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LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.
Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein.
Soziale Insekten wie die Honigbiene (Apis mellifera) besitzen ein breites Spektrum an Abwehrmechanismen gegen Pathogenbefall, sowohl auf der Ebene der Kolonie (soziale Immunität) als auch auf der Stufe des Individuums (angeborenes Immunsystem). Die Hauptaufgabe der relativ kurzlebigen Drohnen besteht in der Begattung von Jungköniginnen. Daher stellte sich die Frage, ob auch die Drohnen ähnlich den Arbeiterinnen mit energieaufwendigen Immunreaktionen auf Infektionen reagieren. Wie im Folgenden beschrieben, konnte ich nachweisen, dass Drohnen eine ausgeprägte Immunkompetenz besitzen. Das angeborene Immunsystem setzt sich aus humoralen und zellulären Abwehrreaktionen zusammen. Bei der humoralen Immunantwort werden bestimmte evolutionär konservierte Signalkaskaden aktiviert, an deren Ende die Expression einer Vielzahl von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und immunspezifischen Proteinen (IRPs) steht. Zur Analyse der humoralen Immunantwort wurden von mir zum einen Hemmhoftests durchgeführt, um die gesamte antimikrobielle Aktivität der Haemolymphe nach artifizieller Infektion zu ermitteln und zum anderen spezifische AMPs bzw. IRPs identifiziert. Hierzu wurden die Haemolymphproteine in ein- oder zwei-dimensionalen Polyacrylamidgelen aufgetrennt und ausgewählte Proteinbanden bzw. -spots mittels nano HPLC/Massenspektrometrie analysiert. Die Hauptkomponenten des zellulären Immunsystems sind Wundheilung, Phagozytose, Einkapselung und Nodulation. In meiner Arbeit habe ich zum ersten Mal Noduli bei infizierten Drohnen nachweisen können. Frisch geschlüpfte adulte Drohnen (1d) weisen ein breites Spektrum an Immunreaktionen auf, das sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten umfasst. Nach Infektion mit dem Gram-negativen Bakterium E.coli und verschiedenen bakteriellen Zellwandbestandteilen wie Lipopolysaccharid (LPS), Peptidoglycan (PGN) und 1,3ß-Glucan (Bestandteil von Pilzzellwänden), werden die AMPs Hymenoptaecin, Defensin 1 und Abaecin induziert. Desweiteren exprimieren junge adulte Drohnen eine Reihe hochmolekularer immunspezifischer Proteine (IRPs) wie z.B. Carboxylesterase (CE 1), eine Serinprotease, die möglicherweise an der Prozessierung der Prophenoloxidase beteiligt ist, ein Peptidoglycan-interagierendes Protein (PGRP-S2) und zwei Proteine unbekannter Funktion, IRp42 und IRp30. Parallel zu bekannten bienenspezifischen AMPs wurde ein animales Peptidtoxin (APT) in Drohnenlarven, adulten Drohnen und adulten Hummeln nach E.coli Infektion in der Haemolymphe nachgewiesen. Von dem als OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1) benannten Peptid war bereits bekannt, dass es in Fischen paralytische und damit toxische Effekte auslöst. Meine Beobachtungen lassen vermuten, dass es sich bei OCLP 1 um ein Peptidtoxin mit antimikrobiellen Eigenschaften und damit um eine neue Klasse von AMPs handelt. Die allgemeine humorale Immunkompetenz scheint während der gesamten Lebensspanne adulter Drohnen (~ 7 Wochen) konstant zu bleiben, wie durch die gleichbleibende antimikrobielle Aktivität im Hemmhoftest gezeigt wurde. Junge Drohnen reagieren auf eine E.coli Infektion mit der Bildung zahlreicher Noduli (~1000 Noduli/Drohn), die vor allem entlang des Herzschlauches zu finden sind. Diese zelluläre Immunantwort nimmt mit dem Alter der Drohnen ab, so dass bei 18 d alten Drohnen nur noch rund 10 Noduli/Drohn gefunden werden. Auf der anderen Seite nimmt die phagozytotische Aktivität bei älteren Drohnen scheinbar zu. In einer Reihe von parallel laufenden Versuchsreihen konnte ich eindrucksvoll zeigen, dass zelluläre Immunreaktionen wie Phagozytose und Nodulation unmittelbar nach bakterieller Infektion einsetzen. Hierbei erreicht die Nodulibildung 8-10 h p.i. eine Plateauphase, wohingegen die humorale Immunantwort erst 6 h p.i. schwach einsetzt, danach stetig zunimmt und noch 72 h p.i. nachweisbar ist. Es ist mir gelungen, eine Methode zur künstlichen Aufzucht von Drohnenlarven zu etablieren. Diese ermöglichte konstante und sterile Versuchsbedingungen zur Untersuchung der Immunreaktionen von Larven. Nach Infektion mit E.coli reagieren Drohnenlarven mit einer starken Aktivierung ihrer humoralen Immunantwort durch die Expression von AMPs, jedoch werden keine hochmolekularen IRPs wie in adulten Drohnen hochreguliert. Zudem ist die Nodulibildung in Larven nur schwach ausgeprägt. Völlig unerwartete Beobachtungen wurden beim Studium der Immunkompetenz von Drohnenpuppen gemacht. Nach Injektion lebender E.coli Zellen in Drohnenpuppen stellte ich eine dramatische Veränderung im Aussehen der Puppen fest. Die Puppen verfärbten sich gräulich schwarz. Genauere Untersuchungen haben dann gezeigt, dass die Drohnenpuppen, wie auch die der Arbeiterinnen, offensichtlich keine zelluläre Abwehrreaktion aktivieren können und die humorale Immunantwort nur sehr schwach ausfällt und viel zu spät einsetzt.
In dieser Arbeit wurden zwei Aspekte der Yersinia β-Laktamasen bearbeitet: (1) Charakterisierung der β-Laktamasen hinsichtlich β-Laktam-Antibiotikaresistenz, Sekretion und Thermostabilität. (2) Untersuchung der Sekretionsfähigkeit von verschiedenen thermostabilen β Laktamasen über das Yersinia T3SS. Im ersten Teil wurden β Laktamase-Deletionsmutanten im Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm WA-314 hergestellt, um den Einfluss der chromosomalen β Laktamasen auf die in vitro-Resistenz zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass WA-314 konstitutiv BlaA produziert und BlaA somit – unter nicht-induzierbaren Bedingungen – der dominante Faktor in der in vitro-Resistenz gegenüber Penicillinen mit erweitertem Wirkungsspektrum (z.B. Ampicillin) und Cephalosporinen der 1. Generation (z.B. Cefazolin) ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die zweite chromosomale β Laktamase AmpC (BlaB) unter Zugabe von subinhibitorischen Konzentrationen von Imipenem stark induziert wird. Keine der β Laktamasen ist in der Lage, in vitro-Resistenz gegenüber Carbapenemen und Monobactamen zu vermitteln. Die Konstruktion und Bestimmung der in vitro Antibiotika-Empfindlichkeit der β Laktamase-Deletionsmutanten dient als Grundlage für nachfolgende Untersuchungen im Mausinfektionsmodell. Weiterhin wurden die Transporteigenschaften beider β Laktamasen untersucht. In Gram-negativen Bakterien sind reife β Laktamasen im Periplasma lokalisiert und müssen somit nach der Synthese im Cytosol über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Bis auf drei Ausnahmen (β Laktamasen aus Mycobacterium smegmatis, M. tuberculosis und Stenotrophomonas maltophila) sind bisher nur Sec-abhängige β Laktamasen beschrieben worden. Mittels Fusionsproteinen bestehend aus β Laktamase-Signalpeptiden und GFP konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei Yersinia BlaA um ein Tat-Substrat handelt, bei Yersinia AmpC hingegen um ein Sec-Substrat. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine Tat-abhängige β Laktamase bei einer Bakterienart aus der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die β Laktamase BlaA nicht diffus im Periplasma, sondern auf bestimmte Bereiche im Periplasma lokalisiert verteilt ist. Allerdings konnte die Art der Lokalisierung bisher nicht genau spezifiziert werden. Die cytosolische Faltung und die Tat-abhängige Translokation von BlaA lassen vermuten, dass eine besondere Thermostabilität von BlaA vorliegt. Deshalb wurde das BlaA-Enzym hinsichtlich seiner Thermostabilität und temperaturabhängigen enzymatischen Aktivität untersucht. Im Vergleich zur E. coli β Laktamase TEM-1 und der hitzestabilen TEM-1-Variante MEGA zeigte BlaA eine erhöhte Thermostabilität und einen starken Anstieg der Aktivität in einem Temperaturbereich zwischen 30 °C und 45 °C. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob die charakterisierten Yersinia β Laktamasen als Reporterkonstrukte zur Untersuchung des Typ III Sekretionssystems (T3SS) geeignet sind. Y. enterocolitica besitzt ein pYV Virulenzplasmid, auf dem der vollständige Satz der Gene für das Ysc-T3SS und die Effektor-Yops (Yersinia outer protein) lokalisiert sind. Injektion der Yops in eukaryotische Zielzellen ermöglicht das extrazelluläre Überleben der Yersinien im Wirtsorganismus. Bei YopE handelt es sich um ein gut charakterisiertes Effektor-Yop, dessen N Terminus fusioniert an den reifen Teil der β Laktamase TEM-1 bereits vielfach als Reporterkonstrukt eingesetzt wurde. Unter Verwendung des fluoreszierenden β Laktamase-Substrats CCF4-AM kann die Translokation von YopEi-TEM-1 in Zielzellen in Zellkultur-Experimenten und im Mausinfektionsmodell visualisiert werden. In dieser Arbeit sollte deshalb die T3SS-Sekretionsfähigkeit von YopE-β Laktamase-Fusionsproteinen in Abhängigkeit von der „Schmelztemperatur“ (temperaturabhängige Stabilität, TM) untersucht werden. Yop-Substrate werden im ungefalteten Zustand (YscN wirkt dabei vermutlich als ATP-abhängige „Unfoldase“) über das Ysc-„Injektisom“ transloziert. YopEi-TEM-1 wird effizient sekretiert und transloziert (TM (TEM-1) = 50,8 °C). YopE-Fusionsproteine mit thermostabilen TEM-1 Varianten, YopEi-RLT bzw. YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60,4 °C; TM (MEGA) = 69,2 °C) werden hingegen nur schwach bzw. nicht sekretiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sec-abhängige β Laktamase AmpC als YopE-Fusionsprotein (YopEi-AmpC) effizient T3SS-abhängig sekretiert und transloziert werden kann; das native Tat-Substrat BlaA (YopEi-BlaA) kann jedoch weder sekretiert noch transloziert wird. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die ATPase YscN nicht in der Lage ist, BlaA und die thermostabilen TEM-1-Varianten zu entfalten und über das T3SS zu sekretieren und zu translozieren. RLT und MEGA können hingegen mithilfe ihrer nativen Signalsequenz über das Sec-System (und somit im ungefalteten Zustand) transloziert werden.
Durch das Auftreten neuer Stämme resistenter Krankheitserreger ist die Suche nach neuartigen Wirkstoffen gegen diese, sich ständig weiter ausbreitende Bedrohung, dringend notwendig. Der interdisziplinäre Sonderforschungsbereich 630 der Universität Würzburg stellt sich dieser Aufgabe, indem hier neuartige Xenobiotika synthetisiert und auf ihre Wirksamkeit getestet werden. Die hier vorgelegte Dissertation fügt sich hierbei nahtlos in die verschiedenen Fachbereiche des SFB630 ein: Sie stellt eine Schnittstelle zwischen Synthese und Analyse der Effekte der im Rahmen des SFB630 synthetisierten Isochinolinalkaloid-Derivaten. Mit den hier angewandten bioinformatischen Methoden wurden zunächst die wichtigsten Stoffwechselwege von S. epidermidis R62A, S. aureus USA300 und menschlicher Zellen in sogenannten metabolischen Netzwerkmodellen nachgestellt. Basierend auf diesen Modellen konnten Enzymaktivitäten für verschiedene Szenarien an zugesetzten Xenobiotika berechnet werden. Die hierfür benötigten Daten wurden direkt aus Genexpressionsanalysen gewonnen. Die Validierung dieser Methode erfolgte durch Metabolommessungen. Hierfür wurde S. aureus USA300 mit verschiedenen Konzentrationen von IQ-143 behandelt und gemäß dem in dieser Dissertation vorgelegten Ernteprotokoll aufgearbeitet. Die Ergebnisse hieraus lassen darauf schließen, dass IQ-143 starke Effekte auf den Komplex 1 der Atmungskette ausübt – diese Resultate decken sich mit denen der metabolischen Netzwerkanalyse. Für den Wirkstoff IQ-238 ergaben sich trotz der strukturellen Ähnlichkeiten zu IQ-143 deutlich verschiedene Wirkeffekte: Dieser Stoff verursacht einen direkten Abfall der Enzymaktivitäten in der Glykolyse. Dadurch konnte eine unspezifische Toxizität dieser Stoffe basierend auf ihrer chemischen Struktur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten die bereits für IQ-143 und IQ-238 auf Bakterien angewandten Methoden erfolgreich zur Modellierung der Effekte von Methylenblau auf verschiedene resistente Stämme von P. falciparum 3D7 angewandt werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Methylenblau in einer Kombination mit anderen Präparaten gegen diesen Parasiten zum einen die Wirkung des Primärpräparates verstärkt, zum anderen aber auch in gewissem Maße vorhandene Resistenzen gegen das Primärpräparat zu verringern vermag. Somit konnte durch die vorgelegte Arbeit eine Pipeline zur Identifizierung der metabolischen Effekte verschiedener Wirkstoffe auf unterschiedliche Krankheitserreger erstellt werden. Diese Pipeline kann jederzeit auf andere Organismen ausgeweitet werden und stellt somit einen wichtigen Ansatz um Netzwerkeffekte verschiedener, potentieller Medikamente aufzuklären.
Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten.
Der Einfluss des PI3-Kinase Signalwegs auf die Regulation des alternativen HIV-1 prä-mRNA Spleißens
(2013)
In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von HIV-1 basierten Minigenkonstrukten und der proviralen NL4-3 DNA die Einflüsse der PI3K Signalwegmodulation auf das alternative Spleißen der HIV-1 prä-mRNA sowie auf die Virus Replikation untersucht. Mittels RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition im Falle der HIV-1 basierten Minigenkonstrukte in einer erhöhten Abundanz ungespleißter bzw. intronhaltiger mRNAs resultierte, während im Kontext des Virus die Induktion alternativer Tat Transkriptvarianten nachgewiesen werden konnte. Als Folge der Inhibition des PI3K Signalwegs kam es zu einem vermehrten Einschluss der HIV-1 Leader Exone2/2b und 3. Da der Einschluss dieser Exone durch die hnRNP A/B- und F/H-abhängigen Silencer Elemente ESSV und GI2-1 negativ reguliert wird, wurde vermutet, dass die PI3K Inhibition mit der Funktionalität dieser spleißregulatorischen Aktivität interferiert. Unterstützt wurde diese Hypothese durch Replikationsexperimente mit ESSV und GI2-1 Mutanten in Gegenwart und Abwesenheit des PI3K-Inhibitors. Zusätzlich wurde auch der Einfluss des Inhibitors unter Überexpressionsbedingungen von hnRNP H auf das alternative HIV-1 Spleißen analysiert. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition ein verändertes hnRNP H Spleißmuster bedingt sowie die SR-Protein Phosphorylierung und Expression beeinflusst. Des Weiteren war es im Verlauf der vorliegenden Arbeit möglich, eine Interferenz der PI3K Modulation mit der Virus Replikation nachzuweisen. Die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase lies hier nur eine sehr geringe Virus Produktion zu während die PI3K Inhibition diese auf ca. die Hälfte reduzierte. Weiterführende Experimente zeigten, dass die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase den nuklearen Export Rev-abhängiger HIV-1 mRNAs zu blockieren scheint. Darüber hinaus beeinflusste die PI3K Inhibition neben dem alternativen HIV-1 Spleißen auch die virale Transkription sowie die zelluläre Translation. Zusammen könnten diese Effekte die reduzierte virale Replikation erklären. Der PI3K Signalweg spielt somit eine zentrale Rolle bei dem alternativen HIV-1 Spleißen und der viralen Replikation und bietet so die Möglichkeit der Entwicklung neuer Ansätze einer antiviralen Therapie.
Thrombozyten (Blutplättchen) sind die Vermittler der zellulären Hämostase. Ihre Fähigkeit zu Aggregieren und sich an das umgebende Gewebe verletzter Blutgefässe anzulagern, wird durch ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk bestimmt, das sowohl aktivierende, als auch inhibierende Subnetzwerke beinhaltet. Das Verständnis dieser Prozesse ist von hoher medizinischer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die thrombozytäre Signaltransduktion sowohl mittels eines Boole'schen, als auch verschiedener dynamischer Modelle analysiert. Die Boole'sche Modellierung führte zu interessanten Erkenntnissen über das Zusammenwirken einzelner Subnetzwerke bei der Vermittlung irreversibler Plättchenaktivierung und zeigte Mechanismen der Interaktion mit dem hemmenden Prostaglandinsystem auf. Das Modell beinhaltet unter Anderem wichtige Systemkomponenten wie Calciumsignalgebung, Aktivierung von Schlüsselkinasen wie Src und PKC, Integrin-vermitteltes outside-in sowie inside-out Signalgebung und autokrine ADP- und Thromboxan-Produktion. Unter Verwendung dieses Boole'schen Ansatzes wurde weiterhin das System-eigene Schwellenwertverhalten analysiert. Dabei stellte sich eine umgekehrt proportionale Abhängigkeit des relativen aktivierenden Reizes, der notwendig ist um den Schwellenwert zu überschreiten, vom absoluten hemmenden Input heraus. Das System adaptiert demnach an höhere Prostaglandinkonzentrationen durch eine Erhöhung der Sensitivität für Aktivatoren wie dem van-Willebrandt-Faktor und Kollagen, und ermöglicht somit auch unter lokal hemmenden Bedingungen eine Plättchen-vermittelte Hämostase. Der nächste Schritt bestand in der Implementierung eines Differentialgleichungs-basierten Modells der thrombozytären Prostaglandin-Signaltransduktion, um einen detaillierten Überblick über die Dynamik des inhibierenden Netzwerkteils zu erhalten. Die kinetischen Parameter dieses Modells wurden teilweise der Literatur entnommen. Der andere Teil wurde anhand einer umfassenden Kombination dosis- und zeitabhängiger cAMP und phospho-VASP Messdaten geschätzt. Der Prozess beinhaltete mehrere Iterationen aus Modellvorhersagen einerseits und experimentellem Design andererseits. Das Modell liefert die quantitativen Effekte der Prostaglandinrezeptoren IP, DP1, EP3 und EP4 und des ADP-Rezeptors P2Y12 auf die zugrunde liegende Signalkaskade. EP4 zeigt den stärksten Effekt in der aktivierenden Fraktion, wohingegen EP3 einen stärkeren inhibitorischen Effekt ausübt, als der durch Clopidogrel hemmbare ADP-Rezeptor P2Y12. Weiterhin wurden die Eigenschaften des negativen feedback-loops der PKA auf den cAMP-Spiegel untersucht, und eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch die PKA festgestellt, in Form einer Reduzierung der maximalen katalytischen Geschwindigkeit. Die Identifizierbarkeit der geschätzten Parameter wurde mittels profile-Likelihood-Schätzung untersucht. In einem dritten Schritt wurde ein sowohl die aktivierenden, als auch die hemmenden Netzwerkteile umfassendes dynamisches Modell implementiert. Die Topologie dieses Modells wurde in Anlehnung an die des Boole'schen Modells auf der Basis von a priori Wissen festgelegt. Die Modellparameter wurden anhand von Western-Blot, Calcium- und Aggregationsmessungen geschätzt. Auch hier wurde die Identifizierbarkeit der Modellparameter durch profile-likelihood-Schätzung überprüft. Die bei niedrigen Ligandenkonzentrationen auftretende Reversibilität der Plättchen-Aggregation konnte mittels dieses Modells reproduziert werden. Jedoch zeigte sich bei mittleren ADP-Konzentrationen ein Fließgleichgewicht in einem teilweise aktivierten Zustand, und damit kein bistabiles Schwellenwertverhalten. Inwiefern dieses Verhalten durch einen Umgebungs-basierteren Mechanismus des Alles-Oder-Nichts-Verhaltens begründet wird, bei dem der Übergang von reversibler zu irreversibler Aggregation mehr durch parakrine Effekte des gesammten Thrombus bestimmt wird, als durch spezifische Signaltransduktionseigenschaften der einzelnen Zelle, müssen zukünftige Experimente zeigen. Insgesamt geben die erstellten Modelle interessante Einblicke in die Funktionsweise der Thrombozyten und ermöglichen die Simulation von pharmakologischen und genetischen Einflüssen, wie Rezeptormodulationen und knock-outs. Sie geben damit Implikationen zur Entstehung und Behandlung pathophysiologischer Zustände, und wertvolle Denkanstöße für die weitere Forschung.
Für Patienten mit malignem Melanom im Stadium der Fernmetastasierung gibt es bis heute lediglich Therapieoptionen mit sehr eingeschränkten Erfolgsaussichten. Diese Tatsache bestätigt die Notwendigkeit von Biomarkern zur Vorhersage des Erfolgs verschiedener Therapien. Der ATP-basierende ex vivo Chemosensitivitätsassay hat sich als erfolgreiche Methode zur individuellen Vorhersage eines Chemotherapieerfolgs herausgestellt. Tatsächlich zeigte der Assay ein heterogenes Sensitivitätsprofil gegen verschiedene Chemotherapeutika und ließ in getesteten Patienten ein ex vivo wirksames Chemotherapieregime identifizieren, das anschließend auch klinische Therapieerfolge bei Verwendung der Therapie mit dem besten individuellen Chemosensitivitätsindex(BICSI) zeigte. Um diesen sehr aufwendigen Assay zukünftig zu umgehen, sollten in der vorliegenden Arbeit prädiktive molekulare Biomarker der Chemosensitivität identifiziert werden. Hierfür wurden im Voraus durch einen Microarray die Kandidaten Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LOXL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicle-associated membrane protein 5 (VAMP5) und Serine protease inhibitor B1 (SERPINB1) als differentiell exprimierte Gene in chemosensitivem gegenüber chemoresistentem Gewebe identifiziert. Die relative Expression dieser Kandidatengene wurde daraufhin in bis zu 128 verschiedenen Melanomgeweben mit dem Chemosensitivitätsindex verschiedener Chemotherapeutika korreliert. Hierbei konnte eine signifikante Korrelation zwischen SerpinB1 mit der Chemosensitivität gegenüber der Therapiekombination mit Paclitaxel und Cisplatin auf Gen- aber nicht auf Proteinebene identifiziert werden. Weiterhin konnte eine differentielle Expression ebenfalls in chemosensitiven und -resistenten Melanomzelllinien nachgewiesen werden, die allerdings im Vergleich mit dem analysierten Gewebe in gegensätzlicher Richtung verlief. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SerpinB1 ein vielversprechender Marker für die Chemosensitivität gegenüber Paclitaxel und Cisplatin ist, dessen funktionelle Bedeutung aber unklar bleibt. Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und hoch aggressiver Tumor der mit dem Merkelzellpolyomavirus (MCV) in Zusammenhang steht. Da MCC Zelllinien zur Aufrechterhaltung ihrer Viabilität die MCV T-Antigene benötigen, könnte der Einsatz von Interferonen (IFN) ein möglicher therapeutischer Ansatz zur Behandlung dieser Krebserkrankung sein. In der vorliegenden Arbeit haben wir daher die Effekte von IFNs auf MCC Zelllinien, mit besonderer Berücksichtigung der MCV+ Linien, untersucht. IFNs vom Typ I (hier Multiferon, ein Mix verschiedener IFN α Subtypen, und IFN β) wirkten stark inhibierend auf die zelluläre Viabilität. Die Zellzyklusanalyse zeigte eine Erhöhung des sub-G Anteils der Zellen nach Behandlung mit IFN, was auf Apoptose als ausschlagebenden Grund schließen ließ. Diese Effekte waren für die Behandlung mit IFN β weniger stark ausgeprägt. Der inhibitorische Effekt von Typ I IFNs auf MCV+ MCC Zelllinien war assoziiert mit einer verringerten Expression des viralen großen T-Antigens (LTA) und einer Erhöhung in der Expression von promyelocytic leukemia protein (PML), das dafür bekannt ist, die Funktion des LTA störend zu beeinflussen. Zusätzlich führte die intratumorale Anwendung von Multiferon in vivo zu einer Regression im Wachstum von MCV+, aber nicht MCV- MCC Xenotransplantaten. Die Ergebnisse zeigen das Typ I IFNs einen starken antitumoralen Effekt haben, der zum Teil durch die Regulierung des LTA herbeigeführt wird. Neben diesen direkten Effekten der IFNs auf die Zellproliferation induzieren diese auch die Expression von MHC Klasse I Molekülen in MCC Zelllinien. Die Durchflusszytometrie zeigte eine Induktion der MHC Klasse I Expression in drei MHC I negativen MCC Zelllinien und eine Erhöhung der Expression, die vor der Behandlung eine geringe Menge an MHC I aufwiesen. Diese Effekte konnten auch in den in vivo Xenotransplantaten beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit IFN sowohl direkte als auch indirekte Effekte auf das MCC hat und eine breite Anwendung in Patienten mit MCV+ und MCV- Tumoren finden kann. Neben IFNs sind auch Artemisinin und seine Derivate bekannt für ihre antitumoralen und antiviralen Eigenschaften. Daher haben wir den Effekt des Artemisininderivats Artesunate auf MCV+ und MCV- MCC Zelllinien getestet. Tatsächlich konnten wir auch hier einen antiproliferativen Effekt des Stoffes nachweisen, der stärker auf MCV+ als auf MCV- Zelllinien wirkte und bei ersteren wiederum mit einer reduzierten LTA Expression einherging. Im Vergleich dazu blieben Fibroblasten von der Behandlung unbeeinflusst. Das verringerte Tumorwachstum konnte ebenfalls für in vivo Xenotransplantationsmodelle gezeigt werden. Auf Grundlage dieser Erkenntnis sollte eine genauere Untersuchung dieses alten Naturheilstoffes für die Behandlung von MCC Patienten in Betracht gezogen werden.
p21-aktivierte Kinasen regulieren zahlreiche zelluläre Prozesse, die während der Entwicklung, aber auch beispielsweise bei der Krebsentstehung, von zentraler Bedeutung sind. Mbt, das einzige Typ II PAK-Protein von Drosophila melanogaster, spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Eine Nullmutation von mbt, mbtP1, bildet kleinere Gehirne mit stark verkleinerten Pilzkörpern aus. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Mbt in Neuroblasten untersucht. Mbt wurde als Teil des apikalen Proteinkomplexes in Neuroblasten des Zentralhirns nachgewiesen. Die apikale Lokalisation von Mbt ist Zellzyklus-abhängig und wird über Bindung an Cdc42 reguliert. Sie ist essentiell für die Funktion von Mbt in Neuroblasten. Trotz apikaler Mbt-Lokalisation in Neuroblasten zeigte die mbt Nullmutante keine Defekte des basalen Mechanismus der asymmetrischen Zellteilung. Mud zeigte geringfügige Lokalisationsveränderungen, die auf einen möglichen Einfluss von Mbt hinweisen. Obwohl PAKs zentrale Regulatoren des Zytoskeletts sind, zeigte die mbtP1 Mutante keine offensichtlichen Veränderungen des Aktin- und Tubulin-Zytoskeletts. Armadillo, ein Aktin-assoziiertes Mbt-Substrat, zeigte ebenfalls keine Lokalisationsveränderung in Neuroblasten. Mbt steuert jedoch die apikale Anreicherung von Cno, einem weiteren Aktin-assoziierten Protein, in Neuroblasten. Darüber hinaus beeinflusst Mbt die Zellgröße von Neuroblasten, sowie deren Proliferationspotenzial und Überleben. mbtP1 Neuroblasten sind kleiner als wildtypische Neuroblasten, haben ein geringeres Proliferationsvermögen und eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit. Der Zelltod von Neuroblasten ist jedoch ein sekundärer Effekt. Daher kann eine Blockierung von Apoptose den adulten Pilzkörperphänotyp nicht retten. Signalwege, die Zellgröße und Proliferation regulieren, wurden auf eine Beteiligung von Mbt hin analysiert. mbtP1 induzierte leichte Effekte im Insulin-Signalweg und die Delokalisation eines nukleolären Proteins. Eine genetische Interaktion von mbtP1 mit Mutationen in Genen des klassischen MAPK-Signalweges identifzierte mbt als Positivregulator dieses Signalweges im Auge. Ein ähnlicher, schwächerer Effekt wurde auch bzgl. der Proliferation und Größe von Neuroblasten beobachtet. Eine 2D-Gelanalyse von Larvengehirnen identifizierte Bic und Hsp83 als mögliche von Mbt regulierte Proteine. Diese Arbeit charakterisiert eine bisher unbekannte Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in neuronalen Stammzellen und liefert damit Ansatzpunkte für eine detaillierte Aufklärung der Funktionsmechanismen von Typ II PAKs bei der Regulation von Zellproliferation und Überleben