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Die Histidin-Kinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems gehört zu den unorthodoxen Histidin-Kinasen, die im Gegensatz zu den klassischen Sensorkinasen durch eine komplexere Domänen-Struktur gekennzeichnet ist. Schon seit längerem ist bekannt, dass BvgS durch niedrige Temperaturen oder die Anwesenheit von chemischen Substanzen, wie Sulfationen oder Nikotinsäure inaktiviert wird. Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass die Autophosphorylierungs-Aktivität der BvgS Histidin-Kinase nach Inkubation mit oxidiertem Ubichinon inhibiert wird (Bock & Gross, 2002). Bislang ist weitgehend unklar, welche Bedeutung die zusätzlichen Domänen, wie die periplasmatische-, PAS- bzw. HPt-Domäne für die Signalwahrnehmung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb nach Erstellung einer B. bronchiseptica spezifischen Genbank mit Hilfe des GAL4-Yeast Two-Hybrid (YTH) Systems nach Interaktionspartnern der einzelnen BvgS-Domänen gesucht. Nach dem Ausschluss von falsch-positiven Klonen und dem Durchlauf entsprechender Kontrollen konnten im YTH-System für die periplasmatische und die PAS-Domäne von BvgS insgesamt vier Interaktionspartner identifiziert werden. Für die HPt-Domäne konnte mit Hilfe des YTH-Systems kein möglicher Interaktionspartner gefunden werden. Als ein putativer Interaktionspartner der BvgS-PAS-Domäne wurde das BB0602-Protein identifiziert, das ein ATP-Bindeprotein darstellt, welches als Bestandteil eines ABC-Transport-System für den Transport von verzweigten Aminosäuren verantwortlich gemacht wird. Diese Interaktion konnte mittels eines GST-Pulldownassays bestätigt werden. Der biochemische Nachweis der übrigen identifizierten Protein-Interaktionen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erbracht werden. Die Ergebnisse des YTH-Screenings deuten darauf hin, dass die Aktivität der BvgS Histidin-Kinase und damit die Virulenzgenexpression durch die An- bzw. Abwesenheit von verzweigten Aminosäuren beeinflusst werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Relevanz der Interaktion zwischen der PAS-Domäne und dem ATP-Bindeprotein BB0602 nicht näher charakterisiert werden, so dass in Zukunft unter anderem die Konstruktion einer B. bronschiseptica bb0602-Deletionsmutante geplant ist, um somit mögliche Auswirkungen auf die Expression von bvg-abhängigen Genen zu beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulators BvgA aus B. holmesii (BvgABH). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass trotz der umfangreichen Sequenzkonservierung der BvgA-Proteine aus B. holmesii und B. pertussis, eine B. pertussis bvgA-Mutante nicht durch den bvgA-Lokus aus B. holmesii komplementiert werden konnte (Gerlach et al., 2004). Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein hybrider Response Regulator BvgAfus konstruiert, der aus der Receiver- und Linker-Domäne des BvgABH-Proteins und der Output-Domäne von BvgABP zusammengesetzt ist. Voraussetzung hierfür war die Kenntnis der einzelnen Domänengrenzen und die Sequenz des Linker-Bereiches des Response Regulators BvgA aus B. pertussis (BvgABP), welche durch limitierte Proteolyse und massenspektrometrische Methoden identifiziert wurden (Bantscheff et al., 2000). Im Falle des hybriden Proteins konnte im Gegensatz zu BvgABH eine Bindung an BvgABP-abhängige Promotorsequenzen beobachtet werden. Zudem war BvgAfus in der Lage, die Expression BvgABP-abhängiger Gene in vivo zu induzieren. Allerdings war es in seiner Phosphorylierungseffizienz im Vergleich zum wildtypischen Response Regulator-Protein aus B. holmesii eingeschränkt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wenigen Abweichungen zwischen den Aminosäuresequenzen der Output-Domänen dafür verantwortlich sind, dass das BvgABH-Protein die Funktion von BvgABP in vivo und in vitro nicht übernehmen kann. So unterscheiden sich die Output-Domänen der Response Regulatoren aus B. pertussis und B. holmesii in zehn Aminosäureaustauschen, wobei davon vier Aminosäuren innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives verändert sind. Um zu untersuchen, ob die unterschiedlichen DNA-Binde- und transkriptionsaktivierenden Eigenschaften von BvgABH im Besonderen auf diese Aminosäureunterschiede zurückzuführen sind, wurden mittels ortspezifischer Mutagenese die Aminosäuresequenz innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives an die Sequenz aus B. pertussis angeglichen. Das resultierende Protein BvgABH* zeigte eine dem wildtypischen BvgABH-Protein ähnliche Phosphorylierungseffizienz, war aber nicht in der Lage, BvgABP-abhängige Zielsequenzen spezifisch zu erkennen bzw. die Funktion des BvgABP-Proteins in vivo zu ersetzen. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die wenigen Aminosäureunterschiede der Output-Domäne außerhalb der DNA-Binderegion zwar nicht im Zusammenhang mit der Phosphorylierungseffizienz stehen, jedoch die DNA-Bindeeigenschaften beeinflussen.
Die Bedeutung der genomischen Instabilität in humanen melanocytischen Läsionen ist Gegenstand vieler dermatologischer Studien und bis heute ungeklärt. Ist die Mikrosatelliteninstabilität bloße Begleiterscheinung der unkontrolliert proliferierenden Tumorzellen oder wird ihr ein pathogenetischer Mechanismus zuteil? In Fischen der Gattung Xiphophorus können durch klassische Kreuzungsexperimente melanocytische Läsionen verschiedener Malignitätsgrade induziert werden. Diese Läsionen sind auf Grund ihres genetisch kontrollierten Hintergrundes eindeutig definiert und reproduzierbar - und damit im Vorteil gegenüber der unsicheren Klassifikation humaner Hautläsionen. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich der Frage nachgegangen, ob MIN+ ein obligates molekulares Ereignis für die Progression von Melanomen bis zum terminalen Stadium darstellt. Dieser Fragestellung wurde unter Verwendung PCR-basierter Mikrosatellitenanalysen sowie Multilocus DNA-Fingerprint Analysen nachgegangen. 23 Tumoren unterschiedlicher Malignität wurden im Vergleich zum tumorfreien Normalgewebe desselben Fisches an 12 Genloci unbekannter chromosomaler Lokalisation auf Mikrosatelliteninstabilität untersucht. Es wurde insgesamt eine Zahl von 263 informativen Loci erzielt, von denen sich nur 20 ( = 7.6%) als instabil erwiesen. Mittels der Multilocus-Fingerprint Analysen wurden 8 Melanome und deren korrespondiere Normalgewebe mit drei Sonden hybridisiert. Nur einer von 12 analysierbaren MLFPs zeigte eine genetische Aberration in Form einer Deletion einer einzelnen Bande im Tumorgewebe. Mit diesem Ergebnis wurde das in der Mikrosatellitenanalyse erhaltene Resultat einer nicht signifikanten Mikrosatelliteninstabilität im Xiphophorus-Melanom-Modell System bestätigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Abwesenheit eines MIN+-Phänotypen in den Melanomen von Xiphophorus darauf hinweist, daß der Erwerb von MIN weder ein notwendiges Kriterium für die Initiation eines Tumors noch für seine Progression darstellt. Ein anderer Pfad der Tumorinitiation ist die direkte Schädigung oder der Verlust von Tumorsuppressorgenen, von in Mismatch Repair involvierten Genen oder durch die Transformation von Proto-Onkogenen zu Onkogenen. In dieser Arbeit wurde die Expression von drei Genen, die in der Regulation des Zellzyklus Schlüsselrollen spielen (rb, p53, cdkn2a), sowie einer Komponente des MMR-Systems (MSH2) auf RNA-Ebene untersucht. Ihre Expressionsstärke wurde in folgenden Geweben miteinander verglichen: Maligne Melanome, benigne Läsionen, tumorfreie Kontrollgewebe und die Xiphophorus-Melanomzellinie (PSM). MSH2 und p53 wurden in allen untersuchten Geweben auf gleichem Niveau exprimiert. Die vergleichende Expressionsanalyse des vermeintlichen "melanoma susceptibility gene" cdkn2a im Melanom-Modell und der PSM-Zellinie bestätigte die bereits vorbeschriebene Überexpression des Zellzyklusinhibitors in malignen Melanomen von Xiphophorus-Hybriden. Die Untersuchung des Expressionsmusters von Rb in den oben genannten Geweben ergab eine verminderte Transkription dieses Gens in malignen Melanomen. Eine mögliche Interpretation dieses Ergebnisses wäre, einen Defekt in Rb oder pRB zu Grunde zu legen und die Hochregulation von cdkn2a entsprechend einer negativen Rückkopplungsschleife als physiologische Konsequenz anzusehen.
Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht. Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verstärkte Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+ T-Zellüberwachung unterliegen.
Since the fruit fly Drosophila melanogaster entered the laboratories as a model organism, new genetic, physiological, molecular and behavioral techniques for the functional analysis of the brain rapidly accumulated. Nowadays this concerted assault obtains its main thrust form Gal4 expression patterns that can be visualized and provide the means for manipulating -in unrestrained animals- groups of neurons of the brain. To take advantage of these patterns one needs to know their anatomy. This thesis describes the Virtual Insect Brain (VIB) protocol, a software package for the quantitative assessment, comparison, and presentation of neuroanatomical data. It is based on the 3D-reconstruction and visualization software Amira (Mercury Inc.). Its main part is a standardization procedure which aligns individual 3D images (series of virtual sections obtained by confocal microscopy) to a common coordinate system and computes average intensities for each voxel (volume pixel). The VIB protocol facilitates direct comparison of gene expression patterns and describes their interindividual variability. It provides volumetry of brain regions and helps to characterize the phenotypes of brain structure mutants. Using the VIB protocol does not require any programming skills since all operations are carried out at a (near to) self-explanatory graphical user interface. Although the VIB protocol has been developed for the standardization of Drosophila neuroanatomy, the program structure can be used for the standardization of other 3D structures as well. Standardizing brains and gene expression patterns is a new approach to biological shape and its variability. Using the VIB protocol consequently may help to integrate knowledge on the correlation of form and function of the insect brain. The VIB protocol provides a first set of tools supporting this endeavor in Drosophila. The software is freely available at http://www.neurofly.de.
Sumoylation of transcription factors modulate their activity (either upregulating or downregulating) by altering protein-protein interactions as well as subcelluar/subnuclear localization. The transcription factor family of NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) plays an important role in cytokine gene regulation in T cells. Due to alternative usage of two promoters (P1 & P2), two polyadenylation sites (pA1 and pA2) and alternative splicing events, NFATc1 is expressed in six isoforms which are NFATc1/alphaA, betaA, alphaB, betaB, alphaC and betaC, where alpha and beta refer to two different 1st exons and A, B, C to the differentially spliced and extended C-termini. The short isoforms of NFATc1 (NF-ATc1/A) contain a relatively short C terminus whereas, the longer isoforms, B and C, span the extra C-terminal peptides of 128 and 246 aa, respectively. To analyze the specific biological effects of NFATc1 isoform, a yeast two hybrid screening of a human spleen cDNA library with extra C-terminal peptide of NFATc1 as a bait, was performed. At the end of the assay, the proteins involved in the sumoylation pathway such as Ubc9, PIAS1 were detected with highest frequencies and subsequently were were able to demonstrate that NFATc1 is sumoylated. The extent of sumoylation is isoform specific. While NFATc1/A, harboring only one sumoylation site, shows very weak sumoylation, the two additional sites within NFATc1/C lead to efficient sumoylation. This modification directs NFATc1/C into SUMO-1 bodies, which in turn colocalize with PML-nbs. Furthermore, sumoylated NFATc1/C recruits the transcriptional co-repressors HDAC (both class I as well as class II HDACs) which results in a significant decrease of the level of histone acetylation on the IL-2 promoter, an important NFATc1 target gene. As a consequence of this, a decrease of IL-2 production was observed, while NFATc1/C, which can no longer be sumoylated due to mutating the target lysines, exhibited dramatic elevated transcriptional potential on the IL2 promoter. This supports our finding from IL-2 promoter-driven reporter gene assay, which shows downregulation of NFATc1/C transactivation upon sumoylation. Hence, sumoylation exerts a negative effect on NFATc1 transcriptioanl activity. Immunofluorescence studies showed SUMO modification to relocate NFATc1/C also into transcriptionally inactive heterochromatin regions, demonstrated by H3K9 m3 (tri-methylated histone lysine 9) colocalization studies. Interestingly, in the absence of sumoylation, NFATc1 was partially colocalized with transcriptional hotspots in the nucleus, which might contribute to the higher transcription potentiality of the non-sumoylated NFATc1. It is important to note that, the transcriptional activity of other NFATc1 target genes (IL-13, IFN-gamma etc.) was positively upregulated upon sumoylation of NFATc1, suggesting a non-universal effect of sumoylation on NFATc1/C function. In conclusion, sumoylation directs NFATc1 into nuclear bodies where it interacts with transcriptional co-repressors and relocalize itself with heterochromatin, leading to repression of NFATc1/C-mediated transcription. Most importantly, the effect of NFATc1/C sumoylation is promoter specific. Taken together, SUMO modification alters the function of NFATc1 from an activator to a site-specific transcriptional repressor. This study unraveled a novel regulatory mechanism, which controls isoform specific NFATc1 function.
Microtubules are a fascinating component of the cellular scaffold protein network, the cytoskeleton. These hollow tubular structures are assembled of laterally associated proto-filaments containing ab-tubulin heterodimers in a head to tail arrangement. Accordingly microtubules have a defined polarity, which sets the base for the polarity of the cell. The microtubule lattice can be arranged in two conformations: In the more abundant B-lattice conformation, where the protofilaments interact laterally through a- to a- and b- to b-tubulin contacts and in the less stable A-lattice conformation, where a-tubulin interacts laterally with b-tubulin. In cells the microtubules generally contain 13 protofilaments of which usually one pair interacts in the A-lattice conformation, forming the so-called lattice seam. Microtubule dynamics and interactions are strongly regulated by micro-tubule associate proteins (MAPs). Structural investigations on MAPs and microtubule associated motor proteins in complex with microtubules have become possible in combination with modern electron microscopy (EM) and image processing. We have used biochemistry and different advanced EM techniques to study the interaction between microtubules and the MAP Mal3p in vitro. Mal3p is the sole member of the end-binding protein 1 (EB1) protein family in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Previous in vivo studies have shown that Mal3p promotes microtubule growth. Our studies with high-resolution unidirectional shadowing EM revealed that Mal3p interacts with the microtubule lattice in a novel way, using binding sites on the microtubule that are different from those reported for other MAPs or motor proteins. Full-length Mal3p preferentially binds between two protofilaments on the microtubule lattice, leaving the rest of the lattice free. A case where Mal3p was found in two adjacent protofilament, revealed an A-lattice conformation on the microtubules, surprisingly indicating specific binding of Mal3p to the microtubule seam. With a lattice enhancer, in form of a b-tubulin binding kinesin motor domain, it was demonstrated that Mal3p stabilizes the seam which is thought to be the weakest part of a microtubule. Further, the presence of Mal3p during microtubule polymerization enhances the closure of protofilament sheets into a tubular organization. Cryo-EM and 3-D helical reconstruction on a monomeric microtubule binding domain of Mal3p, confirm the localization in between the protofilament and result in an accurate localization on the microtubule lattice. The results also indicate Mal3p’s capacity to influence the microtubule lattice conformation. Together, studies approached in vitro demonstrate that an EB1-family homolog not only interacts with the microtubule plus end, but also with the microtubule lattice. The structure of Mal3p interacting with microtubules reveals a new mechanism for microtubule stabilization and further insight on how plus end binding proteins are able promote microtubule growth. These findings further suggest that microtubules exhibit two distinct reaction platforms on their surface that can independently interact with selected MAPs or motors.
The Ras/RAF/MEK/ERK cascade is a central cellular signal transduction pathway involved in cell proliferation, differentiation, and survival where RAF kinases are pivotal kinases implicated in cancer. The development of specific irreversible kinase inhibitors is a rewarding but difficult aim. CI-1033 was developed to irreversibly inhibit erbB receptor tyrosine kinases by reacting to the Cys113 residue (p38alpha MAP kinase numbering) of the kinase domain. In this study we tried a similar approach to target the RAF oncoproteins which posses a similar cysteine at position 108 in the hinge region between the small n-lobe and the large c-lobe of the kinase domain. A novel synthetic approach including a lyophilization step allowed us the synthesis of a diphenyl urea compound with an epoxide moiety (compound 1). Compound 1 possessed inhibitory activity in vitro. However our time kinetics experiments and mass spectroscopic studies clearly indicate that compound 1 does not react covalently with the cysteine residue in the hinge region. Moreover, in cell culture experiments, a strong activation of the RAF signaling pathway was observed, an effect which is known from several other RAF kinase inhibitors and is here reported for the first time for a diphenyl urea compound, to which the clinically used unspecific kinase inhibitor BAY 43-9006 (Sorafinib, Nexavar) belongs. Although activation was apparently independent on B- and C-RAF hetero-oligomerization in vitro, in vivo experiments support such a mechanism as the activation did not occur in starved knockout cells lacking either B-RAF or C-RAF. Furthermore, we developed a mathematical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade demonstrating how stimuli induce different signal patterns and thereby different cellular responses, depending on cell type and the ratio between B-RAF and C-RAF. Based on biochemical data for activation and dephosphorylation, we set up differential equations for a dynamical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade. We find a different signaling pattern and response result for B-RAF (strong activation, sustained signal) and C-RAF (steep activation, transient signal). We further support the significance of such differential modulatory signaling by showing different RAF isoform expression in various cell lines and experimental testing of the predicted kinase activities in B-RAF, C-RAF as well as mutated versions. Additionally the effect of the tumor suppressor DiRas3 (also known as Noey2 or ARHI) on RAF signaling was studied. I could show that DiRas3 down-regulates the mitogenic pathway by inhibition of MEK, a basis for a refined model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der psychischen Befindlichkeit und anderer gesundheitsbezogenen Konditionen der Frauen und Männer mit familiären Mamma- und Ovarialkarzinomrisiko sowie die Klärung hinsichtlich der Bewältigung und Auswirkung genetischer Risikoinformation. Es wurden Risikowahrnehmung, Informationsstand, Inanspruchnahme der Beratungsangebote sowie der Früherkennungsmaßnahmen, Einstellung gegenüber genetischer Brustkrebsdiagnostik und familiärer/sozialer Kommunikation untersucht. Die vollständig ausgefüllten Fragebögen von Ratsuchenden und Betroffenen, die an der Beratung und Befragung im Zentrum für „Familiären Brust-/Eierstockkrebs“ teilgenommen haben, wurden von uns ausgewertet. Für die beratenden Institutionen ist das Wissen der vielfältigen psychischen und sozialen Folgen bei den Testsuchenden und deren Familien sehr wichtig. Nur so kann das Betreuungskonzept und das Beratungsangebot verbessert werden.