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Mitochondria are organelles of endosymbiotic origin, which play many important roles in eukaryotic cells. Mitochondria are surrounded by two membranes and, considering that most of the mitochondrial proteins are produced in the cytosol, possess import machineries, which transport mitochondria-targeted proteins to their designated location. A special class of outer mitochondrial membrane (OMM) proteins, the β-barrel proteins, require the sorting and assembly machinery (SAM) for their OMM integration. Both mitochondrial β-barrel proteins and the central component of the SAM complex, Sam50, have homologs in gram-negative bacteria. In yeast mitochondria, bacterial β-barrel proteins can be imported and assembled into the OMM. Our group demonstrated that this, however, is not the case for human mitochondria, which import only neisserial β barrel proteins, but not those of Escherichia coli and Salmonella enterica. As a part of this study, I could demonstrate that β-barrel proteins such as Omp85 and PorB of different Neisseria species are targeted to human mitochondria. Interestingly, only proteins belonging to the neisserial Omp85 family were integrated into the OMM, whereas PorB was imported into mitochondria but not assembled. By exchanging parts of homologous neisserial Omp85 and E. coli BamA and, similarly, of neisserial PorB and E. coli OmpC, it could be demonstrated in this work that the mitochondrial import signal of bacterial β barrel proteins cannot be limited to one short linear sequence, but rather secondary structure and protein charge seem to play an important role, as well as specific residues in the last β-strand of Omp85. Omp85 possesses five conserved POTRA domains in its amino-terminal part. This work additionally demonstrated that in human mitochondria, at least two POTRA domains of Omp85 are necessary for membrane integration and functionality of Omp85. In the second part of this work, the influence of Sam50 on the mitochondrial cristae structure was investigated. This work contributed to a study performed by our group in which it was confirmed that Sam50 is present in a high molecular weight complex together with mitofilin, CHCHD3, CHCHD6, DnaJC11, metaxin 1 and metaxin 2. This connection between the inner and outer mitochondrial membrane was shown to be crucial for the maintenance of the mitochondrial cristae structure. In addition, a role of Sam50 in respiratory complex assembly, suggested by a SILAC experiment conducted in our group, could be confirmed by in vitro import studies. An influence of Sam50 not only on respiratory complexes but also on the recently described respiratory complex assembly factor TTC19 was demonstrated. It was shown that TTC19 not only plays a role in complex III assembly as published, but also influences the assembly of respiratory complex IV. Thus, in this part of the work a connection between the OMM protein Sam50 and maintenance of cristae structure, respiratory complex assembly and an assembly factor could be established.
Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt.
Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird.
Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen.
Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern.
Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war.
Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos.
Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen.
Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet.
Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren.
In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert.
Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war.
Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben.
Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren.
The microbial communities that live inside the human gastrointestinal tract -the human gut
microbiome- are important for host health and wellbeing. Characterizing this new “organ”,
made up of as many cells as the human body itself, has recently become possible through
technological advances. Metagenomics, the high-throughput sequencing of DNA directly from
microbial communities, enables us to take genomic snapshots of thousands of microbes living
together in this complex ecosystem, without the need for isolating and growing them.
Quantifying the composition of the human gut microbiome allows us to investigate its
properties and connect it to host physiology and disease. The wealth of such connections was
unexpected and is probably still underestimated. Due to the fact that most of our dietary as well
as medicinal intake affects the microbiome and that the microbiome itself interacts with our
immune system through a multitude of pathways, many mechanisms have been proposed to
explain the observed correlations, though most have yet to be understood in depth.
An obvious prerequisite to characterizing the microbiome and its interactions with the host is
the accurate quantification of its composition, i.e. determining which microbes are present and
in what numbers they occur. Historically, standard practices have existed for sample handling,
DNA extraction and data analysis for many years. However, these were generally developed for
single microbe cultures and it is not always feasible to implement them in large scale
metagenomic studies. Partly because of this and partly because of the excitement that new
technology brings about, the first metagenomic studies each took the liberty to define their own
approach and protocols. From early meta-analysis of these studies it became clear that the
differences in sample handling, as well as differences in computational approaches, made
comparisons across studies very difficult. This restricts our ability to cross-validate findings of
individual studies and to pool samples from larger cohorts. To address the pressing need for
standardization, we undertook an extensive comparison of 21 different DNA extraction methods
as well as a series of other sample manipulations that affect quantification. We developed a
number of criteria for determining the measurement quality in the absence of a mock
community and used these to propose best practices for sampling, DNA extraction and library
preparation. If these were to be accepted as standards in the field, it would greatly improve
comparability across studies, which would dramatically increase the power of our inferences
and our ability to draw general conclusions about the microbiome.
Most metagenomics studies involve comparisons between microbial communities, for example
between fecal samples from cases and controls. A multitude of approaches have been proposed
to calculate community dissimilarities (beta diversity) and they are often combined with
various preprocessing techniques. Direct metagenomics quantification usually counts
sequencing reads mapped to specific taxonomic units, which can be species, genera, etc. Due to
technology-inherent differences in sampling depth, normalizing counts is necessary, for
instance by dividing each count by the sum of all counts in a sample (i.e. total sum scaling), or by
subsampling. To derive a single value for community (dis-)similarity, multiple distance
measures have been proposed. Although it is theoretically difficult to benchmark these
approaches, we developed a biologically motivated framework in which distance measures can
be evaluated. This highlights the importance of data transformations and their impact on the
measured distances.
Building on our experience with accurate abundance estimation and data preprocessing
techniques, we can now try and understand some of the basic properties of microbial
communities. In 2011, it was proposed that the space of genus level variation of the human gut
microbial community is structured into three basic types, termed enterotypes. These were
described in a multi-country cohort, so as to be independent of geography, age and other host
properties. Operationally defined through a clustering approach, they are “densely populated
areas in a multidimensional space of community composition”(source) and were proposed as a
general stratifier for the human population. Later studies that applied this concept to other
datasets raised concerns about the optimum number of clusters and robustness of the
clustering approach. This heralded a long standing debate about the existence of structure and
the best ways to determine and capture it. Here, we reconsider the concept of enterotypes, in
the context of the vastly increased amounts of available data. We propose a refined framework
in which the different types should be thought of as weak attractors in compositional space and
we try to implement an approach to determining which attractor a sample is closest to. To this
end, we train a classifier on a reference dataset to assign membership to new samples. This way,
enterotypes assignment is no longer dataset dependent and effects due to biased sampling are
minimized. Using a model in which we assume the existence of three enterotypes characterized
by the same driver genera, as originally postulated, we show the relevance of this stratification
and propose it to be used in a clinical setting as a potential marker for disease development.
Moreover, we believe that these attractors underline different rules of community assembly and
we recommend they be accounted for when analyzing gut microbiome samples.
While enterotypes describe structure in the community at genus level, metagenomic sequencing
can in principle achieve single-nucleotide resolution, allowing us to identify single nucleotide
polymorphisms (SNPs) and other genomic variants in the gut microbiome. Analysis
methodology for this level of resolution has only recently been developed and little exploration
has been done to date. Assessing SNPs in a large, multinational cohort, we discovered that the
landscape of genomic variation seems highly structured even beyond species resolution,
indicating that clearly distinguishable subspecies are prevalent among gut microbes. In several
cases, these subspecies exhibit geo-stratification, with some subspecies only found in the
Chinese population. Generally however, they present only minor dispersion limitations and are
seen across most of our study populations. Within one individual, one subspecies is commonly
found to dominate and only rarely are several subspecies observed to co-occur in the same
ecosystem. Analysis of longitudinal data indicates that the dominant subspecies remains stable
over periods of more than three years. When interrogating their functional properties we find
many differences, with specific ones appearing relevant to the host. For example, we identify a
subspecies of E. rectale that is lacking the flagellum operon and find its presence to be
significantly associated with lower body mass index and lower insulin resistance of their hosts;
it also correlates with higher microbial community diversity. These associations could not be
seen at the species level (where multiple subspecies are convoluted), which illustrates the
importance of this increased resolution for a more comprehensive understanding of microbial
interactions within the microbiome and with the host.
Taken together, our results provide a rigorous basis for performing comparative metagenomics
of the human gut, encompassing recommendations for both experimental sample processing
and computational analysis. We furthermore refine the concept of community stratification into
enterotypes, develop a reference-based approach for enterotype assignment and provide
compelling evidence for their relevance. Lastly, by harnessing the full resolution of
metagenomics, we discover a highly structured genomic variation landscape below the
microbial species level and identify common subspecies of the human gut microbiome. By
developing these high-precision metagenomics analysis tools, we thus hope to contribute to a
greatly improved understanding of the properties and dynamics of the human gut microbiome.
Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated.
Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits.