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Sonstige beteiligte Institutionen
- Boston Children's Hospital (1)
- Center for Computational and Theoretical Biology (CCTB), Universität Würzburg (1)
- Chemical Biology Laboratory, National Cancer Institue, Frederick (USA) (1)
- Fraunhofer IGB - Institutsteil Würzburg Translationszentrum Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Chemie, Brooklyn College, City University of New York, Brooklyn (1)
- Lehrstuhl für Physiologische Chemie (1)
- Lehrstuhl für Translationale Onkologie (1)
- Siemens Corporate Technology, Erlangen (1)
- Technische Hochschule Wildau (1)
- Universitätsklinikum Düsseldorf, Institut für Toxikologie (1)
IL-4 und IL-13 sind wichtige Faktoren bei der Entwicklung allergischer Erkrankungen. In dieser Arbeit wird die Rolle von IL-4 und IL-13 in einem Maus-Modell für allergisches Asthma während der allergischen Sensibilisierung und in einer etablierten asthmatischen Erkrankung untersucht. Weiterhin wird die Rolle von IL-4 und IL-13 in frühen Stadien der atopischen Dermatitis in einem Maus-Modell betrachtet. In einem Maus-Modell für allergisches Asthma mit anhaltender IgE-Synthese und einer persistierenden allergischen Atemwegspathologie konnte gezeigt werden, dass die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems während der allergischen Sensibilisierung zu einer dosisabhängigen Reduktion der allergen-spezifischen IgE-Titer, zur Inhibition der Atemwegseosinophilie, zur Reduktion der IL-5-Spiegel in der BAL und zu einer gesenkten Anzahl von IL-4 sezernierenden CD4+ T-Zellen. Weiterhin konnte durch die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems die Becherzellmetaplasie signifikant gesenkt werden. Die Inhibition des IL-4/IL-13 Systems nach der Entwicklung der allergischen Atemwegspathologie führte hingegen nicht zu einer signifikanten Reduktion der gemessenen Allergie-Parameter. Daraus lässt sich schließen, dass IL-4 und IL-13 nur eine untergeordnete Rolle in einer etablierten Allergie spielt. Diese Ergebnisse sind insbesondere wichtig, wenn man über das Verwendungspotential eines IL-4/IL-13-Inhibitors in der Allergie-Therapie bei asthmatischen Patienten spekuliert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die NC/Nga-Maus ein Modell für die humane atopische Dermatitis darstellt. NC/Nga Mäuse, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden, entwickeln makroskopische und histologische Hautpathologien, die der humanen atopischen Dermatitis sehr ähneln. Weiterhin entwickeln unter konventionellen Bedingungen gehaltenen NC/Nga Mäuse hohe IgE-Titer im Serum, die mit einer erhöhten Produktion an Th2-Zytokinen verbunden war. Die Inhibition des IL-4/IL-13-Systems führte in diesem Modell jedoch nicht zu einer Reduktion von Symptomen und Pathologien der humanen atopischen Dermatitis. Deswegen kann man spekulieren, dass die Inhibition des IL-4/IL-13-Systems zu einem zu späten Zeitpunkt erfolgte. Des Weiteren kann eine nicht-standardisierte Sensibilisierung bei Mäusen, die in einer konventionellen Tierhaltung gehalten werden, zu einem sehr unterschiedlichen Ausbruch der Dermatitis führen. Deshalb werden weitere Tierversuche mit einer höheren Anzahl von Tieren, die zwischen den Würfen randomisiert werden, nötig sein, um die Rolle von IL-4 und IL-13 in der atopischen Dermatitis zu klären.
Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es möglich sein, einen Synapsin-„Rescue“ Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Phänotyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt veröffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu klären, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen Fällen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der früheren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleiß-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen bestätigten die RT-PCR Sequenzen die früheren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch führt zu einer Veränderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht für ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleinsäure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits für verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die für die Reaktion benötigte doppelsträngige Sekundärstruktur der RNA kann durch die Sequenz der prä-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence“ (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabwärts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten Stämmen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in späteren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu können wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgeführt werden können. Zur phänotypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive Rückkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm für Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf phänotypische Veränderungen überprüft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringfügigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out Mäusen für SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS Männchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin’sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Phänotypen könnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erklären. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verfügbaren Gal4 Linien den Calciumsensor für eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zugänglich machen. In weiterführenden Arbeiten konnte die Funktionalität des Fusionsproteins überprüft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgeführt werden.
Netzhauterkrankungen, wie Retinitis pigmentosa, sind in der Bevölkerung weit verbreitet (1,5 Millionen weltweit). Gewöhnlich berichten die Betroffenen über Nachtblindheit und periphere Gesichtsfeldausfälle. Häufig führt diese Erkrankung, die durch eine fortschreitende Degeneration von Photorezeptoren verursacht wird, zur vollständigen Erblindung. Bisher beschrieb man den pathologischen Prozess vor allem an rd-Mäusen. Allerdings setzt bei diesen die Degeneration sehr früh ein. Somit ist die Übertragbarkeit auf den Menschen erschwert, da abgesehen von wenigen Ausnahmen, der Verlust von Photorezeptoren hier erst im zweiten Lebensabschnitt beginnt. Deshalb war es interessant, im Rahmen dieser Arbeit anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus ein Modell zu untersuchen, das ähnlich dem menschlichen System, zunächst eine intakte Morphologie zeigt. Dadurch war es möglich eine genaue zeitliche Abfolge der Degeneration zu dokumentieren. Dies kann medizinisch zur Entwicklung eines Therapieansatzes genutzt werden, der bereits zu Beginn der Degeneration greift, und damit den fortlaufenden Prozess zum Stillstand bringen kann. Die CNGA3-/-Rho-/- Maus repräsentiert ein System funktionsloser Photorezeptoren, bei dem der zyklische Nukleotid-Kanal (CNGA3) der Zapfenaußensegmente und das Rhodopsin (Rho) der Stäbchenaußensegmente ausgeschaltet wurde. Bestätigt wurde dies durch ein Elektroretinogramm mit einer negativen Photoantwort bezüglich Zapfen und Stäbchen. Die Degeneration führt zu einem vollständigen Verlust aller Photorezeptoren nach drei Monaten (Pm3). Zum Zeitpunkt Pw4 konnte, vergleichbar dem Wildtyp, eine intakte äußere Retina nachgewiesen werden, bei der lediglich die äußeren Stäbchensegmente fehlen. Die synaptischen Kontakte zwischen den Terminalien der Photorezeptoren, der Horizontalzellen und Bipolarzelldendriten waren normal entwickelt und Stäbchenendigungen als auch Zapfenendfüßchen bildeten funktionelle Triaden aus. Bei den Stäbchenendigungen konnte mit zunehmender Degeneration (Pw5, Pw6) eine Akkumulation synaptischer Bänder und postsynaptischer Elemente beobachtet werden. Im Zeitraum Pw4-7 zeigten sowohl die Zapfen, als auch die Horizontalzellen und Stäbchen-Bipolarzellen, eine bemerkenswerte strukturelle Plastizität. Obwohl durch die Photorezeptoren kein Lichtsignal vermittelt wurde, konnten präsynaptische Marker (bassoon) und postsynaptische Glutamatrezeptoren (GluR1, mGluR6) an den Photorezeptorterminalien nachgewiesen werden. Dies lässt die Vermutung zu, dass eine Transmitterfreisetzung theoretisch möglich wäre. Darüber hinaus konnte im Zeitraum von 12 Monaten keine nennenswerte Auswirkung auf die IPL beobachtet werden: Amakrin- und Zapfen-Bipolarzellen waren normal stratifiziert und die Expression der Transmitter-Rezeptoren zeigte ein charakteristisches Verteilungsmuster. Außerdem war die Ultrastruktur von konventionellen und Bandsynapsen der des Wildtyps vergleichbar. Darüber hinaus bildeten sowohl Amakrinzellen, als auch Bipolar- und Ganglienzellen, Fortsätze in die INL hinein. Allgemein zeigt die immunhistochemisch und ultrastrukturell untersuchte CNGA3-/-Rho-/- Maus, dass weder funktionell aktive Photorezeptoren noch Licht eine stimulierende Wirkung auf die Ausbildung synaptischer Strukturen und die Expression verschiedener Rezeptoren haben.
Isolierung des Sp1-verwandten Transkriptionsfaktors Knopfkopf mittels eines PCR-basierten Homologie-Screens in der Maus. Das Gen Knopfkopf wurde anschließend hinsichtlich der evolutiven Verwandtschaftsbeziehungen zum Drosophila-Gen buttonhead eingeordnet. Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mit Hilfe einer gezielten Geninaktivierung durch homologe Rekombination (knock out). Es konnte gezeigt werden, dass das Gen in der Embryogenese der Maus essentiell ist für die Entwicklung der Extremitäten, der Nase und des Zentralen Nervensystems sowie der sekundären Gastrulation.
Die Kenntnis der Transkriptionsregulationsmechanismen stellt eine wichtige biochemische Grundlage für das Verständnis der molekularen Ereignisse, die der Krebsentstehung zugrunde liegen, dar. Eine Schlüsselrolle in der transkriptionellen Kontrolle der Genexpression spielen hierbei die Transkriptionsfaktoren. Diese sind nukleäre Proteine, die mit spezifischen DNA-Elementen interagieren und so die Transkription eines in cis-Position lokalisierten Zielgens regulieren. Da der “microphthalmia associated” Transkriptionsfaktor Mitf-M spezifisch in Melanozyten und Melanomzellen exprimiert wird, scheint er eine wichtige Rolle in der melanomspezifischen transkriptionellen Aktivierung zu spielen und war deshalb im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Das Xiphophorus Melanomsystem, ein genetisch gut charakterisiertes Modell, wurde herangezogen, um unter zu Hilfenahme des Tyrosinasegens des mit Xiphophorus nahe verwandten Medaka (Oryzias latipes) die Transkriptionsregulation im Melanom näher zu untersuchen. Zuerst wurde gezeigt, dass der Medaka Tyrosinasepromotor spezifisch in einer Melanomzellinie von Xiphophorus (PSM Zellen) aktiviert wird. Eine 3,2 kb lange Sequenz, die 5´ zum Transkriptionsstart liegt, reicht dabei aus, eine extrem hohe, melanomspezifische Promotoraktivität zu erreichen. Dabei sind die Regionen, die sogenannte E-Boxen (CANNTG) enthalten, von besonderer Wichtigkeit für die Promotoraktivität in der Melanomzellinie, während sie in embryonalen Xiphophoruszellen (A2, als Kontrollzellen eingesetzt) keinen Einfluß auf die Expression haben. An diese E-Box-Sequenzen binden sogenannte b-HLH-Leuzinzipper Transkriptionsfaktoren. Es konnte auf indirektem Wege bewiesen werden, dass es das Protein Mitf sein muß, das an die E-Boxen im Tyrosinasegenpromotor bindet und somit die transkriptionelle Aktivierung ausübt. In EMSA Studien wurde gezeigt, dass die E-Boxen ein Kernprotein aus PSM-Zellen binden, und das dieses spezifisch an diese 6 bp lange Sequenz bindet, da Mutationen der zentralen Oligonukleotid-Sequenz die Bindung zerstörten. Ein weiterer indirekter Beweis für die Bindung von Mitf an diese E-Boxen konnte durch Co-Transfektionsexperimente erbracht werden. Auch in Säugerfibroblastenzellen konnte ektopisch eingebrachtes Mitf-M die Medaka Tyrosinasegenpromotorkonstrukte durch Bindung an E-Boxen aktivieren und das Luciferasegen zur Expression bringen. Das heißt also, dass Mitf-M ausreicht um sogar in nicht-Melanomzellen den Tyrosinasegenpromotor zu transaktivieren. Aufgrund dieser verschiedenen Experimente konnte gefolgert werden, dass diese Mitf-Bindungsstellen essentiell für eine hohe melanom- oder pigmentzellspezifische Promotoraktivität sind. Die Bindungsstelle A, die nahe der Basalpromotorregion im Medaka Tyrosinasegen liegt (-126/-131), scheint hierbei besonders wichtig für die Promotoraktivität und vor allem auch für die Vermittlung der Zelltypspezifität zu sein. Promotorkonstrukte mit den drei E-Boxen A (-126/-131), B (-2651/-2656) und C (-2866/-2871) zeigten eine gegenüber dem Konstrukt nur mit der A-Bindungsstelle höhere Aktivität. Es scheint sich ein additiver Effekt der Mitf-Bindungsstellen auszuwirken. Es konnte allerdings auch gezeigt werden, dass die E-Boxen nicht alleine verantwortlich für die Melanom- bzw. Pigmentzellspezifität sind. Neben den Mitf-Bindungsstellen gibt es noch weitere Elemente im Tyrosinasegenpromotor, die an der Bestimmmung der Spezifität beteiligt sind, und die zwar durch Deletionsreihen im Promotor eingegrenzt, dennoch noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Die Wichtigkeit des Transkriptionsfaktors Mitf bzw. seiner Funktionen spiegelt sich auch in seiner starken Konservierung im Laufe der Evolution wider. Vergleichende Studien zeigten dass der Transkriptionsfaktor mit seinen verschiedenen Isoformen in Säugern wie in Vertebraten gut konserviert wurde. Nähere Analysen konnten das Vorhandensein zweier separater Gene für Mitf-M und Mitf-B bei Teleostiern nachweisen, während bei Säugetieren und Vögeln nur ein einziges Gen für die unterschiedlichen Mitf Proteine kodiert. Für das Verständnis der molekularen Prozesse bei der Melanombildung von Xiphophorus war es wichtig die Rolle von Mitf in der Signaltransduktion zu analysieren. Es war möglich einen direkten Zusammenhang zwischen der in PSM Zellen exprimierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk, dem Genprodukt des Tumor-induzierenden Onkogens von Xiphophorus, und dem Transkriptionsfaktor Mitf nachzuweisen und seine Regulation über Signaltransduktionswege näher zu klären. Die Regulation von Mitf über den MAPkinase-Weg, konnte durch Inhibitorexperimente nachgewiesen werden. Aufgrund der zahlreichen Aktivitäten von Mitf innerhalb der Melanozyten, und seiner Aktivierungsfunktion für verschiedene Zielgene, ist dieser Transkriptionsfaktor von großer Bedeutung für sowohl Differentierung/Pigmentierung wie auch Proliferation/Überleben der Tumorzellen.
Porenbildende Zytolysine stellen wichtige Virulenzfaktoren von vielen pathogenen Bakterien dar. In Escherichia coli-Stämmen wurden bisher drei verschiedene porenbildende Zytolysine identifiziert, nämlich das alpha-Hämolysin (HlyA), das EHEC-Hämolysin (EHEC-HlyA, Ehx) und das latente Hämolysin ClyA. Alpha-Hämolysin und EHEC-Hämolysin, die beide zur Familie der RTX-Toxine gehören, werden häufig von uropathogenen bzw. enterohämorrhagischen E. coli-Stämmen gebildet. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß das alpha-Hämolysin maßgeblich an der Pathogenität von uropathogenen E. coli-Stämmen beteiligt ist. Das Hämolysin ClyA, ein Protein von 34 kDa das keine Homologien zu den RTX-Toxinen aufweist, wurde zuerst im Laborstamm E. coli K-12 identifiziert, wo es unter normalen in vitro-Kulturbedingungen nur in sehr geringem Ausmaß exprimiert wird. Ein funktionales clyA-Gen wurde kürzlich aber auch in verschiedenen pathogenen E. coli-Stämmen, u. a. in enteroinvasiven E. coli (EIEC)-Stämmen, gefunden. Bislang ist jedoch unbekannt, ob ClyA eine Rolle in der Virulenz von pathogenen E. coli-Stämmen spielt. Die vorliegende Arbeit sollte deshalb zur Aufklärung der in vivo-Funktion von ClyA in E. coli beitragen. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei die Frage nach der Bedeutung von ClyA für EIEC-Stämme, die zur fakultativ intrazellulären Lebensweise befähigt sind. Ausgewählte wildtypische EIEC-Stämme (EIEC 12860, EIEC 4608-58) zeigten von sich aus bzw. bei Überexpression des Transkriptionsregulators SlyA phänotypisch sichtbare hämolytische Aktivität, während in vitro konstruierte isogene clyA-"knock-out"-Mutanten dieser Stämme stets nichthämolytisch waren. Daraus konnte geschlossen werden, daß die wildtypischen EIEC-Stämme in der Lage sind, ClyA in signifikanten Mengen zu exprimieren. Vergleichende Infektionsstudien, die mit dem EIEC-Stamm 4608-58 und der entsprechenden clyA-Mutante unter Verwendung von J774-Makrophagen durchgeführt wurden, ergaben außerdem, daß ClyA wesentlich zur Zytotoxizität des wildtypischen EIEC-Stamms beiträgt. Eine spezielle Bedeutung von ClyA für die fakultativ intrazelluläre Lebensweise von EIECs konnte mit diesen Versuchen allerdings nicht nachgewiesen werden. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, daß im Fall des fakultativ intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes ein porenbildendes Toxin, Listeriolysin O (LLO), nach der Invasion in phagozytische Zellen die Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom ermöglicht. Es stellte sich deshalb die Frage, ob ClyA bei EIECs möglicherweise eine ähnliche Rolle spielt. Um dies herauszufinden, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ClyA von E. coli in der Lage ist, LLO in L. monocytogenes funktional zu ersetzen. Hierzu wurden L. monocytogenes-Mutanten, die aufgrund von chromosomalen Deletionen nicht in der Lage waren, LLO zu produzieren, mit verschiedenen Plasmiden komplementiert, welche clyA bzw. clyA-Derivate unter der Kontrolle der Promotorregion des LLO-Gens (hly) enthielten. Einige dieser komplementierten Stämme exprimierten und sezernierten tatsächlich das ClyA-Protein und zeigten dementsprechend auch einen hämolytischen Phänotyp. Dieselben Stämme waren jedoch bei Infektionen in J774-Zellen nicht in der Lage, sich intrazellulär signifikant zu vermehren, obwohl teilweise eine Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom zu beobachten war. Diese Daten zeigten, daß das ClyA-Protein von E. coli das Listeriolysin O von L. monocytogenes nicht funktional ersetzen kann. Eine mögliche Funktion von ClyA als Phagosomenöffner in EIECs kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen.
Die Entstehung maligner Zellen durch irreversible genetische Veränderungen ist ein allgegenwärtiger Prozess im menschlichen Organismus. Allein die spontane Mutationsrate genügt um in einem Organismus permanent transformierte Zellen entstehen zu lassen, welche den Körper in kürzester Zeit überschwemmen würden. Auch wenn bestimmte genetische Schäden frühzeitig durch Reparaturmechanismen beseitigt werden und sich nicht jede transformierte Zelle in einem Tumor manifestiert, so ist die eigentliche Frage nicht, warum Krebs entsteht, sondern warum er bei der hohen Mutationsrate so selten auftritt. Verantwortlich für die frühe Erkennung und Beseitigung transformierter Zellen ist das körpereigene Immunsystem, das in der Lage ist die meisten aberranten Zellen zu entfernen, sodass der manifeste Tumor die Ausnahme und nicht die Regel ist. Der menschliche Organismus verfügt über ein angeborenes und ein erworbenes Immunsystem. Bis heute ist nicht eindeutig geklärt, ob maligne Zellen mit ihren veränderten Oberflächenstrukturen erst eine Immunantwort induzieren müssen oder ob, wie bei der Abwehr infektiöser Partikel, die angeborene Immunität für die Beseitigung von Tumorzellen verantwortlich ist. Die in dieser Arbeit verwendete humane Hybridoma Technologie (Immortalisierung menschlicher Lymphozyten und Isolierung monoklonaler Antikörper) bietet die einzigartige Möglichkeit, sowohl aus an Krebs erkrankten Patienten als auch aus gesunden Probanden tumorspezifische Antikörper zu isolieren und durch deren genauere Charakterisierung Einblicke in die humorale Immunität gegen maligne Zellen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit werden fünf humane monoklonale Antikörper beschrieben, die aus verschiedenen Tumorpatienten gewonnen wurden, sowie zwei Antikörper, die aus gesunden Probanden isoliert werden konnten. In allen Fällen erwiesen sich die Antikörper als tumorspezifisch, d.h. sie reagieren nicht mit gesundem Gewebe und sind demnach keine Autoantikörper. Es handelt sich weiterhin in allen Fällen um Antikörper des IgM-Isotyps; es konnten keinen Antikörper anderer Ig-Klassen isoliert werden. Genetische Analysen ergaben, dass alle isolierten Antikörper gering oder gar nicht mutiert waren, was bedeutet, dass sie nicht durch Stimulation affinitätsgereift sind. Zudem konnte demonstriert werden, dass alle Antikörper Apoptose von Tumorzellen induzieren und dass sie an eine Zuckerkette ihrer Antigene binden oder solche Carbohydrate zumindest entscheidend in die Bindung involviert sind. Die Eigenschaften der in dieser Arbeit beschriebenen Antikörper wurden mit anderen bereits etablierten IgM-Antikörpern verglichen. Hierbei stellte sich heraus, dass alle Antikörper, welche sich als tumorspezifisch erwiesen, ähnliche Eigenschaften zeigen. Interessant ist zudem die Beobachtung, dass die Keuzreaktion der Antikörper, also ihre Reaktion mit anderen Tumorgeweben, reziprok mit dem Mutations-grad korreliert ist. Je mehr Mutationen ein Antikörper aufweist, desto eingeschränkter und spezifischer sind demnach seine Reaktionen mit anderen Tumoren. Dies deutet darauf hin, dass auch innerhalb der Keimbahn-kodierten Antikörper durch vereinzelte Mutationen eine höhere Variabilität erzeugt werden kann. Ähnlich wie bei der Affinitätsreifung der erworbenen Immunität scheint sich auch hier die Spezifität mit der Anzahl der Mutationen zu erhöhen. Zusammenfassend weisen die erhaltenen Ergebnisse darauf hin, dass zumindest die humorale Immunität gegen maligne Zellen das Resultat der angeborenen Immunität ist und nicht von Tumorzellen induziert wird. Dies bedeutet zudem, dass Moleküle wie natürliche Antikörper in der Immunität eine viel größere Rolle spielen als bisher angenommen. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits bei der Untersuchung der Immunität gegen bakterielle Antigene erzielt, sodass hier vermutet werden kann, dass die gleichen Mechanismen zugrunde liegen wie bei der Abwehr transformierter Zellen. Darüber hinaus wird die Frage beantwortet, warum ein manifester Tumor eine Ausnahme bleibt. Die angeborene, primäre Immunität verfügt über ein existierendes Repertoire an Rezeptoren, welche eine ausreichende Variabilität aufweisen, und muss daher nicht erst über ein komplexes System von Erkennung und Stimulation, wie die adaptierte Immunität, induziert werden. Dieser logistische Vorsprung der natürlichen Immunität garantiert eine permanente Überwachung und eine schnelle Reaktion gegenüber veränderten Zellen und fremden Partikeln.
Die Messung der räumlich aufgelösten Aktivität von neuronalen Zellverbänden ist ein wichtiges Werkzeug, um die Funktionsweise von Gehirnen zu verstehen. Für diese Arbeit diente die Fruchtfliege Drosophila melanogaster mit ihrer gut beschriebenen Genetik und Neurobiologie als Untersuchungsobjekt. Bei der vorgelegten Arbeit lag eine zweigeteilte Aufgabenstellung vor: Zum einen wurde die Technik des in – vivo Calcium – Imagings mit Hilfe des genetisch codierten Sensors Yellow Cameleon 2.1 am Lehrstuhl komplett neu etabliert, zum anderen wurde mit der neuen Technik das Zusammenspiel der funktionellen Elemente neuronaler Systeme anhand der Fliegenolfaktorik untersucht. Sowohl die Experimente zur Depolarisation durch KCl, als auch die Experimente zur olfaktorischen Codierung, wurden mit dem Calciumsensor Yellow Cameleon 2.1 durchgeführt. Es wurde ausgehend von der Vorgängerversion Yellow Cameleon 2.0 durch gezielte Mutagenese von Sören Diegelmann erstellt. Eine Photomultiplier – basierte in – vitro Funktionsanalyse des rekombinanten Sensorproteins ergab eine Zunahme der Ratio EYFP / ECFP mit steigender Calciumkonzentration. Dabei konnte auch der ratiometrische FRET – Effekt des Cameleons verdeutlicht werden: Mit steigender Calciumkonzentration verschiebt sich das Verhältnis von EYFP – Fluoreszenz zu ECFP – Fluoreszenz zu höheren Ratiowerten. Durch Zugabe des Calciumchelators EGTA konnte außerdem die reversible Arbeitsweise des Sensors nachgewiesen werden. Das in die Fliege eingebrachte Yellow Cameleon 2.1 – Konstrukt wurde mittels der GAL4 – UAS – Technik in verschiedenen olfaktorischen Gehirnzentren exprimiert. Von besonderer Relevanz für die Experimente zur olfaktorischen Codierung war dabei die GAL4 – Treiberlinie GH146. Mit ihrer Hilfe konnte das Fusionsprotein in den olfaktorischen Projektionsneuronen des Fliegengehirns exprimiert, und so die Duftrepräsentation im postsynaptischen Neuropil der Antennalloben bzw. in den präsynaptischen Neuropilen der Calyces und des lateralen Protocerbrums untersucht werden: Die Stimulation von 3 individuellen Fliegen mit den Düften Benzaldehyd, Isoamylacetat und Octanol liefert duftspezifische neuronale Aktivitätsmuster im Antenallobus. Die auf die Duftstimuli mit Calciumsignalen reagierenden Areale haben eine Größe von 10 – 30 µm, liegen also in der Größenordnung von individuellen Glomeruli. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben zeigt außerdem einen kombinatorischen Aspekt: Jeder Duft evoziert ein charakteristisches Aktivitätsmuster bestehend aus einem oder mehreren Glomeruli. Die Aktivitätsmuster verschiedener Düfte können sich überlagern, d.h. individuelle Glomeruli können durch verschiedene Düfte aktiviert werden, das gesamte Aktivitätsmuster, d.h. die Summe der aktivierten Glomeruli eines bestimmten Duftes, ist jedoch charakteristisch. Die Duftrepräsentation in den Antennalloben von Drososophila geschieht also in Form eines glomerulären Codes, ein Prinzip der Duftverarbeitung, das auch in anderen Insekten und Vertebraten nachgewiesen werden konnte. Für den Calyx des Pilzkörpers ergaben sich innerhalb eines Individuums, bei wiederholter Stimulation mit demselben Duft, ebenfalls duftspezifische Aktivitätsmuster. Dabei waren die auf den Duftstimulus hin antwortenden neuronalen Areale diskret über den Calyx hinweg verteilt. Insgesamt zeigt das hohe Maß an Reproduzierbarkeit der Aktivitätsmuster für einen gegebenen Duft, dass im Calyx, wie in den Antennalloben, eine duftspezifische räumliche Repräsentation vorliegt. Der kombinatorische Aspekt der Codierung konnte auch hier beobachtet werden. Die einzelnen Spots der im Calyx gemessenen Aktivitätsmuster liegen in der Größenordnung von 5 +/- 2 µm und entsprechen somit in ihrer Größe den elektronenmikroskopisch beschriebenen Microglomeruli. Durch die Calcium – Imaging Experimente am lateralen Protocerebrum konnte nachgewiesen werden, dass die Erhöhung der Duftkonzentration eine räumliche Ausdehnung des aktivierten Neuropils zur Folge hat. Die EYFP –, ECFP – und Ratio – Intensitäten, die aus einer “Region of Interest“ im anterioren Bereich des lateralen Protocerebrums berechnet wurden, zeigen weiterhin, dass mit steigender Duftkonzentration auch die Stärke des Calciumsignals zunimmt. Dabei gibt es zwischen den 4 getesteten Düften statistisch signifikante Unterschiede: Methylcyclohexanol evoziert über den gesamten Verdünnungsbereich hinweg die schwächste neuronale Aktivität, Isoamylacetat evoziert in den Verdünnungsstufen 10-3 und 10-1 die stärkste neuronale Aktivität. D.h. neben der räumlichen Ausdehnung des Signals, führt die Konzentrationserhöhung auch zu einer gesteigerten Intensität des Calciumsignals, wobei sich die Signalintensitäten für verschiedene Düfte und Verdünnungsstufen unterscheiden können. Mit der verwendeten Versuchsanordnung und Datenauswertung, war es jedoch bislang nicht möglich eine räumliche Repräsentation der Düfte im lateralen Protocerebrum nachzuweisen.