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Die Kernhülle ist eine hoch spezialisierte Membran, die den eukaryotischen Zellkern umgibt. Sie besteht aus der äußeren und der inneren Kernmembran, die über die Kernporenkomplexe miteinander verbunden werden. Die Kernhülle reguliert nicht nur den Transport von Makromolekülen zwischen dem Nukleoplasma und dem Zytoplasma, sie dient auch der Verankerung des Chromatins und des Zytoskeletts. Durch diese Interaktionen hilft die Kernhülle, den Zellkern innerhalb der Zelle und die Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu positionieren, und reguliert dadurch die Expression bestimmter Gene. In höheren Eukaryoten durchlaufen sowohl die Kernhülle, als auch die Kernporenkomplexe während der Zellteilung strukturelle Veränderungen. Zu Beginn der Mitose werden sie abgebaut, um sich am Ende der Mitose in den Tochterzellen erneut zu bilden. Die molekularen Mechanismen, die zum Wiederaufbau der Kernhülle führen, sind kaum geklärt. Ein geeignetes System, um bestimmte Ereignisse bei der Kernhüllenbildung zu untersuchen, liefert das zellfreie System aus Xenopus Eiern und Spermienchromatin (Lohka 1998). Es konnte bereits früher gezeigt werden, dass es im Eiextrakt von Xenopus laevis mindestens zwei verschiedene Vesikelpopulationen gibt, die zur Bildung der Kernhülle beitragen. Eine der Vesikelpopulationen bindet an Chromatin, fusioniert dort und bildet eine Doppelmembran. Die andere Vesikelpopulation bindet an die bereits vorhandene Doppelmembran und sorgt für die Ausbildung der Kernporenkomplexe. Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Membranfraktionen zu isolieren und zu charakterisieren, wobei das Hauptinteresse in der porenbildenden Membranfraktion lag. Durch Zentrifugation über einen diskontinuierlichen Zuckergradienten konnten die Membranvesikel in zwei verschiedene Vesikelfraktionen aufgetrennt werden. Eine Membranfraktion konnte aus der 40%igen Zuckerfraktion („40% Membranfraktion“) isoliert werden, die andere aus der 30%igen Zuckerfraktion („30% Membranfraktion“). Die verschiedenen Membranfraktionen wurden zu in vitro Kernen gegeben, in denen die Kernporen durch vorausgegangene Bildung von Annulate Lamellae depletiert worden waren. Nach Zugabe der 30% Membranfraktion konnte die Bildung von funktionalen Kernporen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die 40% Membranfraktion keine porenbildenden Eigenschaften. Unter Verwendung eines vereinfachten Systems, bestehend aus Zytosol, Spermienchromatin und den Membranen, wurde gezeigt, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und ausreichend ist, um eine kontinuierliche Doppelmembran ohne Kernporen zu bilden. Die 30% Membranfraktion besitzt keine Chromatinbindungseigenschaften und wird aktiv entlang von Mikrotubuli zu den porenlosen Kernen transportiert. Dort interagiert sie mit der chromatingebundenen 40% Membranfraktion und induziert die Porenbildung. Nach dem Vergleich der Proteinzusammensetzung der beiden Membranfraktionen, konnte das Major Vault Protein (MVP) nur in der porenbildenden Membranfraktion gefunden werden. MVP ist die Hauptstrukturkomponente der Vault-Komplexe, einem Ribonukleo-proteinpartikel, der in den meisten eukaryotischen Zellen vorhanden ist (Kedersha et al., 1991). Bemerkenswerterweise wird über die Funktion der Vault-Komplexe, trotz ihrer übiquitären Expression und ihrem Vorkommen in fast allen eukaryotischen Zellen, immer noch diskutiert. Um mehr über die Funktion und die Lokalisation der Vaults/MVP zu lernen, wurden die Vaults in Anlehnung an die Methode von Kedersha und Rome (1986) aus Xenopus Eiern isoliert. Zusätzlich wurde rekombinantes Xenopus MVP hergestellt, das unter anderem für die Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet wurde. Um herauszufinden, ob die Anwesenheit von MVP in der 30% Membranfraktion in direktem Zusammenhang mit deren porenbildender Eigenschaft steht, wurden gereinigte Vault-Komplexe oder rekombinantes MVP, das alleine ausreichend ist, um in sich zu den charakteristischen Vault-Strukturen zusammenzulagern, zu porenlosen Kernen gegeben. Sowohl gereinigte Vault-Komplexe, als auch rekombinantes MVP waren in der Lage in den porenlosen Kernen die Bildung von funktionalen Kernporen zu induzieren. Untersuchungen zur Lokalisation von MVP zeigten, dass MVP teilweise an der Kernhülle und den Kernporenkomplexen lokalisiert, während der Großteil an MVP zytoplasmatisch vorliegt. Dies sind die ersten Daten, die Vaults/MVP mit der Kernporenbildung in Verbindung bringen. Deshalb bietet diese Arbeit die Grundlage, um diese unerwartete Rolle der Vaults in Zukunft genauer zu charakterisieren.
Im Jahre 2004 wurden in unserem Labor zwei Gene einer neuen Proteinfamilie kloniert, deren Charakterisierung seither im Gange ist. Das eine Protein, VKORC1, konnte durch Mutationsanalysen und biochemische Untersuchungen als eine zentrale Komponente des so genannten Vitamin K-Zyklus identifiziert werden. Vitamin K wird für die γ-Carboxylierung der Vitamin K-abhängigen Proteine wie z.B. der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X als Cofaktor der γ-Glutamyl-Carboxylase benötigt. Da Vitamin K essentiell ist, wird seine Epoxidform vom Organismus wieder in eine physiologisch aktive Hydrochinon-Form überführt. Für diese Reaktion wird die Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1) benötigt. Mutationen in VKORC1 führen einerseits zu einem erblich bedingten Mangel an Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren vom Typ 2 (VKCFD2) mit starken Blutungen durch eine nicht oder nur unvollständig ablaufende Blutgerinnung. Das VKORC1 ist andererseits auch das Ziel von Medikamenten der Coumaringruppe, der sog. Vitamin K-Antagonisten, die zur Verhinderung einer unzeitigen Gerinnung eingesetzt werden. In höheren Dosen wird diese Substanzklasse als Rattenbekämpfungsmittel eingesetzt. Bei manchen Rattenpopulationen, aber auch bei einigen Patienten, ist die Wirksamkeit der Coumarine durch bestimmte Mutationen im VKORC1-Protein, welche eine Warfarinresistenz hervorrufen, erheblich eingeschränkt. Zu diesem VKORC1 existiert ein paraloges Protein, das Vitamin K-Epoxid-Reduktase Komplex 1-like 1 Protein (VKORC1L1), dessen Funktion bislang unbekannt ist und welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Es wurden unterschiedliche Methoden angewandt, um das VKORC1L1-Protein zu charakterisieren und seine mögliche Funktion(en) aufzuklären. Zum einen sollte die Herstellung einer Knockout-Maus dazu dienen, durch den erhaltenen Phänotyp Hinweise auf die mögliche physiologische Aufgabe zu erhalten. Allerdings gelangten die Versuche nur bis zur Generierung der Chimären, so dass dieses Teilprojekt nicht zum Abschluss gebracht werden konnte. Die biochemische Charakterisierung des Proteins zeigte eine Expression des VKORC1L1-Gens in allen untersuchten Geweben, wobei keine starke Expression für ein bestimmtes Gewebe ermittelt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass das Protein Vitamin K-Epoxid auf gleiche Weise wie das VKORC1 recyceln kann und durch Warfarin gehemmt wird. Einige der in eingeführten VKORC1L1 Mutationen vermitteln darüber hinaus eine Warfarinresistenz. Des Weiteren wurden Enzymkinetiken für die Spezies Maus und Ratte sowie für die Stachelmaus erstellt. Die erhaltenen Werte für die Michaelis-Menten-Konstante und die Maximalgeschwindigkeit sind untereinander sehr ähnlich und sprechen für eine Oxido-Reduktase-Aktivität des VKORC1L1-Proteins. Bioinformatische Analysen konzentrierten sich auf die Aufklärung von konservierten Aminosäureresten im VKORC1L1. Dadurch konnten funktionell wichtige Positionen des Proteins ermittelt werden. Ein evolutiver Stammbaum konnte weiterhin zeigen, dass die paralogen Proteine VKORC1 und VKORC1L1 sehr wahrscheinlich aus einem gemeinsamen Vorläuferprotein bei der Entwicklung der Wirbeltiere aus einer Duplikation entstanden sind und nach der Entstehung der Landwirbeltiere ihre spezifischen Funktionen ausgebildet haben. Ein Homologievergleich zwischen den humanen Chromosomen 7 und 16 und den jeweiligen Chromosomen verschiedener Spezies zeigte, dass sich nach der Duplikation die Gene für das VKORC1 und das VKORC1L1 bei fast allen betrachteten Spezies unabhängig voneinander auf verschiedenen Chromosomen evolutiv entwickelt haben. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass die Duplikation schon sehr lange zurück liegt.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der monoklonale Antikörper IV´D4 biochemisch charakterisiert und die zelluläre Verteilung des Antigens mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Durch elektronenmikroskopische Lokalisierungsexperimente wurde gezeigt, dass es sich dabei um Nuage handelt. Obwohl der Antikörper eine oozytenspezifische Struktur markierte, färbte er in der Immunfluoreszenz überraschenderweise auch somatische Xenopus Kulturzellen (A6 und XTC) an. Als nächstes wurde das Antigen von IV´D4 und damit eine neue Proteinkomponente der Nuage identifiziert. Durch Immunblots von prävitellogenen Oozyten und Expression rekombinanter Proteine wurde festgestellt, dass der Antikörper das Protein 42Sp50 erkennt. Es war nicht auszuschließen, dass die Nuage lediglich die somatischen EF1A-Isoformen akkumulieren. Tatsächlich werden alle drei EF1A-Isoformen in Oozyten exprimiert, wie RT-PCR-Experimente belegten. Die ubiquitäre Expression und hohe Sequenzverwandtschaft der beiden traditionellen Xenopus EF1A-Isoformen mit denen der Säuger veranlassten uns, die Nomenklatur anzugleichen (Xenopus EF1A-1 für EF1A-S und EF1A-2 für EF1A-O). Durch Mikroinjektion entsprechender mRNAs wurden Fluoreszenz-EF1A Fusionsproteine (gekoppelt an EGFP, monomeres DsRed oder monomeres RFP) in lebenden Oozyten exprimiert und lokalisiert. Neben 42Sp50 wurde auch die zweite Proteinkomponente der 42S Partikel, 42Sp43, in Form von fluoreszierenden Fusionsproteinen in Oozyten exprimiert und lokalisiert. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Dynamik der Nuage untersucht. Dazu wurden Versuche mit verschiedenen Inhibitoren durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob die Hemmung unterschiedlicher zellulärer Prozesse Einfluss auf die strukturelle Organisation der Nuage hat. Zu Beginn der Arbeit lagen keine Kenntnisse darüber vor, in welchem Zellkompartiment das Assembly der 42S RNPs stattfindet. Zunächst wurden deshalb die beiden Proteine 42Sp50 und 42Sp43 als fluoreszierende Fusionsproteine in prävitellogenen Ooyzten koexprimiert. Ein eindeutiger Nachweis der spezifischen Interaktion zwischen 42Sp43 und 42Sp50 gelang insbesondere durch die transiente Expression der entsprechenden fluoreszenzmarkierten Proteinpaare in somatischen Kulturzellen (Xenopus A6 und Säuger COS-7 Zellen). Die hier beschriebene Koexpression von Proteinpaaren mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen in Säugerzellen stellt eine einfache Methode dar, um in vivo Interaktionen mikroskopisch sichtbar zu machen. Damit sollte es möglich sein, durch gezielte Mutationen und Deletionen von 42Sp50 und 42Sp43 diejenigen Aminosäuren und strukturellen Determinanten zu identifzieren, die bei der spezifischen Interaktion und damit beim Assembly der 42S Partikel eine Rolle spielen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Antikörper-bindende Epitope von humaner Proteinase 3 (hPR3), dem Autoantigen der Wegenerschen Granulomatose (WG), charakterisiert. WG ist eine Autoimmunerkrankung, die durch chronische Entzündung des oberen und unteren respiratorischen Trakts, Vaskulitis und Glomerulonephritis gekennzeichnet ist. WG ist mit Anti-Neutrophilen zytoplasmatischen- Antikörpern (ANCA) assoziiert, die spezifisch gegen konformationelle Epitope auf der Oberfläche der Serinprotease hPR3 aus azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gerichtet sind. Die Charakterisierung von ANCA-bindenden Epitopen ist für ein besseres Krankheitsverständis Unverzichtbar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nach einem geeigneten PR3-Homolog gesucht, welches sich durch den gezielten Austausch von Oberflächen- Loops für die Kartierung von ANCA-Epitopen eignet. Zunächst wurde die PR3 Aminosäuresequenz der Primaten Pan troglodytes versus (Schimpanse), Macacca mulatta (Makakke) und Hylobates pileatus (Gibbon) analysiert und die Reaktivität gegenüber ANCA mit dem humanen Homolog verglichen. Sowohl Aminosäuresequenz als auch ANCA-Kreuzreaktivität korrelierten mit der phylogenetischen Distanz zu hPR3. Aufgrund der Bindungseigenschaften von Gibbon-PR3 (gibPR3) wurde dieses Homolog für Epitopstudien herangezogen, da die Aminosäuresequenz nur geringfügig von hPR3 abweicht und die Bindung von monoklonalen Anti-hPR3-Antikörpern und WG-Patientenseren im Immunoblot ein deutlich abgeschwächtes Signal lieferte oder keine Reaktivität mehr aufwies. Für die Epitop-Charakterisierung wurden drei hPR3/gibPR3-Mutanten generiert. Die rekombinante Expression von proPR3 erfolgte in Flp-in HEK 293 Zellen und wurde von dort aus dem Zellkultur-Überstand gereinigt und mittels Enterokinase konvertiert. Um das Epitopspektrum genau zu analysieren, wurde ein ELISA entwickelt, bei dem PR3 über den C-terminal gelegenen His6-Tag an Nickel-beschichtete Mikrotiterplatten gebunden wurde. Für den monoklonalen Anti-hPR3-Antikörper MCPR3-2 konnte die Region auf die Aminosäuren Arg60, Gln63A und Leu90 (Chymotrypsinogen-Nummerierung), das für 12.8 auf Met35, Asn38A, Pro38B und Arg74 der N-terminalen PR3-Domäne eingegrenzt werden. Letztere wurde von der Mehrheit der getesteten ANCA der WG-Patienten erkannt und zeigt somit, dass es sich hierbei um ein krankheitsrelevantes Epitop handelt. Diese Region schließt dabei auch den Bindungsbereich von α1-PI ein. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass eine Bindung des Antikörpers bei gleichzeitiger Anwesenheit von α1-PI stark von dessen Konzentration abhängig ist. Bereits bei einer α1-PI-Konzentration von 1 mg/ml, konnte eine partielle Antikörperbindung beobachtet werden. Sinkt die Konzentration deutlich, so besitzen Anti-hPR3-Antikörper die Möglichkeit an diese zu binden. Somit konkurrieren Antikörper und Inhibitor um die PR3-Bindungsstellen. Ein ausgewogenes Protease-Inhibitor-Gleichgewicht ist allerdings für eine kontrollierte Protease-Aktivität notwendig. Ist dieses gestört, so kann es zur Bindung von ANCA an hPR3 auf der Membran von Neutrophilen und deren Aktivierung kommen. Dies hat zur Folge, dass vermehrt proteolytische Enzyme freigesetzt werden, welche durch unkontrollierte enzymatische Aktivität Entzündungsreaktionen und Gewebeschädigung hervorrufen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung einer autosomal-dominant vererbten myofibrillären Myopathie (MFM) in Kombination mit familiärer arrhythmogener rechtsventrikulärer Kardiomyopathie 7 (ARVD7) einer schwedischen Familie. Durch genomweite Kartierung mittels SNP (single nucleotide polymorphism)-Typisierung (Affymetrix Human Mapping 10K Array) wurde der Locus auf 10q22.3 bestätigt. Die Region wurde anschließend bis auf 4.1 Mbp zwischen den Markern D10S1645 und D10S1786 eingegrenzt. In diesem Intervall befinden sich 18 Kandidatengene. Nachdem die Protein-kodierenden Exons aller Gene im Krankheitsintervall sequenziert und dennoch keine signifikanten Abweichungen zwischen Patient und der Normalpopulation aufgefallen waren, wurde gezielt nach einer intragenische Deletion gesucht. Hierzu wurde von einem der Patienten zwei Maus-Hybridlinien generiert, die jeweils nur eines der beiden 10-er Homologe des Patienten enthalten. Doch auch hier waren die kodierenden Exons der 18 Gene aus beiden Hybridlinien durch PCR mit gleicher Effizienz und Größe amplifizierbar, so dass eine intragenische Deletionen mit großer Sicherheit bei allen Genen ausgeschlossen werden konnte. Des weiteren wurde nach SNPs in der transkribierten Sequenz der Kandidatengene gesucht, und die Expression beider Allele für 10 von 18 Kandidatengenen in Muskel-cDNA nachgewiesen. Kleine Veränderungen in nicht-kodierenden Bereichen, Introns, Promotor-Regionen, genomische Veränderungen oder de novo Insertionen sind mögliche pathogene Mechanismen, die im weiteren untersucht werden müssen.
In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren.
Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der molekularen Grundlagen der Proepikardentwicklung im Huhn. Das Proepikard (PE) stellt die Vorläuferpopulation des Koronargefäßsystems dar. Es wurden zwei Schwerpunkte bearbeitet, zum einen die Rolle von einem Mitglied der TGFß-Superfamilie (BMP, bone morphogenetic protein) während der Induktionsphase des PE und zweitens die molekularen Mechanismen, welche der links/rechts Asymmetrie der PE Entwicklung zugrunde liegen. Die Expressionsmuster von TBX18, WT1, CFC weisen diese als proepikardiale Marker aus. BMP4 wird ebenfalls im PE exprimiert, wenngleich wesentlich schwächer als BMP2 im benachbarten Sinusmyokard. Durch in vitro Experimente mit proepikardialen Primärkulturen wurde festgestellt, dass die Zugabe von rekombinatem BMP2 einen Teil der Zellen zu Kardiomyozyten differenzieren lässt. Daher wird angenommen, dass ein Teil der proepikardialen Zellen konzentrationsabhängig auf Wachstumsfaktoren reagieren und in der Lage sind, die epikardiale Linie zu verlassen und ein myokardiales Schicksal anzunehmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle des NODAL-PITX2-Signalweges in Bezug auf die Unilateralität des Proepikards im Hühnchen analysiert. Dazu wurden Manipulationen des Hensenschen Knotens im HH Stadium 4 durchgeführt, mit dem Ziel linksseitige Markergene auf der rechten Seite ektopisch zu induzieren. Keine dieser Manipulationen, als auch eine virale Überexpression von PITX2 in sinuatrialen Progenitoren in vivo, liess eine Veränderung der TBX18-Lateralität erkennen, obwohl die PITX2-Expression randomisiert war. Dagegen führte die Inhibition des asymmetrischen Ionenfluxes sowie der Apoptose im Primitivstreifen zu einer völligen Randomisierung der TBX18-Expression, sowie unter anderem der Entwicklung bilateraler Proepikardien. Die Induktion bilateraler TBX18-Expressionsdomänen war ebenfalls durch ektopisches FGF8 auf der linken Seite des Knotens zu beobachten. Der Verlust der rechtsseitigen FGF Signalgebung im Knoten resultierte in einem Verlust der rechtsseitigen TBX18-Expression im Sinus. Daraus kann geschlossen werden, dass proepikardiale Progenitoren nicht nur durch den asymmetrischen Ionenflux sowie Apoptose im Primitivstreifen in ihrer Lateralität festgelegt werden, sondern auch von rechtsseitigen FGF-Signalen im Knoten und unabhängig vom linkseitigen NODAL-PITX2-Signalweg lateralisiert werden.
Die Untersuchung des Flächenanspruchs von Tierpopulationen ist wegen folgender Gesichtspunkte wichtig: (a) Nachdem das Aussterben der Arten nicht nachläßt, erhebt sich die Frage nach den Möglichkeiten im Naturschutz, quantitative Forderungen zu begründen. (b) Da selbst gezielte Schutzmaßnahmen sinnlos werden, wenn die Voraussetzungen für das überleben der Arten oder Lebensgemeinschaften nicht gegeben sind, muß man sich fragen, wieviel an Umweltverschmutzung reduziert werden muß, damit der Artenschutz verwirklicht werden kann. Der "Extensivierungsspielraum" an sich reicht nicht aus. Die Frage nach dem Flächenanspruch schließt den Gedanken einer "mindestens notwendigen" Flächensicherung ein. Der Flächenbedarf einer Tierpopulation wird bestimmt durch (A) den Raumbedarf der Reproduktionseinheit, und (B) der Größe einer überlebensfähigen Population. (A) variiert durch die individuell und im Jahresverlauf schwankenden Aktionsraumgrößen und die unterschiedliche Habitatqualität. Die überlebensfähigkeit (B) einer Population ist von Zufallsprozessen abhängig und daher nur mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit abschätzbar. Vier verschiedene (nicht anthropogene) Faktoren können selbst in einem geeigneten Habi tat zum Aussterben von Populationen führen: (a) demographische und (b) genetische Zufallsprozesse, (c) Umweltschwankungen und (d) (Natur) katastrophen. Eine Absicherung gegen diese Risikofaktoren wird durch Vergrößerung der Population, Erhöhung der Zahl geeigneter Habitate und Verringerung der Isolierung zwischen den bewohnten Flächen erreicht. Eine Mindestforderung (Minimalareal die mindest notwendige Fläche, die geschützt werden muß) kann nur an der sog. "minimum viable population" bemessen werden. Die Gefährdungsgradanalyse ("population vulnerability analysis") für eine bestimmte Tierart liefert die notwendigen Angaben zur Habitatqualität, Flächengröße und Lage der Flächen, die für die Zukunftssicherung einer Population unter natürlichen Bedingungen (z.B. "mit 95%iger Wahrscheinlichkeit die nächsten 50 Jahre überlebensfähig" ) notwendig sind. Sowohl beim konstruktiven Artenschutz wie auch für die Schadensbegrenzung bei Eingriffsregelungen sollte eine Zielart ausgewählt werden, damit die Flächensicherung eindeutig quantitativ begründet werden kann. Die Auswahl einer Zielart erfolgt nach Kriterien wie überregionaler Gefährdungsgrad, Schlüsselart, Chancen der Populationssicherung und wird regional nach den bestehenden Voraussetzungen (Vorkommen, Habitatangebot, Regionalplan) angepaßt. Die wesentlichen Aspekte eines ZielartenKonzeptes sind: Der Flächenbedarf für Schutz- und Ausgleichsmaßnahmen wird an den Überlebensaussichten einzelner Tierpopulationen bemessen -- Die Zukunftssicherung muß natürliche Bedingungen (nicht ständige Stützmaßnahmen) voraussetzen -- Die Analyse von Risikofaktoren bildet die Grundlage für die Abschätzung der Zukunftsaussichten. Es sind wissenschaftlich begründete, quantitative Aussagen möglich. Durch die Sicherung von Flächen mit geeigneter Habitatqualität profitieren viele weitere Arten von den Schutzmaßnahmen. Es entsteht ein künftiger Forschungsbedarf vor allem zu den Gefährdungsgradanalysen ausgewählter Zielarten. Für die praktische Umsetzung sind die Aufstellung einer regional angepaßten Zielartenliste, Habitateignungsanalysen und die Entwicklung von Populationsmodellen für Zielarten von seiten der biologischen Wissenschaft nötig.
„Die berufspolitische Situation für die Humangenetischen Institute hat sich an den Universitäten in den letzten zwei Jahren leider nicht verbessert. Vielen Instituten wurde der Zugang zur Erbringung von Kassenleistungen deutlich erschwert bzw. gänzlich entzogen.“ (Grimm, T.; Zerres, K., 2005, S. 41). Eine Analyse der Rechtsform und Aufbauorganisation sowie der Leistungen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg kann als Grundlage dienen, um die Auswirkungen einer entzogenen Kassenzulassung besser verstehen zu können. Zudem ermöglicht eine solche Betrachtung die Ableitung von Erfordernissen, die eine optimale Rechtsform und Aufbauorganisation des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg erfüllen sollte. Zusammenfassend können dann die aktuellen und zukünftigen Rahmenbedingungen für die humangenetische Leistungserbringung bei bestehender Rechtsform und Aufbauorganisation beschrieben werden. Es wird deutlich, dass aufgrund eines drohenden Entzuges der Kassenzulassung eine Gefährdung der Erbringung humangenetischer Leistungen an der Universität Würzburg besteht. Die Finanzierung der erbrachten Leistungen in der Patientenversorgung wird zu ca. 75% von den gesetzlichen Krankenkassen getragen. Ein Wegbrechen eines solchen Leistungsumfanges hätte kaum kompensierbare Auswirkungen auf Forschung, Lehre, Weiterbildung und die Patientenversorgung an sich. Durch die Reformen des SGB aus dem Jahre 2004 sind verschiedene Alternativen zur bestehenden Rechtsform und Aufbauorganisation möglich geworden. Hierbei handelt es sich um Hochschulambulanzen (gem. §117 SGB V), Integrierte Versorgung (gem. §140 SGB V) und Medizinische Versorgungszentren (gem. §95 SGB V). Zudem gibt es die Möglichkeit einer „Praxis im Institut“-Kooperation. Diese Alternativen werden in der hier vorliegenden Arbeit kurz einzeln charakterisiert, um dann eine Bewertung der möglichen Rechtsformen und Aufbauorganisationen gemäß am Institut bestehender Erfordernisse zu ermöglichen. Die vergleichende Betrachtung wird zeigen, dass ein Medizinisches Versorgungszentrum (MVZ) eine gute Möglichkeit darstellt, die beschriebene Problematik zu lösen und die Erfordernisse des Instituts zu erfüllen. Im Anschluss werden die rechtlichen und organisatorischen Ausgestaltungsmöglichkeiten eines MVZs zur Erbringung humangenetischer Leistungen beleuchtet. Hierbei wird im Besonderen auf die gesetzlichen Gründungsvoraussetzungen eingegangen. Die Anforderungen an Gründer, Rechtsform, Leistungserbringer und ärztliche Leitung werden detailliert beschrieben, und die jeweiligen Gestaltungsmöglichkeiten im Hinblick auf die am Institut bestehenden Erfordernisse gewertet. Im Anschluss kann der Zulassungsprozess des MVZs an sich betrachtet werden.
Die 2001 beschriebene Art B. petrii stellt den ersten Umweltkeim der Gattung Bordetella dar, welcher aus einer anaeroben, dechlorinierenden Anreicherungskultur aus Flusssediment isoliert wurde. Phylogenetisch wird B. petrii an die Basis der Gattung Bordetella eingeordnet und ist in evolutionärer Hinsicht deshalb interessant, weil er sowohl für orthologe Gene bestimmter Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert als auch typische Eigenschaften von Umweltkeimen aufweist und somit eine Art Bindeglied darstellt. Da B. petrii ein orthologes BvgAS-System besitzt (der Hauptregulator der Virulenzgenexpression in den pathogenen Bordetellen), wurde dessen Struktur im Rahmen dieser Arbeit mittels in silico Analysen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Konservierung nur auf Aminosäureebene deutlich zu erkennen ist und der Response Regulator BvgA von B. petrii die stärkste Konservierung aufweist. Desweiteren besitzt B. petrii Gene für zwei Histidinkinasen, BvgS1 und BvgS2, sowie ein separates Gen, welches für eine Hpt-Domäne kodiert. Weitere putative Virulenzfaktoren von B. petrii gehören in die Gruppe der Adhäsionsfaktoren. Diese Faktoren spielen bei den „klassischen“ Bordetellen im Infektionszyklus eine wichtige Rolle für die Anheftung z.B. an die Epithelzellen des Respirationstraktes. Um ein mögliches pathogenes Potential von B. petrii abschätzen zu können, wurden vergleichende Zellkulturstudien mit B. bronchiseptica durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass B. petrii um den Faktor 7,5 weniger in Makrophagen aufgenommen wird. Hinweise auf die Funktionalität des BvgAS-Systems in B. petrii wurden durch Proteomstudien mit einer BvgA-Mutante erhalten, und deuten darauf hin, dass das BvgAS-System in B. petrii möglicherweise eine Funktion in der Respirationskontrolle haben könnte. Im Rahmen der Genomsequenzierung wurden acht genomische Inseln beschrieben, die in dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Struktur und ihrem Excisionsverhalten untersucht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die genomischen Inseln, mit Ausnahme der Insel GI0, in verschiedenen Kombinationen, als ringförmige Intermediate aus dem B. petrii Genom ausgeschnitten werden können. Vier der genomischen Inseln (GI1-GI3 und GI6) weisen strukturelle Ähnlichkeiten zu einer Familie syntenischer genomischer Inseln auf, zu denen auch das clc-Element von Pseudomonas sp. Strain B13 zählt. Die größte Ähnlichkeit zum clc-Element weist die Insel GI3 von B. petrii auf. Diese beiden Inseln haben annähernd die gleiche Größe und besitzen Gene zu Abbau von 3-Chlorobenzoat (3-CBA). Die Untersuchung der Stabilität von GI3 ergab, dass nach 125-150 Generationen nur noch 1,5 % der Bakterien die Insel GI3 enthielten. Desweiteren konnte die Übertragung der Insel GI3 von B. petrii auf B. bronchiseptica PS2 gezeigt und der Integrationsbereich bestimmt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch ein neuer Stammbaum der Gattung Bordetella erstellt, in welchen eine Reihe kürzlich neu beschriebener B. petrii Isolate mit aufgenommen wurden wodurch ein zu den pathogenen Bordetellen abgegrenztes Cluster gebildet wird.