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- Chemical Biology Laboratory, National Cancer Institue, Frederick (USA) (1)
- Fraunhofer IGB - Institutsteil Würzburg Translationszentrum Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Chemie, Brooklyn College, City University of New York, Brooklyn (1)
- Lehrstuhl für Physiologische Chemie (1)
- Lehrstuhl für Translationale Onkologie (1)
- Siemens Corporate Technology, Erlangen (1)
- Technische Hochschule Wildau (1)
- Universitätsklinikum Düsseldorf, Institut für Toxikologie (1)
BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.
Listeria monocytogenes, ein fakultativ intrazellulärer Krankheitserreger, besitzt die Fähigkeit, Wirtszellen zu penetrieren, sich in ihnen zu vermehren, sich intrazellulär zu bewegen und auch benachbarte Zellen direkt zu infizieren. Die intrazelluläre Fortbewegung erfolgt durch Polymerisation von zellulärem Aktin, wodurch charakteristische Aktinschweife an einem Pol der Bakterien entstehen. Der einzige bakterielle Faktor, der für die Aktinpolymerisation notwendig ist, ist das Oberflächenprotein ActA. ActA allein ist aber nicht in der Lage, Aktin zu polymerisieren, sondern kann dies nur in Assoziation mit Proteinen der Wirtszelle. Die einzigen bisher bekannten Wirtszellproteine, die direkt mit ActA interagieren, sind das Phosphoprotein VASP und der Arp2/3-Komplex. VASP bindet an den zentralen prolinreichen Bereich von ActA und beschleunigt durch die Rekrutierung von Profilin den Prozeß der Aktinpolymerisation. Der Arp2/3-Komplex interagiert mit dem N-terminalen Bereich von ActA und initiiert die eigentliche Aktin-Polymerisation. Um weitere eukaryotische, mit ActA interagierende Proteine (AIPs) zu isolieren, wurde über einen "Yeast Two-Hybrid"-Test mit ActA als Köder eine embryonale Maus-cDNA-Genbank getestet. Dabei wurden drei verschiedene AIPs identifiziert, von denen eines identisch mit dem humanen Protein LaXp180 (auch "CC1" genannt) ist. LaXp180 ist ein 180 kDa Protein mit über 50 theoretischen Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen Hälfte, während die C-terminale Hälfte "coiled-coil"-Strukturen ausbilden kann. Darüberhinaus enthält LaXp180 eine Kern-Lokalisations-Sequenz und ein Leucin-Zipper-Motiv. Die Bindung von LaXp180 an ActA wurde in vitro unter Verwendung von rekombinantem His6-Tag-LaXp180 und rekombinantem ActA bestätigt, da rekombinantes ActA nur an einer Ni-Agarose-Säule gebunden wurde, wenn diese vorher mit His6-Tag-LaXp180 beladen war. Über RT-PCR konnte zum ersten Mal die Expression LaXp180-spezifischer mRNA in verschiedenen Säugerzellen nachgewiesen und mit einem polyklonalen anti-LaXp180-Serum durch Immunopräzipitation erstmals ein 194 kDa großes Protein in Säugerzellextrakten detektiert werden. Die intrazelluläre Lokalisation von LaXp180 wurde über Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Immunfluoreszenzfärbungen von Fibroblasten mit dem anti-LaXp180-Serum zeigten eine starke Färbung der Zellkerne und definierter Bereiche direkt neben den Kernen, während das restliche Zytoplasma schwach gefärbt war. Über Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem anti-LaXp180-Serum an mit L. monocytogenes infizierten Zellen konnte gezeigt werden, daß LaXp180 mit der Oberfläche vieler, aber nicht aller intrazellulärer, ActA-exprimierender Listerien kolokalisiert. Dagegen wurde nie eine Kolokalisation mit intrazellulären, aber ActA-defizienten Mutanten beobachtet. Darüberhinaus ist LaXp180 asymmetrisch auf der Bakterienoberfläche verteilt und schließt sich gegenseitig mit der F-Aktin-Polymerisation aus. LaXp180 ist ein putativer Bindungspartner von Stathmin, einem 19 kDa Phosphoprotein, das die Mikrotubuli-Dynamik reguliert. Über Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, daß auch Stathmin mit intrazellulären, ActA-exprimierenden L. monocytogenes kolokalisiert.
Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger.
Listeria monocytogenes überwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszulösen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere könnte über die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskuläre Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die für die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskulären HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen können. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund ablösen oder lysieren und somit gegenüber intrazellulären Listerien sehr widerstandsfähig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adhärieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausstülpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausstülpungen sind mit der Zelle nur noch über sehr dünne Membranschläuche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivität in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberflächenproteinen InlA, InlB und ActA unabhängigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches für den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate beträchtlich. Listerienstämme mit einer Deletion im für InlB kodierenden Gen sind unfähig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adhäsion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabhängig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. Während sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erhöhen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivität von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zellüberstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. Während eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.
Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen.
Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen.
Pilze sind in unserer Umwelt allgegenwärtig und besiedeln im Fall von Candida albicans (C. albicans) sogar bei über 50% der Menschen die Schleimhäute, während Sporen von Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) täglich über die Atmung in die Lunge des Menschen gelangen. Dennoch sind Erkrankungen, die durch diese zwei Pilze ausgelöst werden, bei gesunden Menschen selten. Ist jedoch das Immunsystem beeinträchtigt, können diese Pilze zu systemischen und damit lebensbedrohlichen Erkrankungen wie der invasiven Aspergillose und der systemischen Candidiasis führen. Für eine Verbesserung der Behandlung solcher Infektionen ist das genaue Verständnis der Immunabwehrmechanismen entscheidend. Da A. fumigatus über die Lunge in den Körper gelangt, wurden in dieser Arbeit die häufigsten Immunzellen der Lunge, die Makrophagen, und deren Immunantwort auf A. fumigatus untersucht. Parallel hierzu wurden dendritische Zellen (DCs) verwendet, die als Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem wirken. Ein besonderes Augenmerk wurde hierbei auf A. fumigatus induzierte Genexpressionsänderungen und deren Regulationsmechanismen gelegt. Dabei wurden kurze, regulatorische RNAs, die sogenannten miRNAs, untersucht, die eine wichtige Rolle in der post-transkriptionalen Genregulation spielen. Bislang ist nur wenig über die miRNA-abhängigen Genregulationen in DCs, die auf eine Infektion mit A. fumigatus oder C. albicans reagieren, bekannt. Um alle durch A. fumigatus und C. albicans regulierten miRNAs zu identifizieren, wurden DCs mit A. fumigatus und C. albicans ko-kultiviert und anschließend eine Komplettsequenzierung der kurzen RNAs durchgeführt. Die Pilz-spezifische Induktion der miRNA-Regulation wurde zudem mit der miRNA-Regulation durch den bakteriellen Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid verglichen. Durch die Stimulation mit Keimschläuchen von A. fumigatus wurden die miRNAs miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p und miR-9-5p in DCs induziert. Diese wurden ebenfalls durch C. albicans induziert, zudem noch die miRNAs miR-147a und miR-147b. Spezifisch für A. fumigatus war die Regulation der miR-129-2-3p. Neben dem miRNA-Profiling wurde auch das mRNA-Transkriptom über Microarrays analysiert und dadurch 18 potentielle Zielgene der Pilz-induzierten miRNAs identifiziert.
Neben den Elementen der Translationsregulation wurden auch die Transkriptionsfaktoren untersucht. Als einziger unter den 60 regulierten Transkriptionsfaktoren zeigte KLF4 eine veränderte Expressionsrichtung in DCs, die mit Pilzen oder LPS behandelt waren. Während die Stimulation mit LPS die Expression von KLF4 induzierte, wurde es durch die Pilze A. fumigatus und C. albicans reprimiert. In einer Untersuchung der unterschiedlichen A. fumigatus-Rezeptoren, wurde deren Einfluss auf die KLF4-Regulation gezeigt. Während TLR4-Liganden KLF4 induzierten, führten Liganden, die an die Rezeptoren TLR2/TLR1 und Dectin-1 binden, zu einer Reduktion von KLF4. Nach einem erfolgreich etablierten KLF4-knock-down mittels RNA-Interferenz wurden KLF4-Zielgene untersucht. Während kein bzw. nur ein geringer Effekt auf die Genexpression von CCL2, RANTES, CXCL10 und TNF beobachtet wurde, sorgte der KLF4 knock-down für eine hoch signifikante Reduktion der IL6-Genexpression in LPS-stimulierten DCs.
Um die KLF4-Regulation weiter zu untersuchen, wurde zudem eine weitere Zellpopulation des angeborenen Immunsystems, die Makrophagen, verwendet. Auch hier wurde die Immunantwort gegen A. fumigatus analysiert. Zudem wurde die Rolle der Thrombozyten als Immunmediatoren betrachtet. Zuerst wurde ein Zytokinprofil des plättchenreichen Plasmas (PRP), das mit A. fumigatus stimuliert wurde, erstellt. In diesem konnte nur RANTES in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Daraufhin wurde der Einfluss von PRP auf die Reifung von DCs, die Phagozytosefähigkeit von Makrophagen und DCs sowie der Einfluss von DCs und Makrophagen auf die metabolische Aktivität von A. fumigatus in An- und Abwesenheit von plättchenreichem Plasma untersucht. Es konnte eine gering verstärkte Reifung der DCs durch PRP gezeigt werden. Isolierte Thrombozyten konnten die Phagozytose von DCs steigern, während Makrophagen durch PRP verstärkt Konidien phagozytierten. In einem genomweiten Transkriptomprofiling wurde die Immunantwort von DCs und Makrophagen verglichen. Zudem wurde untersucht, wie PRP die Immunantwort dieser Immunzellen beeinflusst. Es wurden 2 bzw. 24 Gene identifiziert, die signifikant in A. fumigatus-stimulierten DCs und Makrophagen reguliert waren. Hierbei wurde gezeigt, dass KLF4 durch die Zugabe von PRP herabreguliert wurde. Das zuvor beschriebene Zielgen IL6 wurde durch PRP in A. fumigatus-stimulierten DCs gegenüber stimulierten DCs ohne PRP deutlich reduziert, wodurch sich eine immunmodulatorische Fähigkeit des PRP zeigte.
Die Induktion von IL-6, weiteren Zytokinen und der Reifemarker durch A. fumigatus in DCs wurden zudem in einem Booleschen Modell simuliert. Dieses Modell soll in Zukunft Vorhersagen über experimentelle Ergebnisse und dadurch eine optimale Versuchsvorbereitung ermöglichen.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend.
Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein.
Isolierung des Sp1-verwandten Transkriptionsfaktors Knopfkopf mittels eines PCR-basierten Homologie-Screens in der Maus. Das Gen Knopfkopf wurde anschließend hinsichtlich der evolutiven Verwandtschaftsbeziehungen zum Drosophila-Gen buttonhead eingeordnet. Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mit Hilfe einer gezielten Geninaktivierung durch homologe Rekombination (knock out). Es konnte gezeigt werden, dass das Gen in der Embryogenese der Maus essentiell ist für die Entwicklung der Extremitäten, der Nase und des Zentralen Nervensystems sowie der sekundären Gastrulation.