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Analyse der Immunglobulinrepertoire-Veränderungen in B Zellen von Kindern mit Autoimmunerkrankungen
(2006)
B Zellen sind die zellulären Träger einer gegen Infektionserreger gerichteten, humoralen und protektiven Immunität. In der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und in der Aufrechterhaltung von chronischen Entzündungen scheint diesen Zellen eine entscheidende Rolle zuzukommen. In dieser Arbeit wurden in B Zellen von Patienten mit rheumatischen Erkrankungen molekulare Mechanismen untersucht, die es der B Zelle außerhalb des Knochenmarkes erlauben, ihre Rezeptorspezifität zu verändern. Ein solcher Vorgang könnte Verschiebungen des Immunglobulinrepertoires in Richtung Autoreaktivität erklären.
Der ubiquitär vorkommende Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist Haupterreger der invasiven Aspergillose (IA). Diese invasive Pilzinfektion tritt gehäuft bei Patienten mit immunsuppressiver Langzeit-Therapie z. B. nach allogener Stammzelltransplantation zur Prophylaxe und Therapie der Graft-versus-Host-Disease (GvHD) auf. Trotz der in-vitro-Suszeptibilität der Pilze gegenüber verschiedenen Antimykotika ist die Erkrankung in diesem Patientenkollektiv weiterhin mit einer hohen Letalität assoziiert. Neben ihren direkten, antifungalen Eigenschaften wurden durch Antimykotika auch indirekte, modulierende Wirkungen auf die Funktionalität von Immunzellen beschrieben, die damit möglicherweise das therapeutische Ansprechen dieser Erkrankung beeinflussen. Insbesondere neutrophile Granulozyten (PMN) spielen als Teil der angeborenen Immunität durch ihre Vielzahl an Abwehrmechanismen eine essentielle Rolle für die Bekämpfung von invasiven Pilzinfektionen und damit der IA. Von zusätzlicher Bedeutung und bislang kaum untersucht ist das kombinierte Einwirken von Antimykotika und Immunsuppressiva auf die Funktionalität dieser Zellen.
In dieser Arbeit wurde daher in-vitro der Einfluss klinisch eingesetzter Antimykotika zur Therapie der IA (liposomales Amphotericin B bzw. Amphotericin B – Desoxycholat, Voriconazol) auf wichtige Effektorfunktionen humaner neutrophiler Granulozyten nach Exposition gegenüber A. fumigatus untersucht. Im Fokus stand hierbei die Analyse des oxidativen Burst, der Interleukin (IL)-8-Freisetzung, der Bildung von neutrophil extracellular traps (NETs) sowie der Phagozytose-Aktivität dieser Immunzellen. Außerdem wurde der Effekt einer zusätzlichen Gabe klinisch relevanter Immunsuppressiva (Ciclosporin A / Mycophenolat-Mofetil, Prednisolon), die zur Prophylaxe und Therapie der akuten GvHD eingesetzt werden, auf diese vier Funktionen evaluiert.
Zusammenfassend ergaben unsere Analysen keinen Anhalt für eine relevante Beeinflussung des oxidativen Burst, der IL-8-Freisetzung und der Phagozytose-Aktivität neutrophiler Granulozyten durch die untersuchten Antimykotika, insbesondere gegenüber A. fumigatus. Weiterhin wurden in dieser Arbeit keine signifikanten Differenzen zwischen dem Einfluss von liposomalem Amphotericin B und Amphotericin B - Desoxycholat beobachtet. Durch Prednisolon konnten überwiegend bereits bekannte, immunsuppressive Wirkungen auf PMN bestätigt sowie zusätzlich Hinweise auf eine Modulation Antimykotika-vermittelter Immuneffekte durch Immunsuppressiva gewonnen werden. Die kurze Exposition der PMN gegenüber Ciclosporin A / Mycophenolat-Mofetil ergab keine signifikanten Veränderungen der Sekretion von reaktiven Sauerstoffspezies.
Des Weiteren unterstützen unsere Daten Hinweise auf differente Aktivierungsmechanismen von verschiedenen Effektorfunktionen der PMN. Im Gegensatz zu den anderen untersuchten Funktionen konnte in dieser Arbeit eine signifikant verminderte Bildung von NETs durch liposomales Amphotericin B, Amphotericin B - Desoxycholat und auch Voriconazol beobachtet werden. Damit geben unsere Ergebnisse Anlass zu tiefergehenden Analysen des Zusammenspiels von Antimykotika insbesondere mit dem noch immer wenig verstandenen Mechanismus der Auslösung und Bildung von NETs. Zudem wären weitere Studien wünschenswert, um einen umfassenderen Überblick und ein besseres Verständnis auch hinsichtlich anderer invasiver Pilzinfektionen sowie weiterer Abwehrmechanismen zu erhalten.
Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erfüllt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilität und anti-apoptotische Funktion von A1 wird über den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch für den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminosäuren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilität und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gewählt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, während eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht möglich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in Stärke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es müssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein für den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilität als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anhängt und das Protein damit für den proteasomalen Abbau markiert.
Der humanpathogene Schimmelpilz A. fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ein hohes Risiko eines letalen Krankheitsverlaufs durch das Auslösen einer invasiven Aspergillose (IA) birgt. Bei der IA handelt es sich um eine Infektion des Lungengewebes, welche hauptsächlich immunsupprimierte Menschen befällt. A. fumigatus stellt die Ursache für diese infektiöse Komplikation dar, welche von einem intakten Immunsystem in der Regel problemlos abgewehrt wird. Eine wichtige Abwehrbarriere gegen den Pilz setzt sich aus Zellen des angeborenen Immunsystems zusammen. In der vorliegenden Arbeit waren in diesem Zusammenhang natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und dendritische Zellen (DCs) von besonderer Relevanz. NK- Zellen schütten lösliche Faktoren aus, welche als antifungale Mediatoren agieren. DCs besitzen hingegen die Fähigkeit, Pilzmorphologien zu phagozytieren. Im Anschluss an die Interaktion mit dem Pilz sekretieren beide Zelltypen Zytokine, welche wiederum weitere Immunzellen stimulieren. Besonders den DCs wird eine wichtige Funktion in der Immunabwehr gegen A. fumigatus zugeschrieben, da ihre Fähigkeit, das angeborene mit dem adaptiven Immunsystem zu verknüpfen, von großer Bedeutung ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktionen von primären Monozyten abgeleiteten DCs (moDCs) und NK-Zellen mit dem Pilz A. fumigatus in vitro zu charakterisieren. Hierfür wurden mit der Methode des Live-imaging verschiedene Experimente durchgeführt, um den reziproken Einfluss der zwei Immunzellarten in Anwesenheit von A. fumigatus zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl moDCs, als auch NK-Zellen mit dem Pilz interagieren. Neben NK-Zell-moDC-Interaktionen wurden auch Interaktionen mit den einzelnen Immunzelltypen und A. fumigatus beobachtet. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die NK-Effektormoleküle IFN-ɣ, Granzym B und Perforin stimulierend auf moDCs wirken, was in einer erhöhten Zellaktivierung und einer in der Folge gesteigerten Kontaktanzahl zum Pilz resultierte.
Die invasive Aspergillose stellt eine ersthafte Erkrankung sowie auch eine signifikante Ursache von Morbidität und Mortalität bei verschiedenen Patientengruppen dar. Dabei tritt sie hauptsächlich durch den opportunistischen Pathogen Aspergillus fumigatus hervorgerufen mit einer Inzidenz von 4% bis 15% vorwiegend bei immunsupprimierten Patienten nach allogenen hämatopoetischer Stammzelltransplantationen (HSCT) oder Organtransplantationen auf und führt bei 40% bis 90% der Fälle zum Tod des Patienten. Die Behandlung dieser Hochrisikogruppe erfolgt bestenfalls mit Antimykotika prophylaktisch, denn eine schnelle sowie auch verlässliche Diagnose von invasiver Aspergillose läßt sich aufgrund der hohen zeitlichen Latenz des Pilzes und dem Defizit an Sensitivität bzw. Spezifität in vielen Fällen nicht ermitteln. Zusätzlich steigt die Zahl der Resistenzen von Aspergillus-Stämmen gegen die verschiedenen Antimykotika stetig an, so dass klinische und ökonomische Nebenwirkungen unvermeidbar sind. Als Alternative zur konventionellen Behandlung mit Azolen stellt eine Immuntherapie mittels Antigen-behandelten dendritischen Zellen (DCs) dar, welche durch Präsentation von Aspergillus fumigatus-Antigenepitopen eine spezifische ex vivo T-Zellenexpansion von allogenen CD8+CD3+ T-Zellen bewirken kann und damit ein schonenderes Mittel für den Patienten ist. Dazu wurden sieben verschiedene rekombinante Proteine aus A. fumigatus in dieser Arbeit charakterisiert und deren Potential ermittelt, bei DCs eine pro-inflammatische Immunantwort auszulösen. Es stellte sich heraus, dass sowohl die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1) als auch die myceliale Katalase Cat1 in der Lage waren, den nukleären Faktor kappa B (NFκB) zu aktivieren und eine Translokation der Untereinheit p65 in den Nukleus zu induzieren, woraufhin Gene von pro-inflammatorischen Zytokine und Chemokine sowie auch von Aktivierungs- und Reifungsmarker der DCs exprimiert wurden. Im Gegensatz zum Aspf1, war es beim Cat1 zusätzlich auch möglich gewesen eine Verifizierung auf Proteinebene für segregierte Zytokine und Chemokine bzw. Oberflächenmarker zu erhalten. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass die Zytotoxizität von Cat1 entsprechend der unbehandelten Zellen gewesen ist und dass es den Cat1-behandelten moDCs gelang nach der Aufnahme des Antigens und dessen Prozessierung durch die darauffolgende Präsentation der Proteinepitope über den MHC II Komplex eine ex vivo-Aktivierung von autologen zytotoxischen T-Zellen zu erreichen. Damit ist nun ein potentieller Kandidat für eine auf Immuneffektorzellen basierte Immuntherapie gegen invasive Aspergillose für immungeschwächte Patienten gefunden. Ergänzt wurde diese Arbeit mit der experimentellen Untersuchung von Hämostase während einer invasiven Aspergillose, da gehäuft pathologische Beobachtungen von lokalen Einblutungen bei Patienten mit pulmonaler Aspergillose verzeichnet wurden. Es stellte sich heraus, dass die durch Collagen induzierte Aggregation sich durch aktive Pilzmorphologien beeinträchtigen läßt, wohingegen die untersuchten Gerinnungsparameter nicht betroffen gewesen sind. Dies verdeutlicht neben der bereits bekannten Bedeutung der Thrombozyten als antimikrobielle Komponente im Blut nun auch ihrer Empfindlichkeit gegenüber sezernierten oder Zellwand-gebundenen Aspergillus fumigatus-Faktoren während der invasiven Aspergillose.
Die Kernhülle ist eine hoch spezialisierte Membran, die den eukaryotischen Zellkern umgibt. Sie besteht aus der äußeren und der inneren Kernmembran, die über die Kernporenkomplexe miteinander verbunden werden. Die Kernhülle reguliert nicht nur den Transport von Makromolekülen zwischen dem Nukleoplasma und dem Zytoplasma, sie dient auch der Verankerung des Chromatins und des Zytoskeletts. Durch diese Interaktionen hilft die Kernhülle, den Zellkern innerhalb der Zelle und die Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu positionieren, und reguliert dadurch die Expression bestimmter Gene. In höheren Eukaryoten durchlaufen sowohl die Kernhülle, als auch die Kernporenkomplexe während der Zellteilung strukturelle Veränderungen. Zu Beginn der Mitose werden sie abgebaut, um sich am Ende der Mitose in den Tochterzellen erneut zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die zum Wiederaufbau der Kernhülle führen, sind kaum geklärt. Ein geeignetes System, um bestimmte Ereignisse bei der Kernhüllenbildung zu untersuchen, liefert das zellfreie System aus Xenopus Eiern und Spermienchromatin (Lohka 1998). Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass es im Eiextrakt von Xenopus laevis mindestens zwei verschiedene Vesikelpopulationen gibt, die zur Bildung der Kernhülle beitragen. Eine der Vesikelpopulationen bindet an Chromatin, fusioniert dort und bildet eine Doppelmembran. Die andere Vesikelpopulation bindet an die bereits vorhandene Doppelmembran und sorgt für die Ausbildung der Kernporenkomplexe. Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Membranfraktionen zu isolieren und zu charakterisieren, wobei das Hauptinteresse in der porenbildenden Membranfraktion lag. Durch Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Zuckergradienten konnten die Membranvesikel in zwei verschiedene Vesikelfraktionen aufgetrennt werden. Eine Membranfraktion konnte aus der 40%igen Zuckerfraktion („40% Membranfraktion“) isoliert werden, die andere aus der 30%igen Zuckerfraktion („30% Membranfraktion“). Die verschiedenen Membranfraktionen wurden zu in vitro Kernen gegeben, in denen die Kernporen durch vorausgegangene Bildung von Annulate Lamellae depletiert worden waren. Nach Zugabe der 30% Membranfraktion konnte die Bildung von funktionalen Kernporen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die 40% Membranfraktion keine porenbildenden Eigenschaften. Unter Verwendung eines vereinfachten Systems, bestehend aus Zytosol, Spermienchromatin und den Membranen, wurde gezeigt, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und ausreichend ist, um eine kontinuierliche Doppelmembran ohne Kernporen zu bilden. Die 30% Membranfraktion besitzt keine Chromatinbindungseigenschaften und wird aktiv entlang von Mikrotubuli zu den porenlosen Kernen transportiert. Dort interagiert sie mit der chromatingebundenen 40% Membranfraktion und induziert die Porenbildung. Nach dem Vergleich der Proteinzusammensetzung der beiden Membranfraktionen, konnte das Major Vault Protein (MVP) nur in der porenbildenden Membranfraktion gefunden werden. MVP ist die Hauptstrukturkomponente der Vault-Komplexe, einem Ribonukleo-proteinpartikel, der in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden ist (Kedersha et al., 1991). Bemerkenswerterweise wird über die Funktion der Vault-Komplexe, trotz ihrer übiquitären Expression und ihrem Vorkommen in fast allen eukaryotischen Zellen, immer noch diskutiert. Um mehr über die Funktion und die Lokalisation der Vaults/MVP zu lernen, wurden die Vaults in Anlehnung an die Methode von Kedersha und Rome (1986) aus Xenopus Eiern isoliert. Zusätzlich wurde rekombinantes Xenopus MVP hergestellt, das unter anderem für die Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet wurde. Um herauszufinden, ob die Anwesenheit von MVP in der 30% Membranfraktion in direktem Zusammenhang mit deren porenbildender Eigenschaft steht, wurden gereinigte Vault-Komplexe oder rekombinantes MVP, das alleine ausreichend ist, um in sich zu den charakteristischen Vault-Strukturen zusammenzulagern, zu porenlosen Kernen gegeben. Sowohl gereinigte Vault-Komplexe, als auch rekombinantes MVP waren in der Lage in den porenlosen Kernen die Bildung von funktionalen Kernporen zu induzieren. Untersuchungen zur Lokalisation von MVP zeigten, dass MVP teilweise an der Kernhülle und den Kernporenkomplexen lokalisiert, während der Großteil an MVP zytoplasmatisch vorliegt. Dies sind die ersten Daten, die Vaults/MVP mit der Kernporenbildung in Verbindung bringen. Deshalb bietet diese Arbeit die Grundlage, um diese unerwartete Rolle der Vaults in Zukunft genauer zu charakterisieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Lebensqualität nach Stapesoperation bei Patienten mit Otosklerose untersucht. Die Otosklerose ist eine Erkrankung, bei der es durch eine Fixierung des Stapes zu einer Schallleitungsschwerhörigkeit kommt. Durch eine Stapesoperation (Stapedotomie bzw. Stapedektomie) kann die Schallübertragung und damit das Hörvermögen verbessert werden. In sehr verschiedenen Lebensbereichen sind die Patienten zuvor eingeschränkt und können durch ihre otosklerotisch bedingte Hörminderung nicht mehr wie gewohnt am Leben teilnehmen. Oftmals handelt es sich um einen langjährigen Prozess, bis die Patienten Hilfe bekommen und etwas an ihren erschwerten Lebensumständen geändert werden kann. Die Untersuchung zeigt, dass die Patienten zum größten Teil, mit 82,7%, ihre Lebensqualität positiv bewerten. Die Hörfähigkeit konnte in 81,8% der Fälle verbessert werden. 70,9% der Patienten bezeichnen ihr Hörvermögen jetzt als gut. Nach der Operation schätzen die Patienten ihr Hörvermögen erheblich besser ein als vor der Operation. In Alltagsituationen kommen sie besser zurecht. Im Radio und Fernsehen verstehen sie wieder besser, die Kommunikation mit anderen Menschen fällt ihnen leichter oder ist wieder möglich. Sowohl in normaler Umgebung als auch in geräuschvoller Umgebung, wie auf lauten Feiern, kommen die Menschen besser zurecht. Ebenso das Telefonieren funktioniert besser. Die Menschen haben das Gefühl, wieder richtig am Leben teilnehmen zu können. Sie können sich ohne Hindernisse mit ihren Mitmenschen austauschen. Sie haben nicht mehr das Gefühl, dass sie von einem Gespräch nur die Hälfte mitbekommen und Wesentliches verpassen. In der Gesellschaft können sie wieder mit mehr Sicherheit auftreten und müssen sich nicht mehr zurückziehen. Sie können sich wieder unter ihre Mitmenschen begeben und sich dabei wohl fühlen. Bei sehr wenigen Patienten traten massive Komplikationen auf. Sie haben ihr Hörvermögen verloren und sind ertaubt. Das wirkt sich verständlicherweise negativ auf die Bewertung ihrer Lebensqualität aus. Die Einschätzung der Lebensqualität ist abhängig von der Operationsmethode nicht verschieden.
Hintergrund:
Im Zuge einer akuten Herzinsuffizienz kommt es auf Grund der Ischämie und Reperfusionsschäden (IR) zur Verschlechterung der Herzfunktion. Studien bezüglich einer 15- und 20 minütigen Ischämie haben für den Phosphodiesterase3-Hemmer Enoximon bereits einen positiven Einfluss auf die Myokard- und Mitochondirenfunktion aufzeigen können. Ob diese Ergebnisse auch unter längerer Ischämiezeit reproduzierbar sind, war Gegenstand dieser Arbeit.
Material und Methoden:
4 Gruppen wurden bezüglich ihrer Ergebnisse im Zuge einer retrograden Perfusion von Rattenherzen innerhalb der Langendorff-Apparatur verglichen. Allen Gruppen war eine 30-minütige Perfusion gemein. Als Kontrollgruppe diente IR0/30. Die Gruppen unterschieden hinsichtlich der Verwendung einer 40-minütigen Ischämiezeit vor Reperfusion (IR40/30) sowie dem Gebrauch von Enoximon mit (Enox-IR40/30) und ohne Ischämie (Enox-IR0/30). Im Rahmen des Langendorff-Versuchs wurde der linksventrikuläre Druck (LVPsys), der Koronarfluss, die Kontraktilität (LVdp/dtmax) sowie Herzenzyme bestimmt. Zur Bestimmung der Mitochondrienfunktion wurden die IFM und SSM isoliert und hinsichtlich der Atmungskettenfunktion (RCF) sowie der mPTP-Öffnung untersucht.
Ergebnisse:
Unter IR kam es zu einem Abfall des LVPsys (p<0,01), LVdp/dtmax (p<0,004) sowie des Koronarflusses (p=0,01). Es war eine verstärkte Schwellung der Mitochondrien im Rahmen der mPTP-Öffung für IFM (p=0,01) und SSM (p<0,0001) erkennbar. Die Konzentrationen der Herzmarker GOT und hFABP stiegen an. Für Troponin T, CK und CK-MB fand sich kein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe.Die Komplexaktivität der IFM war in den Komplexgruppen II-V (p<0,0001), II-IV (p<0,0001), III-V (p=0,004) und IV (p<0,0001) verringert. In SSM zeigte sich ein Aktivitätsabfall im Komplex IV (p=0,05).
Enoximon hatte unter Ischämie keinen Einfluss auf die hämodynamischen Parameter. Gegen Ende der Messung kam es zu einem geringen Anstieg der mPTP-Öffnung der SSM (p=0,05). Die Konzentration an hFABP war verringert. Die Komplexaktivität der IFM stieg in den Komplexgruppen I-V (p=0,01), II-V (p=0,04), II-IV (p=0,02) und IV (p=0,02) gegenüber IR40/30 an. In nicht-ischämischen Myokard (Enox-IR0/30) zeigte Enoximon einen Anstieg des LVdp/dtmax (p<0,02) und verringerte die Konzentration an TroponinT (p<0,02). Während die Komplexaktivität der IFM in I-V anstieg (p=0,01), zeigte diese sich in II-V (p=0,04) und III-V (p=0,009) abgeschwächt. Für SSM war am Ende der Messung ein geringer Anstieg der mPTP- Öffnung erkennbar (p<0,04).
Diskussion:
IR-Schäden verschlechtern die Herzleistung, führen zu einer Reduktion der Mitochondrienfunktion sowie gesteigerter Vulnerabilität der Mitochondrien im Zuge der mPTP-Öffnung. Während Studien mit kürzer Ischämiezeit für Enoximon eine Verbesserung des LVPsys, LVdp/dtmax und Koronarflusses aufzeigen konnten, waren unter 40minütiger Ischämie kein Einfluss von Enoximon mehr erkennbar. Es ließ sich unter Ischämie für Enoximon jedoch ein positiver Einfluss auf die Atmungskettenkomplexe der IFM nachweisen. Gleichzeitig war in nativem Myokard ein Anstieg des LVdp/dtmax unter Enoximon erkennbar. In Zuge von IR-Schäden scheint somit die Wirksamkeit von Enoximon stark von einem frühen Applikationszeitpunkt abhängig zu sein.
Die Hämophilie A ist mit einer Inzidenz von 1:5000-1:10000 bei männlichen Neugeborenen die häufigste genetisch bedingte Form einer schweren Blutungsneigung. In Deutschland leben zur Zeit ca. 6000 Hämophilie-A-Patienten. Das klinische Erscheinungsbild, die verschiedenen Phänotypen dieser Erkrankung werden durch ein defektes oder ein gar nicht vorhandenes FVIII-Protein, kodiert durch das FVIII-Gen, festgelegt. Zielsetzung der Arbeit war ein Mutationsprofil für schwere und nicht schwere Hämophilie zu erstellen. Die ermittelten Daten sollten der internationalen Datenbank HAMSTeRS und der kürzlich erschienenen Arbeit von Dr. J. Schröder gegenübergestellt werden. Zudem sollten wissenschaftlich interessante Zusammenhänge wie Verteilung der Mutation im FVIII-Gen und Mutationshotspots untersucht werden. Kennt man die Ursache der Mutation, kann man sich aufgrund bisheriger Erkenntnisse eine Vorhersage über den Krankheitsverlauf, wie Schweregrade und Hemmkörperentwicklung erlauben. Die Daten wurden mittels Microsoft Access verarbeitet. Diese Studie umfasste 1492 Hämophilie-A-Patienten. Bei 1422 (95,3%) konnte die krankheitsauslösende Mutation gefunden werden. Die häufigste Mutation bezogen auf alle Patienten war die Missensemutation mit 38,4% gefolgt von der Intron-22-Inversion mit 20,7%. Bezüglich der Schweregrade war die Intron-22-Inversion die häufigste Ursache (47,1%) einer schweren Verlaufsform der Hämophilie und die Missensemutation die häufigste Ursache (93%) der leichten Form der Hämophilie. 18,1% der Patienten mit schwerer Hämophilie entwickelten einen Hemmkörper. Es wurden 3 Hotspots gefunden, von denen die Intron-22-Inversion mit 29,7% den grössten Anteil ausmacht, gefolgt von den Mutationen an den CpG-Diknukleotiden mit 16,8% und kleinen Deletionen/Insertionen an Adenin Folgen mit 3,5%. Verglichen mit HAMSTeRS entsprachen unsere Ergebnisse, bis auf die Stopmutationen, relativ gleichmässig denen der internationalen Datenbank. Auch die Korrelation Genotyp-Phänotyp stimmte fast immer zu ca. 90% oder mehr als 90% überein. Wie zu erwarten entsprach unser Mutationsprofil auch dem der Arbeit von Dr. Schröder. Einzig die Intron-1-Inversion trat in unserer Studie häufiger auf, was an der Einführung der Intron-1-PCR als neue Screeningmethode liegt. Die Verteilung der Schweregrade korrelierte auch mit Dr. Schröders Arbeit. Das Aufstellen von Mutationsprofilen hat zum besseren Verständnis der Ätiologie und zum Krankheitsverlauf der Hämophilie A beigetragen. Die systematische Erfassung aller Krankendaten erleichtert dem Gesundheitswesen eine bessere Planung für die Bereitstellung von Mitteln für die Hämophilie. Im Einzelnen betrifft dies: Beratungstermine für schon betroffene Überträgerinnen, wie auch pränatale Diagnostik, allgemeine Konduktorinnendiagnostik, sowie psychische Beratung und Unterstützung. Für die Hämophiliepatienten bedeutet dies eine Verbesserung der Therapie und eine bessere Vorhersage bezüglich der Hemmkörperentwicklung.
In Lymphozyten wird nach Antigenaktivierung die Expression des Nfatc1-Gens durch Aktivierung des P1-Promoters stark induziert. Dagegen ist die, durch den Promoter P2 vermittelte Expression ebenso wie die der anderen NFAT Faktoren c2 und c3 konstitutiv. Die Akkumulation der dabei gebildeten Isoform NFATc1/αA ist sowohl für Effektorfunktionen wie die Zytokinproduktion sowie die Proliferation und das Überleben der aktivierten Zellen wichtig (Chuvpilo et al., 2002). Um die Expression des Nfatc1-Gens auf Einzelzellebene messen zu können, wurden BAC (bacterial artificial chromosom) transgene Mauslinien generiert, die einen 210kb großen Bereich des Nfatc1-Gens der Maus enthalten. In diesen Lokus wurde ein eGFP-Reportergen innerhalb des allen Isoformen gemeinsamen, dritten Exons integriert. In dieser Arbeit wird durch semiquantitative RT-PCR-Experimente von Gesamt-Milzzellen und TLymphozyten gezeigt, dass in den B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen die Expression der eGFP-cDNA analog zum endogenen Nfatc1-Lokus der Kontrolle der beiden Promotoren P1 und P2 unterliegt. In Western Blot Experimenten wird in diesen Zellen mittels eines NFATc1α-spezifischen Antikörpers eine induzierbare und CsA-sensitive α-GFP-Isoform - vergleichbar mit der endogenen NFATc1α-Isoform - nachgewiesen. Gleichzeitig zeigen NFATc1-Antikörper das konstitutiv exprimierte GFPβ-Protein. Die Korrelation der Expression von NFATc1 und GFP auf mRNA- und Proteinebene machen in B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen das GFP-Protein somit zu einem sensitiven und spezifischen Marker der NFATc1-Aktivität. In FACS-Analysen gibt der Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität bei Stimulation von Gesamt- Milzzellen bzw. T-Lymphozyten um bis auf das Dreifache die Induktion von NFATc1 wider. Unter dem Einfluss von CsA verbleibt die GFPFluoreszenzintensität auf dem Niveau unstimulierter Zellen. Die GFPFluoreszenz korreliert darüber hinaus bei Primärstimulation mit der Expression des IL-2-Gens, dessen Promotor mit 5 NFAT-Bindestellen den Prototyp eines NFATc1-Targets darstellt (Serfling et al., 1989). Die Analyse der Koexpression von NFATc1 und GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt in allen stimulierten, GFP-positiven CD4+-Lymphozyten die nukleäre Lokalisation von 75 NFATc1, vor allem von NFATc1α. Die Analyse des GFP-Phänotyps in alloreaktiven T-Zellen zeigt bei Abstoßungsreaktionen in vitro („Mixed Lymphocyte Reactions“) eine selektive Zunahme der Fluoreszenz dieser Zellen um bis auf das Vierfache, was die Rolle von NFATc1 für die Effektorfunktion aktivierter T-Lymphozyten verdeutlicht. GFP und das endogene NFATc1 werden bei Stimulation konventioneller T-Zellen (Tcons, CD4+CD25-FoxP3-) stark exprimiert, während natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs, CD4+CD25+FoxP3+) konstant geringe NFATc1- und GFP-Konzentrationen zeigen. In induzierten regulatorischen T-Lymphozyten (iTregs) supprimiert TGF- β konzentrationsabhängig die GFP-Fluoreszenz bis auf das Niveau unstimulierter Lymphozyten. Während in nTregs die Suppression des Nfatc1- Gens im wesentlichen durch FoxP3 erfolgt (Torgerson et al., 2009), scheint dies in iTregs vor allem über den TGF-β Signalweg vermittelt zu werden. Die Analyse der GFP-Expression in den verschiedenen Stadien der TZellentwicklung zeigt weiterhin deutliche Unterschiede in der Aktivität des Nfatc1-Gens. Dies wird durch die starke Aktivität des BAC-Genlokus in CD4- CD8- DN Thymozyten, welche eine sechsfach höhere GFP-Expression aufweisen als CD4+CD8+ DP Zellen, deutlich.