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- Center for Computational and Theoretical Biology (CCTB), Universität Würzburg (1)
- Chemical Biology Laboratory, National Cancer Institue, Frederick (USA) (1)
- Fraunhofer IGB - Institutsteil Würzburg Translationszentrum Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Chemie, Brooklyn College, City University of New York, Brooklyn (1)
- Lehrstuhl für Physiologische Chemie (1)
- Lehrstuhl für Translationale Onkologie (1)
- Siemens Corporate Technology, Erlangen (1)
- Technische Hochschule Wildau (1)
- Universitätsklinikum Düsseldorf, Institut für Toxikologie (1)
Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne B-Zell-Erkrankung, welche von einer großen Heterogenität auf der biologischen und klinischen Ebene sowie in der Therapieantwort geprägt ist. Durch die biologische Interpretation von whole exome sequencing (WES)-Daten der Tumor- und Normalproben von fünf MM-Patienten und sechs MM-Zelllinien (ZL) sowie dem Einbezug von publizierten next generation sequencing (NGS)-Daten von 38 MM-Patienten konnten in dieser Dissertation sowohl somatische tumorrelevante Mutationen identifiziert als auch ein MM-spezifisches Signaltransduktionsnetzwerk definiert werden. Interessanterweise wurde in fast 100 % der MM-Patienten mindestens eine Mutation und in ~50 % der MM-Patienten sogar mehr als eine Mutation innerhalb dieses Netzwerkes beobachtet, was auf eine inter- und intra-individuelle Signalweg-Redundanz hinweist, die für die individuelle Therapieentscheidung möglicherweise von Bedeutung sein könnte. Außerdem konnte bestätigt werden, dass identische, positionsspezifische und genspezifische Mutationen im MM selten wiederholt auftreten. Als häufig mutierte Gene im MM konnten KRAS, NRAS, LRP1B, FAM46C, WHSC1, ALOX12B, DIS3 und PKHD1 identifiziert werden. Interessanterweise wurde die DIS3-Mutation in der MM-ZL OPM2 gemeinsam mit einer copy neutral loss of heterozygosity (CNLOH) im DIS3-Lokus detektiert, und in der MM-ZL AMO1 wurde eine noch nicht näher charakterisierte KRAS-Mutation in Exon 4 in Verbindung mit einem copy number (CN)-Zugewinn und einer erhöhten KRAS-Genexpression gefunden. DIS3 ist ein enzymatisch aktiver Teil des humanen RNA-Exosom-Komplexes und KRAS ein zentrales Protein im RTK-Signalweg, wodurch genetische Aberrationen in diesen Genen möglicherweise in der Entstehung oder Progression des MMs eine zentrale Rolle spielen. Daher wurde die gesamte coding sequence (CDS) der Gene DIS3 und KRAS an Tumorproben eines einheitlich behandelten Patientensets der DSMM-XI-Studie mit einem Amplikon-Tiefen-Sequenzierungsansatz untersucht. Das Patientenset bestand aus 81 MM-Patienten mit verfügbaren zytogenetischen und klinischen Daten. Dies ergab Aufschluss über die Verteilung der Mutationen innerhalb der Gene und dem Vorkommen der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen des Tumors. Des Weiteren wurde die Assoziation der Mutationen mit weiteren klassischen zytogenetischen Alterationen (z.B. Deletion von Chr 13q14, t(4;14)-Translokation) untersucht und der Einfluss der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen auf den klinischen Verlauf und die Therapieantwort bestimmt. Besonders hervorzuheben war dabei die Entdeckung von sieben neuen Mutationen sowie drei zuvor unbeschriebenen hot spot-Mutationen an den Aminosäure (AS)-Positionen p.D488, p.E665 und p.R780 in DIS3. Es wurde des Weiteren die Assoziation von DIS3-Mutationen mit einer Chr 13q14-Deletion und mit IGH-Translokationen bestätigt. Interessanterweise wurde ein niedrigeres medianes overall survival (OS) für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation sowie auch eine schlechtere Therapieantwort für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation im Nebenklon im Vergleich zum Hauptklon beobachtet. In KRAS konnten die bereits publizierten Mutationen bestätigt und keine Auswirkungen der KRAS-Mutationen in Haupt- oder Nebenklon auf den klinischen Verlauf oder die Therapieantwort erkannt werden. Erste siRNA vermittelte knockdown-Experimente von KRAS und Überexpressionsexperimente von KRAS-Wildtyp (WT) und der KRAS-Mutationen p.G12A, p.A146T und p.A146V mittels lentiviraler Transfektion zeigten eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 von dem KRAS-Mutationsstatus.
Zusammenfassend liefert die vorliegende Dissertation einen detaillierten Einblick in die molekularen Strukturen des MMs, vor allem im Hinblick auf die Rolle von DIS3 und KRAS bei der Tumorentwicklung und dem klinischen Verlauf.
Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist ein zentrales Enzym der NO/cGMP-Signalkaskade, das über die Aktivierung von NO zur Bildung des second messangers cGMP führt. Die NO-GC setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen, sodass zwei Isoformen des Enzyms gebildet werden können (α1β1 und α2β1). Da die genaue Verteilung der beiden Isoformen im Colon nicht bekannt ist, wurde diese im ersten Teil dieser Arbeit charakterisiert. Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zeigten die Expression beider Isoformen sowohl in der glatten Muskelschicht als auch in der Submukosa und Lamina propria. Dabei war die α1β1-Isoform ubiquitär, die α2β1-Isoform dagegen hauptsächlich im Bereich des myenterischen Plexus vorzufinden.
In der glatten Muskelschicht des Colons ist die NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sowie Fibroblasten-ähnliche Zellen (FLC) exprimiert und hauptsächlich in die Modulation der gastrointestinalen Motilität involviert. Zur spezifischen Charakterisierung der Funktion der NO-GC in den einzelnen Zelltypen wurden Knockout-Mäuse generiert, denen die NO-GC global (GCKO) oder spezifisch in SMC (SMC-GCKO), ICC (ICC-GCKO) oder beiden Zelltypen (SMC/ICC-GCKO) fehlt. Anhand dieser Mausmodelle sollten im zweiten Teil dieser Arbeit die modulatorischen Effekte der NO-GC auf die spontanen Kontraktionen des Colons bestimmt werden. Zur Charakterisierung der spontanen Kontraktionen der zirkulären Muskelschicht wurden Myographiestudien mit 2,5 mm langen Colonringen durchgeführt. Hierbei konnten drei verschiedene Kontraktionen gemessen werden: Kleine, hochfrequente Ripples, mittlere Kontraktionen und große Kontraktionen. Die detaillierte Analyse der einzelnen Kontraktionen zeigte einerseits eine NO-unabhängige Regulation der Ripples, andererseits eine NO-abhängige Modulation der mittleren und großen Kontraktionen über die NO-GC in SMC und ICC. Die NO-GC in SMC beeinflusst die Kontraktionen vermutlich vor allem über die Regulation des Muskeltonus der zirkulären Muskelschicht. Die NO-GC in ICC dagegen modifiziert die spontanen Kontraktionen möglicherweise über eine Veränderung der Schrittmacheraktivität. Allerdings führt erst ein Funktionsverlust des NO/cGMP-Signalweges in beiden Zelltypen zu einem sichtbar veränderten Kontraktionsmuster, das dem von globalen Knockout-Tieren glich. Dies weist auf eine kompensatorische Wirkung der NO-GC im jeweils anderen Zelltyp hin.
Zur Analyse der propulsiven Kontraktionen entlang des gesamten Colons wurden Videoaufnahmen der Darmbewegungen in Kontraktionsmusterkarten transformiert. Zudem wurde der Darm durchspült und die Ausflusstropfen aufgezeichnet, um die Effektivität der Kontraktionen beurteilen zu können. Hierbei zeigte sich, dass eine Beeinträchtigung des NO/cGMP-Signalweges eine verminderte Effektivität der Kontraktionen zur Folge hat und vermutlich durch eine beeinträchtige Synchronisation der Kontraktionen erklärt werden kann. In diesem Regulationsmechanismus konnte vor allem der NO-GC in SMC eine übergeordnete Rolle zugewiesen werden.
Der dritte Teil der Arbeit thematisierte den Befund, dass SMC-GCKO-Tiere ca. 5 Monate nach Tamoxifen-Behandlung Entartungen der Mukosa entwickelten. Diese Entartung war lediglich in Tamoxifen-induzierten Knockout-Tieren vorzufinden. Histologische Analysen identifizierten die Entartungen als tubulovillöses Adenom. Die Genexpressionsanalyse von Mukosafalten von SMC-GCKO- und heterozygoten Kontrolltieren zeigte eine Vielzahl von Genen, welche spezifisch bei colorectalem Karzinom differenziell exprimiert sind. Einer dieser Faktoren war der BMP-Antagonist Gremlin1. Dieser Faktor erschien von besonderem Interesse, da er in Zellen der Lamina muscularis mucosae und kryptennahen Myofibroblasten exprimiert wird. Immunhistochemische Analysen ließen vermuten, dass diese Zellen sowohl die NO-GC als auch die Cre-Rekombinase unter dem SMMHC-Promotor exprimieren. Diese Arbeit liefert demnach Hinweise darauf, dass die NO-GC einen wichtigen Regulator innerhalb der Stammzellnische bildet. Die Deletion der NO-GC führt vermutlich zu einer verstärkten Bildung bzw. Sekretion von Gremlin1, was die Homöostase der mukosalen Erneuerung stört und somit zur Entwicklung von Adenomen führt.
Altersassoziierte und strahleninduzierte Veränderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils
(2018)
Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor für die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, könnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erhöhen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verzögern könnten. Durch die Langzeit-Kultivierung primärer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell für das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Veränderungen ermöglichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Darüber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Veränderungen in Genen und Signalwegen, die für das Altern relevant sind, und ein erhöhtes epigenetisches Alter nachgewiesen werden.
Das in vitro Modell für das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko für die Entwicklung eines Zweittumors erhöhen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der frühen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Veränderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erhöhte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erhöhtes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Veränderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Veränderungen verstärkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Veränderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Veränderungen in normalen Zellen könnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekundären Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann.
In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Veränderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erhöhten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Veränderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Veränderungen darstellen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Veränderungen beeinflussen können.
Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde.
Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden.
Simkania negevensis (Sn) repliziert als Chlamydia-ähnliches obligat intrazelluläres Bakterium auch in einer membranumschlossenen Vakuole, die als SCV (engl. Simkania-containing vacuole) bezeichnet wird. Die SCV ist ein bis jetzt einzigartiges Kompartiment, das stark mit ER-Membranen assoziiert ist, wobei ER-Stress von den Bakterien blockiert wird. Die Morphologie der SCV scheint dabei in Epithelzellen (HeLa229, A549, HEp-2) als auch in Makrophagen (THP1) gleich zu sein. Die SCV stellt die erste intrazelluläre Berührungsfläche dar, an der Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen erfolgen, und dient gleichzeitig als Replikationsnische. Mithilfe der Identifizierung von humanen und bakteriellen Faktoren, die mit der ER-SCV-Membran assoziiert sind, sollten die Zusammensetzung der SCV sowie mögliche Interaktionen mit dem ER oder zellulären Transportwegen ermittelt werden. Vergleichsstudien von SCV-assoziierten Proteinen sollten Ähnlichkeiten zur chlamydialen Inklusion aufzeigen, für die bereits einige interagierende Wirtszellfaktoren beschrieben wurden. In dieser Arbeit wurde ein Aufreinigungsprotokoll etabliert, das sowohl für ER-SCVMembranen aus HeLa229 als auch THP1 geeignet war und für spätere Proteom- oder Lipidomanalysen diente. Über markierungsfreie massenspektrometrische Messungen konnten 302 bakterielle und 1178 humane Proteine in ER-(SCV-) Membranen und 885 bakterielle Proteine in aufgereinigten Sn identifiziert werden. In ER-(SCV-) Membranen von nicht und Sn-infizierten HeLa229 Zellen befanden sich 51 unterschiedlich verteilte und 57 transportassoziierte humane Proteine, die auf infektionsinduzierte Unterschiede beim intrazellulären Proteintransport hindeuteten. Eine entgegengesetzte Regulation von retro- und anterograd transportierten Proteinen konnte mithilfe von RNA-Interferenz und dem Einsatz geeigneter Inhibitoren bestätigt werden, wobei sich zeigte, dass Clathrin-assoziierte und COPI-Vesikel eine zentrale Rolle spielen. Retro-Inhibitoren, die den retrograden Transport zwischen Endosomen zum Golgi oder zwischen frühen und späten Endosomen inhibieren, sowie Bafilomycin A1 (retrograd, späte Endosomen und Lysosomen) und Brefeldin A (anterograd, ER und Golgi), beeinflussten massiv die SCV-Ausbildung, SCV-Morphologie und den intrazellulären Lipidtransport. Über markierungsfreie massenspektrometrische und dünnschichtchromatographische Analysen konnten erste Unterschiede im Lipidvorkommen in Sn-infizierten Zellen, an ER-SCVMembranen und in aufgereinigten Sn im Vergleich zu nicht infizierten Zellen ermittelt werden. Dabei konnten neben An- und Abreicherungen in Gesamtzellextrakten sowie ER-SCVMembranen zwei infektionsspezifische Lipide, Cholesterol-ß-D-Glykosid und PE 30:0, identifiziert werden. Weiterführende umfangreiche RNA-Interferenzstudien weisen darauf hin, dass die Sn-Infektion vom Endosomen-zum-Golgi-Transport und vom Clathrin-assoziierten Vesikeltransport abhängig ist. Zusammenfassend konnten erste mögliche SCV-assoziierte Proteine und Lipide identifiziert werden, die mit der bakteriellen Infektion verbunden waren. Des Weiteren hängen eine stabile SCV-Ausbildung und Sn-Infektivität von verschiedenen retrograden Transportwegen und damit von dem Erwerb von Nährstoffen wie bspw. Lipiden ab.
Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren.
Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff.
Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%.
Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden.
Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen.
Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen.
Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern.
Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen.
Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten.
In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden.
In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann.
Die autosomal-dominant vererbte facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD) ist mit einer Prävalenz von etwa 1:20.000 die dritthäufigste Form der hereditären Myopathien. Erste Beschwerden werden meist in der zweiten Lebensdekade beobachtet. Betroffen sind vor allem die Muskulatur von Gesicht, Schultern, Oberarmen, die Fußhebermuskulatur und die Muskeln des Hüftgürtels.
FSHD wird durch einen Gendefekt ausgelöst, der den langen Arm des Chromosoms vier (4q35) betrifft, wobei es zur teilweisen Deletion des polymorphen Abschnitts D4Z4, der für das Protein DUX4 codiert, kommt. Dabei treten unter anderem Störungen in der DUX4-Expression, Veränderungen der myogenen Genexpression, eine Unterdrückung der Muskelzelldifferenzierung und eine Inhibition der Muskelbildung auf.
FSHD und eine andere Form der Muskeldystrophie, die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), zeigen trotz unterschiedlicher genetischer Ursachen phänotypisch Ähnlichkeiten in der Ausprägung der Erkrankungen. In früheren Studien zeigte die Kernhülle von EDMD-Myoblasten morphologische Auffälligkeiten. In anderen Untersuchungen waren morphologische Veränderungen der Mitochondrien von FSHD-Patienten festzustellen.
Daher wurden elektronenmikroskopische Untersuchungen der Kernhülle und der Mitochondrien von FSHD-Myoblasten durchgeführt und mit der entsprechenden Kontrolle verglichen.
Hierfür wurden drei verschiedene Zelllinien-Paare in unterschiedlichen Passagen, das heißt unterschiedlicher Anzahl an Subkultivierungen, eingesetzt, wobei in den höheren Passagen vermehrt morphologische Atypien beobachtet werden konnten.
Die eingesetzten Zelllinien differenzieren sich durch verschiedene Parameter wie beispielsweise Alter und Geschlecht der Patienten. Dabei zeigten sich sowohl zwischen den Kontrollzellen als auch zwischen den FSHD-Myoblasten Unterschiede.
Im Rahmen der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie kamen zwei verschiedene Fixierungsmethoden zum Einsatz: die konventionelle chemische Fixierung, Entwässerung und Flacheinbettung von Kulturzellen und die Hochdruckgefrierung mit anschließender Gefriersubstitution. In Bezug auf die Qualität des Strukturerhalts, die beim Hochdruckgefrieren erreicht wird, wird dieser Art der Fixierung eine Überlegenheit gegenüber allen anderen Verfahren zugeschrieben. Diese allgemeine Aussage kann nicht vollständig auf die Untersuchungen an den Myoblasten übertragen werden.
Für die Untersuchung der Kernmembranen sind beide Methoden geeignet, wobei der Abstand zwischen innerer und äußerer Kernmembran nach der HPF-Fixierung schärfer abgebildet wurde. Bei der Darstellung der Mitochondrien zeigten die elektronenmikroskopischen Aufnahmen nach dem Hochdruckgefrieren bessere und schärfere Ergebnisse. Die Kernporen waren bei beiden Fixierungsmethoden gut erkennbar.
Beim Vergleich der gesunden und erkrankten Myoblasten wiesen die Kontrollzellen deutlich weniger Auffälligkeiten auf als die Myoblasten von FSHD-Patienten.
Innere und äußere Kernmembran verliefen bei den Kontrollzellen meist parallel und die Mitochondrien zeigten in den meisten Fällen eine typische wurmartige, längliche Form mit Cristae. Dies traf sowohl für die konventionelle Fixierung als auch für das Hochdruckgefrieren zu.
Die erkrankten Myoblasten wiesen im Vergleich zur Kontrolle bei beiden Fixierungsmethoden deutliche Auffälligkeiten in der Mitochondrien-Morphologie auf. Neben einer oft großen Variationsbreite hinsichtlich Form und Länge war auch das teilweise Fehlen der Cristae festzustellen.
Bei Betrachtung der Kernhülle fielen jedoch deutliche Unterschiede zwischen konventioneller und HPF-Fixierung auf. Die äußere Kernmembran der konventionell fixierten FSHD-Myoblasten verlief unregelmäßig und gewellt. Im Gegensatz dazu wies die Kernhülle der HPF-fixierten erkrankten Myoblasten einen erstaunlich parallelen Verlauf auf.
Da bei EDMD in vorangegangenen Untersuchungen auch fluoreszenzmikroskopisch Veränderungen der erkrankten Zellen auffällig waren, wurde neben den Methoden der Elektronenmikroskopie das Vorliegen und die Verteilung verschiedener Proteine in FSHD-Myoblasten mittels indirekter Immunfluoreszenz untersucht und mit den Kontrollzellen verglichen.
Zur Beurteilung der Kernhülle wurden Antikörper gegen Lamin A/C und Nukleoporine eingesetzt. Die Mitochondrien wurden mithilfe des Antikörpers ANT1/2, der an den Adenin-Nukleotid-Translokator der inneren Mitochondrienmembran bindet, untersucht.
Im Gegensatz zu den Untersuchungen an EDMD-Myoblasten waren die Lamine A und C sowie die Kernporen sowohl bei den Myoblasten der FSHD-Patienten als auch bei den Kontrollzellen nachweisbar und gleichmäßig verteilt.
Bei der indirekten Immunfluoreszenz mit ANT1/2 zeigten sich Unterschiede zwischen den untersuchten Myoblasten-Paaren.
Durch die vorliegenden Ergebnisse ist darauf zu schließen, dass die Myoblasten von FSHD-Patienten Veränderungen Mitochondrien aufweisen. Die Untersuchungen der Kernhülle liefern abhängig von der Fixierungsmethode unterschiedliche Ergebnisse.
Der Einsatz von computergestützten Analysen hat sich zu einem festen Bestandteil der biowissenschaftlichen Forschung etabliert. Im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit wurden systembiologische Untersuchungen auf verschiedene biologische Themengebiete und Organismen angewendet. In diesem Zusammenhang liefert die Arbeit einen innovativen und interdisziplinären methodischen Ansatz. Die grundlegende Frage lautet: Wie verstehe und beschreibe ich Signalwege und wie kann ich sie beeinflussen? Der Ansatz verknüpft verschiedene biologische Datensätze und Datenebenen miteinander, beginnend vom Genom und Interaktionskontext über semiquantitative Simulationen hin zu neuen Interventionen und Experimenten, welche therapeutisch und biotechnologisch genutzt werden können. Die Analysen können auf diese Weise
- zu einem besseren Verständnis experimenteller Daten und biologischer Fragestellungen beitragen und ermöglichen ein systematisches Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Netzwerkeffekte (z.B. in Pflanzen).
- Darüber hinaus ermöglichen sie die Identifizierung wichtiger funktioneller Hubproteine und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für weitere experimentelle Testungen (z.B. Tumormodelle),
- stellen zudem einen hilfreichen Schritt auf dem Weg zur personalisierten Medizin (z.B. lncRNAs und Tumormodelle) und Medikamentenentwicklung (z.B. Datenbank DrumPID) dar.
(i) Als Grundlage wurde hierzu eine integrierte systembiologische Methode entwickelt, welche experimentelle Daten (z.B. Transkriptomdaten) hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen untersucht und die Identifizierung relevanter funktioneller Cluster und Hubproteine ermöglicht. In einem ersten Teil wurden Analysen zum pflanzlichen Immunsystem durchgeführt. Mithilfe der entwickelten Methode wurden Genexpressionsdatensätze von A. thaliana, die mit dem Pathogen Pst DC3000 infiziert wurden, untersucht, um den Einfluss verschiedener Virulenzfaktoren auf das Interaktom der Wirtspflanze zu untersuchen und neue Modulatoren einer CK-vermittelten Immunabwehr zu finden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die von Pst DC3000 sekretierten Abwehrstoffe wichtige pflanzliche Hormonsignalwege für die Immunabwehr in A. thaliana beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass sich der Einfluss auf das Netzwerkverhalten der Effektorproteine und COR-Phytotoxine von dem der PAMPs unterscheidet, sich jedoch auch eine Regulierung gemeinsamer Signalwege und eine Überlappung der beiden Phasen der Immunantwort (PTI und ETI) in A. thaliana finden lassen. Die komplexe Immunantwort auf eine Infektion spiegelt sich zudem in einer höheren Anzahl an funktionellen Clustern und Hubproteinen in Pst DC3000 gegenüber den beiden untersuchten Mutanten wider, wobei sich für Pst DC3000 insbesondere ein stark vernetztes immunrelevantes Cluster um den JA-Signalweg zeigt. Weiterhin wurden anhand der entwickelten Methode wichtige Hubproteine für die Immunabwehr identifiziert. Als bedeutende Vertreter sind AHK2 und AAR14 zu nennen, welche Teil des Zweikomponentensystems der Signalübertragung von CK sind und hierbei wichtige Modulatoren für eine CK-vermittelte Immunabwehr darstellen.
(ii) Im zweiten Teil der Arbeit schließen sich Untersuchungen an einem in vitro-Experiment einer 2D- und 3D-Zellkultur einer HSP90-Behandlung in einem Lungentumormodell an. In diesem Zusammenhang wurden mithilfe der entwickelten Methode Unterschiede zwischen den beiden Zellkultursystemen gefunden, die das unterschiedliche Behandlungsansprechen erklären, und für die beiden KRAS-mutierten Zelllinien A549 und H441 des 3D-Testsystems neue prognostische und therapeutische Kandidaten identifiziert. Hierbei haben die durchgeführten Analysen zwei funktionelle Cluster von Protein-Interaktionen um p53 und die STAT-Familie gefunden, welche eine Verbindung zu HSP90 haben und die entsprechenden Behandlungsunterschiede nach einer HSP90-Inhibierung zwischen den beiden Zellkultursystemen erklären können. Unter Berücksichtigung des zelllinien-spezifischen Mutationshintergrunds wurde eine prognostische Markersignatur und daraus abgeleitet HIF1A für die H441-Zelllinie und AMPK für die A549-Zelllinie als neue therapeutische Targets gefunden, wobei die anschließend durchgeführten in silico-Simulationen einen potentiellen therapeutischen Effekt aufzeigen konnten. Weiterhin wurden wichtige experimentelle Readout-Parameter in ein in silico-Lungentumormodell integriert, wobei unter Einbeziehung des Mutationshintergrunds für die verwendeten Zelllinien die HSP90-Behandlung des 3D-Testsystems computergestützt abgebildet werden konnte. Im weiteren Verlauf wurden im in silico-Lungentumormodell Resistenzmechanismen nach einer Gefitinib-Behandlung mit bekanntem Mutationsstatus für die Zelllinien HCC827 und A549 untersucht und daraus folgend neue Therapieansätze abgeleitet, die von potentieller klinischer Bedeutung sein können. Die durchgeführten in silico-Simulationen für HCC827 konnten hierbei zeigen, dass eine EGFR- und c-MET-Koaktivierung zu einer Gefitinib-Resistenz führen kann, wohingegen bei den A549 eine Komutation von KRAS und IGF-1R zu einem geringen Behandlungsansprechen beiträgt. Die Simulationen lassen zudem erkennen, dass eine direkte Inhibierung der an der Resistenzentwicklung beteiligten Rezeptoren c-MET und IGF-1R in beiden Fällen nicht die bestmögliche Therapiestrategie darstellt. In beiden Zelllinien konnte gezeigt werden, dass eine kombinierte Inhibierung von PI3K und MEK den bestmöglichen therapeutischen Effekt liefert, was demnach einen vielversprechenden Therapieansatz bei Gefitinib-resistenten Lungentumorpatienten darstellt. In einem weiteren Schritt wurde das therapeutische Potential der miRNA-21 im in silico-Modell für die HCC827-Zelllinie untersucht. Die durchgeführten Simulationen zeigen, dass eine miRNA-21-Überexpression zu einer Resistenzentwickung nach Gefitinib-Behandlung beitragen kann, wobei eine Inhibierung der miRNA-21 diesen Effekt umkehren kann. Die Ergebnisse lassen zudem erkennen, dass eine PTEN-Aktivierung als potentieller Marker einer erfolgreichen therapeutischen Inhibierung der miRNA-21 fungieren kann, wohingegen eine reduzierte miRNA-21-Expression als möglicher Marker für eine erfolgreiche Gefitinib-Behandlung dienen kann.
(iii) Im dritten Teil der Arbeit wurden systematisch RNA- und Protein-Interaktionen untersucht. Hierzu wurden integrierte systembiologische Analysen an neu identifizierten und funktionell bislang unbekannten lncRNAs durchgeführt. Die Analysen für die infolge einer Herzhypertrophie hochregulierte lncRNA Chast haben umfassend gezeigt, dass diese Proteine und Transkriptionsfaktoren regulieren und binden kann, welche die Signalübertragung und Genexpression regulieren, aber auch eine Verbindung zum kardiovaskulären System und stressinduzierter Herzhypertrophie besitzt. Anhand der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass Chast direkt und indirekt (a) Proteine binden und die Translation beeinflussen kann, zudem eine Chromatin-modifizierende Funktion besitzt und so die Transkription, z.B. für herz- und stress-assoziierte Gene, reguliert, und/oder (b) in einem negativen Feedbackloop seine eigene Transkription reguliert. Obwohl lncRNAs meist eine geringe Konservierung aufweisen, konnten die durchgeführten Analysen für Chast eine Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren aufzeigen. Weiterhin haben die Untersuchungen an zwei hypoxie-induzierten lncRNAs in Endothelzellen gezeigt, dass die lncRNA MIR503HG eine hohe Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren besitzt, wohingegen die LINC00323-003 eine geringe Konservierung aufzeigt. Dies untermauert die Tatsache, dass lncRNAs häufig eine geringe Konservierung aufweisen, was Untersuchungen in Modellorganismen hinsichtlich einer therapeutischen Nutzung schwierig machen.
Da sich zahlreiche Untersuchungen auf Interaktionen und Signalwege konzentriert haben, wurde abschließend eine Datenbank entwickelt, welche Analysen von Protein-Interaktionen und Signalwegen nachhaltig voranbringt. Die entwickelte DrumPID-Datenbank stellt insbesondere die Interaktion zwischen einem Medikament und seinem Target in den Fokus und ermöglicht Analysen einzelner Interaktionen und beteiligter Signalwege, bietet zusätzlich aber auch verschiedene Links zu anderen Datenbanken für individuelle weiterführende Analysen. DrumPID ermöglicht ein geeignetes Medikament u. a. für ein vorgegebenes Zielprotein zu finden und dessen Wirkmechanismus und Interaktionskontext zu untersuchen, was zu einem besseren experimentellen Verständnis beitragen kann. Zudem erlaubt DrumPID eine potentielle chemische Leitstruktur für ein Zielprotein zu entwickeln, was z.B. spezifisch ein parasitisches Protein inhibiert, ohne dabei einen toxischen Effekt im Menschen zu haben. Zahlreiche weitere Pharmakabeispiele belegen, dass DrumPID für den täglichen wissenschaftlichen Gebrauch auf dem Gebiet der Analyse von Protein-Pharmaka-Interaktionen und der Medikamentenentwicklung geeignet ist.
Die beschriebenen Ergebnisse der Promotionsarbeit wurden in fünf Originalarbeiten, zwei Übersichtsartikeln und einem Buchteil, u. a. in Science Translational Medicine, veröffentlicht, sechs dieser Publikationen erfolgten im Rahmen von Erstautorschaften.
Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert.
Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress.
Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht.
Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck sowie den Elektrolyt- und Wasserhaushalt. Das aktive Peptid, Angiotensin II (AngII), führt dabei zur Vasokonstriktion und in höheren Konzentrationen zu Bluthochdruck. Hypertensive Patienten haben ein erhöhtes Risiko an Krebs zu erkranken, vor allem an Nierenkrebs. Wir konnten bereits in vivo zeigen, dass AngII in der Lage ist, den Blutdruck zu steigern und dosisabhängig zu DNA-Schäden über den Angiotensin II Typ 1-Rezeptor (AT1R) führt. Ein stimuliertes RAAS kann ferner über die Aktivierung der NADPH-Oxidase, einer Hauptquelle der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, zu oxidativem Stress führen. Zielsetzung dieser Arbeit war es zum einen, mit Hilfe von AT1a-Rezeptor-defizienten Mäusen in vivo zu prüfen, ob die Bildung von ROS, sowie die Bildung von DNA-Schäden in der Niere und im Herzen unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Zum anderen sollte, ebenfalls in vivo, untersucht werden, ob eine oder beide von zwei untersuchten Isoformen der NADPH-Oxidase (Nox) für die Auslösung oxidativen Stresses in der Niere verantwortlich ist.
Zunächst wurden für den Versuch zur Überprüfung der Abhängigkeit AngII-induzierter DNA-Schäden vom Blutdruck männliche C57BL/6-Mäuse und AT1a-Knockout (KO)-Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentrationen von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Zusätzlich wurde eine Gruppe von AngII-behandelten Wildtyp (WT)-Mäusen mit dem AT1-Rezeptor-Blocker Candesartan (Cand) behandelt. Während des Versuchszeitraumes fanden regelmäßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an den wachen Mäusen statt. In WT-Mäusen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in Niere und im Herzen. Außerdem traten in dieser Gruppe DNA-Schäden in Form von Einzel- und Doppelstrangbrüchen auf. All diese Reaktionen auf AngII konnten jedoch durch gleichzeitige Behandlung mit Cand verhindert werden. AT1a-KO-Mäuse hatten, verglichen mit WT-Kontrollmäusen, einen signifikant niedrigeren Blutdruck und normale Albumin-Level im Urin. In AT1a-KO-Mäusen, die mit AngII behandelt wurden, konnte kein Anstieg des systolischen Blutdrucks sowie kein Einfluss auf die Nierenfunktion gefunden werden. Jedoch führte AngII in dieser Gruppe zu einer Steigerung von ROS in der Niere und im Herzen. Zusätzlich wurden genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen signifikant in dieser Gruppe induziert. Auch wenn AT1a-KO-Tiere, unabhängig von einer AngII-Infusion, keine eingeschränkte Nierenfunktion zeigten, so wiesen sie erhebliche histopathologische Schäden im Hinblick auf die Glomeruli und das Tubulussystem auf. Diese Art von Schäden deuten auf eine besondere Bedeutung des AT1aR im Hinblick auf die embryonale Entwicklung der Niere hin. Zusammenfassend beweisen die Ergebnisse dieses Experiments eindeutig, dass eine AngII-induzierte ROS-Produktion und die Induktion von DNA-Schäden unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Da in der AngII-behandelten AT1a-KO-Gruppe eine signifikant höhere Expression des AT1b-Rezeptors zu finden war und die Blockade von beiden Rezeptorsubtypen mit Cand zu einer Verhinderung der schädlichen Effekte durch AngII führte, scheint der AT1bR im Falle einer AT1aR-Defizienz für die Entstehung der Schäden zuständig zu sein.
Ziel des zweiten Experimentes war es, den Beitrag der Nox2 und Nox4 zum oxidativen DNA-Schaden in vivo zu untersuchen. Hierfür wurden männliche C57BL/6-Mäuse und Nox2- oder Nox4-defiziente Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentration von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Im WT-Stamm und in beiden Nox-defizienten Stämmen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in der Niere. Außerdem waren in allen AngII-behandelten Gruppen genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen, erhöht. Auch in Abwesenheit von AngII wiesen Nox2- und Nox4-defiziente Mäuse mehr Doppelstrangbrüche im Vergleich zu WT-Kontrollmäusen auf. Interessanterweise kompensieren allerdings weder Nox2 noch Nox4 das Fehlen der jeweils anderen Isoform auf RNA-Basis. Aufgrund dieser Ergebnisse schließen wir, dass bislang keine Isoform alleine für die Generierung von oxidativen DNA-Schäden in der Niere verantwortlich gemacht werden kann und dass eine Beteiligung einer weiteren Nox-Isoform sehr wahrscheinlich ist. Möglicherweise könnten aber auch andere ROS-generierende Enzyme, wie Xanthinoxidase oder Stickoxidsynthase involviert sein. Da genomische Schäden in Nieren von Nox2- und Nox4-defizienten Mäusen in Abwesenheit von AngII gegenüber den Schäden in WT-Kontrollmäusen erhöht waren, könnten die beiden Isoformen auch eine schützende Funktion im Bereich von Nierenkrankheiten übernehmen. Da dies aber bislang nur für Nox4 beschrieben ist, ist es wahrscheinlicher, dass das Fehlen von einer der beiden Isoformen eher einen Einfluss auf die Embryonalentwicklung hat. Um dies jedoch abschließend zu klären wäre es sinnvoll mit induzierbaren Knockout-Modellen zu arbeiten, bei denen mögliche entwicklungsbedingte Effekte minimiert werden können.