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Measles Virus Glycoprotein-Based Lentiviral Targeting Vectors That Avoid Neutralizing Antibodies
(2012)
Lentiviral vectors (LVs) are potent gene transfer vehicles frequently applied in research and recently also in clinical trials. Retargeting LV entry to cell types of interest is a key issue to improve gene transfer safety and efficacy. Recently, we have developed a targeting method for LVs by incorporating engineered measles virus (MV) glycoproteins, the hemagglutinin (H), responsible for receptor recognition, and the fusion protein into their envelope. The H protein displays a single-chain antibody (scFv) specific for the target receptor and is ablated for recognition of the MV receptors CD46 and SLAM by point mutations in its ectodomain. A potential hindrance to systemic administration in humans is pre-existing MV-specific immunity due to vaccination or natural infection. We compared transduction of targeting vectors and non-targeting vectors pseudotyped with MV glycoproteins unmodified in their ectodomains (MV-LV) in presence of \(\alpha\)-MV antibody-positive human plasma. At plasma dilution 1: 160 MV-LV was almost completely neutralized, whereas targeting vectors showed relative transduction efficiencies from 60% to 90%. Furthermore, at plasma dilution 1: 80 an at least 4-times higher multiplicity of infection (MOI) of MV-LV had to be applied to obtain similar transduction efficiencies as with targeting vectors. Also when the vectors were normalized to their p24 values, targeting vectors showed partial protection against \(\alpha\)-MV antibodies in human plasma. Furthermore, the monoclonal neutralizing antibody K71 with a putative epitope close to the receptor binding sites of H, did not neutralize the targeting vectors, but did neutralize MV-LV. The observed escape from neutralization may be due to the point mutations in the H ectodomain that might have destroyed antibody binding sites. Furthermore, scFv mediated cell entry via the target receptor may proceed in presence of a-MV antibodies interfering with entry via the natural MV receptors. These results are promising for in vivo applications of targeting vectors in humans.
Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus, das im Menschen und im Nagermodell zu akuten und subakuten Enzephalitiden führen kann. Es wurde beschrieben, dass bestimmte Antikörperescape-Mutanten des MV neurovirulent, andere nicht neurovirulent sind (Liebert et al., 1994). Mit Hilfe von rekombinanten Masernviren, konnte ich diejenigen Aminosäuren charakterisieren, die einerseits für die Bindung monoklonaler, neutralisierender anti-MV-H-Antikörper (K29, K71, Nc32 und L77) und andererseits für die Neurovirulenz verantwortlich sind. Bei den rekombinanten MV wurde das von Duprex et al. (1999) als Neurovirulenz vermittelnd beschriebene H-Gen des nagerhirnadaptierten neurovirulenten CAM/RB-Stammes in das Grundgerüst des nicht neurovirulenten Edtag (molekularer Klon des Vakzinestammes Edm) kloniert. Über gerichtete Mutagenese wurden die jeweiligen Mutationen in dieses CAM/RB H-Gen eingefügt. Mittels der FACS-Analyse konnten die Aminosäureänderungen identifiziert werden, die für die Bindung der jeweiligen Antikörper verantwortlich sind. Sie befinden sich nach einem Strukturmodell der H-Proteine (Langedijk et al., 1997) im Membran-distalen Teil, den so genannten Propellern. Im Einzelnen sind folgende Aminosäureänderungen im Hämagglutinin-Protein für den Escape verantwortlich: L77 – 377 Arg -> Gln und 378 Met -> Lys; Nc32 – 388 Gly -> Ser; K71 – 492 Glu -> Lys und 550 Ser -> Pro; K29 – 535 Glu -> Gly. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die beiden Aminosäureveränderungen an den Positionen 195 und 200 gemeinsam für die Neurovirulenz verantwortlich sind und nicht assoziiert sind mit den Mutationen für den Antikörperescape. Der Aminosäureaustausch an Position 200 bei neurovirulenten Viren führt zum Verlust einer benutzten Glykosylierungsstelle. Diese Mutation ist jedoch nicht alleine für das unterschiedliche Neurovirulenzverhalten der Viren verantwortlich, sondern es muss gleichzeitig der Austausch an Position 195 vorhanden sein, der eine positive Ladung im H-Molekül entfernt. Diese beiden Mutationen sind nach dem Strukturmodell nach Langedijk im Stamm2-Bereich angesiedelt. Sind im H-Protein an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Gly und Ser vorhanden, so findet im Gehirn neugeborener Lewis-Ratten eine verstärkte Virusvermehrung und Ausbreitung statt, die die akute Enzephalitis mit Expression typischer proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat. Werden an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Arg und Asn exprimiert, so ist der Verlauf der Infektion inapparent. In dieser Arbeit wurde auch ein Zellkultursystem gemischter Hirnzellen neugeborener Lewis-Ratten etabliert, das die Unterschiede der Virusausbreitung in vivo reflektiert und mit dem weitere Untersuchungen zum Mechanismus der Neurovirulenz durchgeführt werden könnten. Anhand der durchgeführten Untersuchungen mit Ratten des CD46 transgenen Lewis-Modells konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit des Rezeptors CD46 das Virulenzverhalten der getesteten Viren nicht beeinflusst. Weder mit dem Vakzinestamm Edm noch mit einem nicht an Nager adaptierten Wildtypstamm, konnte nach intracerebraler Injektion eine akute Enzephalitis induziert werden. Die Untersuchungen zeigen, dass die Neurovirulenz des an Nager-adaptierte MV-Stammes CAM/RB essentiell von den Aminosäuren Gly und Ser an Position 195 und 200 im H-Protein abhängt und nicht durch die transgene Expression zellulärer Rezeptoren für MV vermittelt werden kann.