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- Department of Biomedical Imaging, National Cerebral and Cardiovascular Research Center, Suita, Japan (2)
- Division of Medical Technology and Science, Department of Medical Physics and Engineering, Course of Health Science, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita Japan (2)
- Institut for Molecular Biology and CMBI, Department of Genomics, Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Leopold-Franzens-University Innsbruck, Innsbruck, Austria (2)
- Johns Hopkins School of Medicine, The Russell H Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Baltimore, MD, USA (2)
- Fraunhofer IGB - Institutsteil Würzburg Translationszentrum Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Fraunhofer Institute for Integrierte Schaltungen (IIS) (1)
- Institut für Hygiene und Mikrobiologie (1)
- eXcorLab GmbH (1)
EU-Project number / Contract (GA) number
- 701983 (2)
Isolierung und Charakterisierung mesenchymaler Stammzellen (UCSC) aus der humanen Nabelschnur
(2010)
Hintergrund: Mesenchymale Progenitorzellen (MPCs; Synonym: mesenchymale Stammzellen, MSC) besitzen die Eigenschaft sich in verschiedene Gewebe zu differenzieren. Diese MPCs können heute in einer Vielzahl von Geweben sowohl des adulten als auch des fetalen Organismus nachgewiesen werden. Ihre Anzahl ist jedoch sehr gering. Im Rahmen dieser Untersuchung sollte überprüft werden, in wie weit MPCs oder MPC-ähnliche Zellen in der humanen Nabelschnur nachweisbar sind. Material und Methoden: Postpartal wurde die humane Nabelschnur entnommen und in kühler physiologischer Kochsalzlösung gelagert. Nachdem 10 cm der Nabelschnur abgemessen worden waren, wurde die Nabelschnur in ca. 1 cm große Abschnitte aufgeteilt, die Gefäße mit einer Pinzette entfernt und das restliche Gewebe in einem Enzym-Cocktail für 3h in 37° verdaut. Die auf diese Weise isolierten umbilikalen mesenchymalen Progenitorzellen wurden anschließend zentrifugiert, das Pellet resuspendiert und die Zellen kultiviert. Ergebnisse: (1) Umbilikale mesenchymale Progenitorzellen (UMPCs) lassen sich in ausreichender Anzahl isolieren und (2) leicht kultivieren. (3) In der primären Kultur zeigten diese Zellen eine den Fibroblasten ähnliche Zellmorphologie. (4) Die UMPCs lassen sich in vitro leicht expandieren und zeigen eine Differenzierung in verschiedene Zelltypen (5) Immunhistochemisch exprimieren diese Zellen mesenchymale Stammzellmarker (CD13, CD105), jedoch keine hämatopoetischen Stammzellmarker (CD 14 und CD34). Schlußfolgerung: Unsere Untersuchungen zeigen, dass sich mesenchymale Progenitorzellen in der humanen Nabelschnur nachweisen lassen. Sie stellen somit eine wertvolle Ressource zur Gewinnung von potenten Zellen für zellbasierte Therapieansätze in der Chirurgie und besonders in der Kinderchirurgie dar.
Die Vordere Kreuzband (VKB)-Ruptur ist eine häufige Verletzung, welche eine hohe individuelle und sozioökonomische Belastung verursacht. Eine etablierte Therapie ist die VKB-Plastik, problematisch sind jedoch die hohen Rerupturraten nach operativer Versorgung. In der Annahme, dass Mesenchymale Stammzellen (MSC) eine bedeutende Rolle für die Heilung spielen, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen Zahl und Qualität der aus dem VKB isolierten MSC sowie der Latenz zwischen Ruptur und Rekonstruktion besteht und so ein optimaler Therapiezeitraum eingegrenzt werden kann.
Zunächst erfolgte die Zellisolierung aus intraoperativ gewonnenen VKB-Biopsien. Je nach Latenz zwischen Ruptur und Operation wurden drei Gruppen (akute ≙ ≤ 30 d, subakute ≙ 31-90 d, verzögerte Rekonstruktion ≙ > 90 d) gebildet. Zum Nachweis von MSC wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Plastikadhärenz, eines multipotenten Differenzierungspotentials sowie eines spezifischen Oberflächenantigenmusters (CD73+, CD90+, CD105+, CD34-) untersucht. Zudem wurde ihr Einflusses auf die biomechanischen und histologischen Eigenschaften eines analysiert.
Der Nachweis von MSC war in allen Gruppen möglich. Das Proliferationspotential war in Gruppe II am größten, ebenso der Anteil der MSC an allen Zellen. Er war 5,4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe I und 18,9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe III. In den mit Zellen kultivierten Bandkonstrukten konnte im Gegensatz zu zellfreien Konstrukten humanes Kollagen I nachgewiesen werden. Die Stabilität nahm bei Kultivierung mit Zellen ab.
Die Ergebnisse legen nahe, dass das Regenerationspotential bei subakuter VKB-Rekonstruktion (31-90 d) am höchsten ist. Potenziell ursächlich sind die Regeneration hemmende Entzündungsprozesse zu Beginn sowie degenerative Prozesse im längerfristigen Verlauf. Zudem konnte gezeigt werden, dass die isolierten Zellen die Eigenschaften eines Bandkonstruktes durch Bildung von Kollagen I und Reduktion der Stabilität im kurzfristigen Verlauf verändern und dementsprechend den Therapieerfolg beeinflussen könnten. Zur Verifizierung der Ergebnisse bedarf es weiterer Untersuchungen.
Molecular and developmental characterization of the Echinococcus multilocularis stem cell system
(2014)
The metacestode larva of Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), one of the most dangerous zoonotic diseases in the Northern Hemisphere. Unlike “typical” metacestode larvae from other tapeworms, it grows as a mass of interconnected vesicles which infiltrates the liver of the intermediate host, continuously forming new vesicles in the periphery. From these vesicles, protoscoleces (the infective form for the definitive host) are generated by asexual budding. It is thought that in E. multilocularis, as in other flatworms, undifferentiated stem cells (so-called germinative cells in cestodes and neoblasts in free-living flatworms) are the sole source of new cells for growth and development. Therefore, this cell population should be of central importance for the progression of AE.
In this work, I characterized the germinative cells of E. multilocularis, and demonstrate that they are indeed the only proliferating cells in metacestode vesicles. The germinative cells are a population of undifferentiated cells with similar morphology, and express high levels of transcripts of a novel non-autonomous retrotransposon family (ta-TRIMs). Experiments of recovery after hydroxyurea treatment suggest that individual germinative cells have extensive self-renewal capabilities. However, germinative cells also display heterogeneity at the molecular level, since only some of them express conserved homologs of fgfr, nanos and argonaute genes, suggesting the existence of several distinct sub-populations. Unlike free-living flatworms, cestode germinative cells lack chromatoid bodies. Furthermore, piwi and vasa orthologs are absent from the genomes of cestodes, and there is widespread expression of some conserved neoblast markers in E. multilocularis metacestode vesicles. All of these results suggest important differences between the stem cell systems of free-living flatworms and cestodes.
Furthermore, I describe molecular markers for differentiated cell types, including the nervous system, which allow for the tracing of germinative cell differentiation. Using these molecular markers, a previously undescribed nerve net was discovered in metacestode vesicles. Because the metacestode vesicles are non-motile, and the nerve net of the vesicle is independent of the nervous system of the protoscolex, we propose that it could serve as a neuroendocrine system. By means of bioinformatic analyses, 22 neuropeptide genes were discovered in the E. multilocularis genome. Many of these genes are expressed in metacestode vesicles, as well as in primary cell preparations undergoing complete metacestode regeneration. This suggests a possible role for these genes in metacestode development. In line with this hypothesis, one putative neuropeptide (RGFI-amide) was able to stimulate the proliferation of primary cells at a concentration of 10-7 M, and the corresponding gene was upregulated during metacestode regeneration.
Neuropsychiatric disorders, such as attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD), represent a burden which deeply impair the patient’s life. Neurobiological research has therefore increasingly focused on the examination of brain neurotransmitter systems, such as the serotonin (5-HT) system, since a dysfunction has been repeatedly implicated in the pathology of these diseases. However, investigation of functional human neurons in vitro has been restricted by technical limitations for a long time until the discovery of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) revolutionized the field of experimental disease models. Since the pathogenesis of neuropsychiatric disorders involves a complex genetic component, genome-wide association studies (GWAS) revealed numerous risk genes that are associated with an increased risk for ADHD. For instance, the novel ADHD candidate gene SLC2A3 which encodes the glucose transporter-3 (GLUT3), facilitates the transport of glucose across plasma membranes and is essential for the high energy demand of several cell types, such as stem cells and neurons. Specifically, copy number variants (CNVs) of SLC2A3 might therefore impact cerebral glucose metabolism as well as the assembly of synaptic proteins in human neurons which might contribute to the pathogenesis of ADHD.
We hypothesized that an altered SLC2A3 gene dosage in human neurons can exert diverse protective or detrimental effects on neurodevelopmental processes as well as the coping of glucometabolic stress events, such as hypo- and hyperglycaemic conditions. The generation of specific iPSC lines from ADHD patients and healthy probands served as basis to efficiently differentiate stem cells into 5-HT specific neurons. Using this neuronal culture, we were able to examine effects of SLC2A3 CNVs on the basal expression of SCL2A3 and GLUT3 in human neurons. Furthermore, the focus was on potentially altered coping of the cells with glucose deprivation and the treatment with specific high- and low glycaemic media.
High-resolution fluorescence imaging in combination with electrophysiological and molecular biological techniques showed that:
1) The generated human iPSCs are fully reprogrammed human stem cells showing typical characteristics of embryonic stem cell-like morphology, growth behaviour, the ability to differentiate into different cell types of the human body and the expression of pluripotency-specific markers.
2) The neuronal subtype derived from our stem cells display typical characteristics of 5-HT specific median and dorsal neurons and forms synapses reflected by the expression of pre- and postsynaptic proteins.
3) Even if SLC2A3 CNVs influence SLC2A3 and GLUT3 basal expression, no significant alterations in gene and protein expression caused by hyper- and hypoglycaemic conditions, nor in the assembly of proteins associated with synapse formation could be observed in human iPSC-derived neurons.
Alveolar echinococcosis, which is caused by the metacestode stage of the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis, is a severe zoonotic disease with limited treatment options. For a better understanding of cestode biology the genome of E. multilocularis, together with other cestode genomes, was sequenced previously. While a few studies were undertaken to explore the E. multilocularis transcriptome, a comprehensive exploration of global transcription profiles throughout life cycle stages is lacking. This work represents the so far most comprehensive analysis of the E. multilocularis transcriptome. Using RNA-Seq information from different life cycle stages and experimental conditions in three biological replicates, transcriptional differences were qualitatively and quantitatively explored. The analyzed datasets are based on samples of metacestodes cultivated under aerobic and anaerobic conditions as well as metacestodes obtained directly from infected jirds. Other samples are stem cell cultures at three different time points of development as well as non-activated and activated protoscoleces, the larval stage that can develop into adult worms. In addition, two datasets of metacestodes under experimental conditions suitable for the detection of genes that are expressed in stem cells, the so-called germinative cells, and one dataset from a siRNA experiment were analyzed. Analysis of these datasets led to expression profiles for all annotated genes, including genes that are expressed in the tegument of metacestodes and play a role in host-parasite interactions and modulation of the host's immune response. Gene expression profiles provide also further information about genes that might be responsible for the infiltrative growth of the parasite in the liver.
Furthermore, germinative cell-specific genes were identified. Germinative cells are the only proliferating cells in E. multilocularis and therefore of utmost importance for the development and growth of the parasite. Using a combination of germinative cell depletion and enrichment methods, genes with specific expression in germinative cells were identified. As expected, many of these genes are involved in translation, cell cycle regulation or DNA replication and repair. Also identified were transcription factors, many of which are involved in cell fate commitment. As an example, the gene encoding the telomerase reverse transcriptase (TERT) was studied further. Expression of E. multilocularis tert in germinative cells was confirmed experimentally. Cell culture experiments indicate that TERT is required for proliferation and development of the parasite, which makes TERT a potentially interesting drug target for chemotherapy of alveolar echinococcosis.
Germinative cell specific genes in E. multilocularis also include genes of densoviral origin. More than 20 individual densovirus loci with information for non-structural and structural densovirus proteins were identified in the E. multilocularis genome. Densoviral elements were also detected in many other cestode genomes. Genomic integration of these elements suggests that densovirus-based vectors might be suitable tools for genetic manipulation of tapeworms. Interestingly, only three of more than 20 densovirus loci in the E. multilocularis genome are expressed. Since the canonical piRNA pathway is lacking in cestodes, this raises the question about potential silencing mechanisms. Exploration of RNA-Seq information indicated natural antisense transcripts as a potential gene regulation mechanism in E. multilocularis. Preliminary experiments further suggest DNA-methylation, which was previously shown to occur in platyhelminthes, as an interesting avenue to explore in future.
The transcriptome datasets also contain information about genes that are expressed in differentiated cells, for example the serotonin transporter gene that is expressed in nerve cells. Cell culture experiments indicate that serotonin and serotonin transport play an important role in E. multilocularis proliferation, development and survival.
Overall, this work provides a comprehensive transcription data atlas throughout the E. multilocularis life cycle. Identification of germinative cell-specific genes and genes important for host-parasite interactions will greatly facilitate future research. A global overview of gene expression profiles will also aide in the detection of suitable drug targets and the development of new chemotherapeutics against alveolar echinococcosis.
Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet.
Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt.
Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen.
Zusammenfassung Im Zuge der Säugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gewährleistet. Während der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, während der adulte Körper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterhält. Als kennzeichnend für die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tatsächlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschränkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine hämatopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Präimplantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich präferentiell in den fötalen hämatopoetischen Geweben befinden. Für humane hämatopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese hämatopoetische Vorläufer in hämatopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chimärer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und hämatopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen lässt sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der frühen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden können. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegenüber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab.
Für die Verwendung von zellbasierten Therapeutika ist vor allem die korrekt Identifikation
sowohl vom Ausgangsmaterial wie auch dem produziertem Material von
zentraler Wichtigkeit. In dieser Arbeit wurde eine Methodik entwickelt, welche eine
nicht-invasive Klassifizierung von Zellen und zellulärer Entwicklung aufgrund ihrer
zweidimensionalen Magnetresonanz-Korrelationsspektren ermöglichte.
Hierzu wurde ein mobiler MR-Scanner mit einer Feldstärke von 0.5T und einem Isozentrum
von 1 cm3 verwendet. Aufgrund der kompakten und leichten Bauweise war
es möglich, das System in normalen Zellkulturlaboren zu verwenden. Von den Proben
wurde ein zweidimensionales T1/T2 -Korrelationsspektrum aufgenommen, anhand
dessen die Zellen klassifiziert werden sollten. Mithilfe von Agarose-Dotagraf® -Zell-
Phantomen konnte die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Messsystems und der
verwendeten Sequenz validiert werden.
Aufgrund der unter Umständen recht langen Messzeiten der MR-Technologie war
auch die Handhabung und Kultur der Zellproben während des Messprozesses von
großer Bedeutung. Um hierfür den Durchsatz an Proben zu erhöhen, wurde eine kostengünstige
und ebenfalls mobile Robotikanlage entwickelt. Diese basierte auf dem
kommerziell erhältlichen Roboterarm Braccio, welcher durch einen Arduino Mega
Mikrocontroller gesteuert wurde. Mit bis zu 24 Proben pro Tag konnte durch die
Automatisierung der Durchsatz an Proben um den Faktor 3 – 4 gesteigert werden.
Durch den entwickelten Prozess war es möglich, eine umfangreiche Datenbank –
bestehend aus 362 unabhängigen Messungen (biologische Replikate) – aufzubauen.
Die Datenbank enthielt Messungen von zehn unterschiedlichen Zelllinien. Zusätzlich
wurden T1/T2 -Korrelationsspektren von mesenchymalen Stromazellen (MSCs)
vor und nach deren Differenzierung zu Adipocyten aufgenommen, um ihre zelluläre
Entwicklung nicht-invasiv charakterisieren zu können.
Die aufgenommenen Daten wurden mithilfe einer geeigneten Support Vector Machine
wie auch angepassten künstlichen neuronalen Netzwerken klassifiziert. Mithilfe
dieser Methoden konnten die Zelllinien und MSCs anhand ihrer aufgenommenen
Korrelationsspektren mit einer Genauigkeit von bis zu 98% klassifiziert werden.
Diese hohe Treffsicherheit legte den Schluss nahe, dass die Kombination aus nichtinvasiver,
zweidimensionaler T1/T2 -MR-Relaxometrie und der Verwendung von geeigneten
Methoden des machine learning und der künstlichen Intelligenz eine effiziente
Methodik für die nicht-invasive Klassifizierung von Zellen sowie zellulärer
Entwicklung darstellt.
The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry
(MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation.