in an independent replication sample of non-medicated patients with PD.
Taken together, in the future the presently identified epigenetic patterns might contribute to establishing targeted preventive interventions and personalized treatment options for social anxiety disorder or panic disorder, respectively.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Nebenläufigkeit, Konsistenz und Latenz in asynchronen
Interaktiven Echtzeitsystemen durch die Techniken des Profilings und des Model
Checkings untersucht. Zu Beginn wird erläutert, warum das asynchrone Modell das vielversprechendste
für die Nebenläufigkeit in einem Interaktiven Echtzeitsystem ist. Hierzu
wird ein Vergleich zu anderen Modellen gezogen. Darüber hinaus wird ein detaillierter
Vergleich von Synchronisationstechnologien, welche die Grundlage für Konsistenz
schaffen, durchgeführt. Auf der Grundlage dieser beiden Vergleiche und der Betrachtung
anderer Systeme wird ein Synchronisationskonzept entwickelt.
Auf dieser Basis wird die Nebenläufigkeit, Konsistenz und Latenz mit zwei Verfahren
untersucht. Die erste Technik ist das Profiling, wobei einige neue Darstellungsformen von
gemessenen Daten entwickelt werden. Diese neu entwickelten Darstellungsformen werden
in der Implementierung eines Profilers verwendet. Als zweite Technik wird das Model
Checking analysiert, welches bisher noch nicht im Kontext von Interaktiven Echtzeitsystemen
verwendet wurde. Model Checking dient dazu, die Verhaltensweise eines Interaktiven
Echtzeitsystems vorherzusagen. Diese Vorhersagen werden mit den Messungen aus
dem Profiler verglichen.