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Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005).
Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen.
Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter
Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist
über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER)
unter 150
· cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte
von mehr als 1500
· cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die
Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick
auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial
von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier
das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der
BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann.
Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten
Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren
Bedingungen bereitzustellen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden
in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A)
zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit
Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen
TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die
Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt
wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten
Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente
NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs
für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt.
Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren,
wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs
und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen.
Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der
neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten
die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten
Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte
von bis zu 2500
· cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter
Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für
weiterführende Studien ausgewählt.
Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin,
Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller
Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden.
Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von
FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die
BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung
der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit
Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt.
Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten:
Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac
werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie
Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen
wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer
Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt.
Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen
an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen.
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke
konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen
ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening
von Medikamenten denkbar.
Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro-
Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die
Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse,
eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen
einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt.
Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten
eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung
genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen
und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen
zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden.
Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden.
The Role of Acid Sphingomyelinase in \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infection of Endothelial Cells
(2022)
Staphylococcus aureus is a human bacterial pathogen responsible for a variety of diseases including bacterial pneumonia and sepsis. Recent studies provided an explanation, how S. aureus and its exotoxins contribute to the degradation of endothelial junction proteins and damage lung tissue [4]. Previous findings were indicating an involvement of acid sphingomyelinase (ASM) activity in cell barrier degradation [5]. In the presented study the impact of singular virulence factors, such as staphylococcal α-toxin, on in vitro cell barrier integrity as well as their ability to elicit an activation of ASM were investigated.
Experiments with bacterial supernatants performed on human endothelial cells demonstrated a rapid dissociation after treatment, whereas murine endothelial cells were rather resistant against cell barrier degradation. Furthermore, amongst all tested staphylococcal toxins it was found that only α-toxin had a significant impact on endothelial junction proteins and ASM activity. Ablation of this single toxin was sufficient to protect endothelial cells from cell barrier degradation and activation of ASM was absent.
In this process it was verified, that α-toxin induces a recruitment of intracellular ASM, which is accompanied by rapid and oscillating changes in cytoplasmic Ca2+ concentration and an increased exposure of Lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP1) on the cell surface. Recruitment of lysosomal ASM is associated, among other aspects, to plasma membrane repair and was previously described to be involved with distinct pathogens as well as other pore forming toxins (PFT). However, with these findings a novel feature for α-toxin has been revealed, indicating that the staphylococcal PFT is able to elicit a similar process to previously described plasma membrane repair mechanisms.
Increased exposure and intake of surface membrane markers questioned the involvement of ASM activity in S. aureus internalization by non-professional phagocytes such as endothelial cells. By modifying ASM expression pattern as well as application of inhibitors it was possible to reduce the intracellular bacterial count. Thus, a direct connection between ASM activity and S. aureus infection mechanisms was observed, therefore this study exemplifies how S. aureus is able to exploit the host cell sphingolipid metabolism as well as benefit of it for invasion into non-professional phagocytic cells
Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert.
Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet.
In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind.