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Die WHO-Klassifikation der Hirntumoren von 2016 ebnete den Weg für molekulare Marker und Therapie-Angriffspunkte. Der Transkriptionsfaktor ATF5 könnte ein solcher sein. Er unterdrückt die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen und wird in Glioblastomen (GBM) überexprimiert. Daten zur ATF5-Expression in WHO Grad II Gliomen (LGG) und GBM-Rezidiven sind nur spärlich vorhanden. Daher untersuchten wir 79 GBM, 40 LGG und 10 Normalhirnproben auf ihre ATF5-mRNA- und Proteinexpression mit quantitativer Echtzeit-PCR bzw. Immunhistochemie und verglichen sie mit multiplen, retrospektiv erhobenen klinischen Charakteristika der Patienten. ATF5 war in LGG und GBM verglichen zum Normalhirn sowohl auf mRNA-, als auch Proteinebene überexprimiert. Obwohl die ATF5-mRNA-Expression im GBM eine erhebliche Fluktuationsrate zeigte, gab es keine signifikanten Expressionsunterschiede zwischen GBM-Gruppen unterschiedlicher biologischer Wachstumsmuster. ATF5-mRNA korrelierte mit dem Alter der Patienten und invers mit der Ki67-Färbung. Kaplan Meier- und Cox-Regressionsanalysen zeigten eine signifikante Korrelation der ATF5-mRNA-Expression mit dem Überleben nach 12 Monaten sowie dem progressionsfreien Überleben. Die Methylierung des Promotors der O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist ein etablierter Marker in der Therapie des GBMs. Sie ist mit dem therapeutischen Ansprechen auf Temozolomid und dem Überleben assoziiert. Uns fielen inzidentell Veränderungen der MGMT-Promotormethylierung auf, woraufhin wir den aktuellen Wissensstand mittels einer ausführlichen Literatur-Metaanalyse zusammenfassten. Dabei fanden wir Veränderungen der MGMT-Promotormethylierung bei 115 der 476 Patienten. Wir schlussfolgern, dass die ATF5-mRNA-Expression als prognostischer Faktor für das Überleben der Patienten dienen könnte. Da seine in vitro-Inhibition zu einem selektiven Zelltod von Gliomzellen führte und wir eine Überexpression in glialen Tumoren nachweisen konnten, zeigt ATF5 Potential als ubiquitäres Therapieziel in Gliomen. Zum aktuellen Zeitpunkt ergibt sich keine klare Indikation, den klinischen Standard der MGMT-Teststrategie zu verändern. Trotzdem könnte eine erneute Testung der MGMT-Promotormethylierung für zukünftige Therapieentscheidungen sinnvoll sein und wir regen an, dass dieses Thema in klinischen Studien weiter untersucht wird.
Gegenstand der Arbeit: Es wurde der Einfluss einer Ausreifung dendritischer Zellen mit Poly(I:C), R848 und Prostaglandin E2 (=tlrDCs) zur Verwendung im Rahmen der Tumorvakzine untersucht. Für den Einsatz einer doppelten TLR-Stimulation gibt es zahlreiche zellphysiologische Gründe, wobei PGE2 als Motilitätsförderer eingesetzt wird. Es besitzt negative Teilwirkungen auf die Zytokinsekretion, eine verbesserte Migration stellt aber die wichtigste Stellgröße zur Optimierung der Tumorvakzine dar.
Ergebnisse: Für tlrDCs konnte neben einer hohen Fähigkeit zu Migration und Kostimulation eine überlegene Immunstimulation für naive CTLs und TH1/TC1-Antworten in einem antigenspezifischen Primingmodell nachgewiesen werden. Eine Ausreifungsdauer von 16 h erscheint für die Zytokinsekretion der DCs günstig. Es lässt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit für die Generation von Central-Memory-T-Zellen und das T-Zell-Homing ins ZNS ableiten.
Das hohe invasive Potential und die starke Resistenz gegen Radio-/Chemotherapie von Glioblastoma multiforme (GBM) Zellen machen sie zu dem tödlichsten Tumor ihrer Art. Es ist deshalb von großem Interesse die Grundlagen, welche der Migrationsfähigkeit und DNA Reparatur zu Grunde liegen, besser zu verstehen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zwei Algorithmen zur automatischen Analyse der Migration in der Einzelzellverfolgung und im Wundheilungsassay modifiziert. Die Auswertung der Daten konnte automatisch und somit schnell, effektiv und mit geringerem Arbeitsaufwand durchgeführt werden. Mit Hilfe dieser automatischen Algorithmen wurde die Migrationsfähigkeit von zwei GBM-Zelllinien (DK-MG und SNB19) untersucht. Zusätzlich wurde die konfokale Laserscanning- sowie die hochauflösende dSTORM-Fluoreszenzmikroskopie verwendet um die, der Zellbewegung zu Grunde liegende, Struktur des F Aktin und der fokalen Adhäsionskinase (FAK) aufzulösen und darzustellen. Unter Anwendung dieser genannten Methoden sind die Effekte des dualen PI3K/mTOR Inhibitors PI-103 alleine und in Kombination mit dem Hsp90 Inhibitor NVP AUY922 mit und ohne Bestrahlung auf die Bewegung untersucht worden. Es konnte festgestellt werden, dass sich beide Zelllinien deutlich in ihrem migratorischem Potential in vitro unterscheiden und zudem auch markante Unterschiede in ihrer Morphologie aufweisen. Die weniger invasiven DK MG-Zellen besitzen eine polarisierte Zellstruktur, wohingegen SNB19-Zellen sich durch multipolare ungerichtete Bewegung auszeichneten. Zudem wurde die Migration, durch PI3K/mTOR Inhibition mit PI-103 bei den DK-MG-Zellen (p53 wt, PTEN wt), sehr effektiv unterdrückt. Wohingegen sich die SNB19-Zellen (p53 mut, PTEN mut) resistent gegen diesen Inhibitor zeigten. Hsp90 Inhibition offenbarte in beiden Zelllinien einen starken inhibitorischen Effekt auf die Migration der Zellen sowie die Reorganisierung des F Aktinskelettes.
In der zweiten Hälfte dieser Arbeit wurde ein Augenmerk auf die DNA-DSB-Reparatur der GBM Zellen nach ionisierender Strahlung gelegt. Zunächst wurde eine automatische Analysesoftware „FocAn-3D“ entwickelt, mit dessen Hilfe die DNA Doppelstrangbruchreparaturkinetik untersucht werden sollte. Diese Software ermöglicht es die gesamten Zellkerne mit ihren γH2AX-Foci in 3D-cLSM-Aufnahmen zu untersuchen. Es konnte somit eine Verbesserung der Genauigkeit in der Auszählung der γH2AX-Foci erreicht werden, welche 2D beschränkter Software verwehrt bleibt. Mit FocAn-3D konnte der gesamte Verlauf der Induktions- und Abbauphase der γH2AX-Foci in DK MG- und SNB19-Zellen mit einem mathematischen Modell ausgewertet und dargestellt werden. Des Weiteren wurde die Nanometerstruktur von γH2AX- und pDNA-PKcs-Foci mittels hochauflösender dSTORM-Mikroskopie untersucht. Konventionelle Mikroskopiemethoden, begrenzt durch das Beugungslimit und einer Auflösung von ~200 nm, konnten die Nanometerstruktur (<100 nm) der Reparaturfoci bisher nicht darstellen. Mit Hilfe der beugungsunbegrenzten dSTORM-Mikroskopie war es möglich in DK MG- und SNB19-Zellen die Nanometerstruktur genannten Reparaturproteine in den Foci mit einer Auflösung von bis zu ~20 nm darzustellen. γH2AX-Foci zeigten sich als eine Verteilung aus einzelnen Untereinheiten („Nanofoci“) mit einem Durchmesser von ~45 nm. Dies lässt die Vermutung zu, dass es sich hier um die elementare Substruktur der Foci und somit der γH2AX enthaltenen Nukleosome handelt. DNA-PK-Foci wiesen hingegen eine diffusere Verteilung auf.
Die in dieser Arbeit ermittelten Unterschiede im Migrationsverhalten der Zellen rechtfertigen eine weitere präklinische Untersuchung der verwendeten Inhibitoren als potentielle Zelltherapeutika für die Behandlung von GBM. Zudem konnte sich dSTORM als machtvolles Hilfsmittel, sowohl zur Analyse der Migration zugrundeliegenden Zytoskelettstruktur und der Effekte der Hsp90 Inhibierung, als auch, der Nanostruktur der DNA-DSB-Reparaturfoci herausstellen. Es ist anzunehmen, dass beugungsunbegrenzte Mikroskopiemethoden sich als bedeutende Werkzeuge in der medizinischen und biologischen Erforschung der DNA-Reparaturmechanismen herausstellen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte ImageJ Plugin „FocAn-3D“ bewies sich ebenfalls als ein vielversprechendes Werkzeug für die Analyse der Reparaturkinetik. Mit Hilfe von „FocAn-3D“ sollte es somit möglich sein u.a. den Einfluss gezielter Inhibition auf den zeitlichen Verlauf der Induktion und des Abbaus der DNA-Reparaturmaschinerie genauer zu studieren.
Metall-basierte Antitumorwirkstoffe wie Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin sind weltweit für die Behandlung verschiedener Krebsarten zugelassen. Resistenzbildung, starke Nebenwirkungen und ein eingeschränktes Spektrum responsiver Tumoren schränken jedoch ihren Anwendungsbereich ein. Daher ist die Suche nach neuen Platinverbindungen mit verbesserten Eigenschaften sowie Antitumor-aktiven Metallkomplexen anderer Metalle ein aktuelles Forschungsthema. Durch die Einbettung der Wirkstoffe in entsprechende Trägermaterialien und eine Freisetzung mit präziser zeitlicher und räumlicher Kontrolle sollten sich zudem die Nebenwirkungen deutlich reduzieren lassen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde daher eine Serie von quadratisch-planaren Platin(II)- und Palladium(II)-Komplexen mit N^N^S-Chelatliganden auf der Basis von N-Phenyl-2-(pyridin-2-ylmethylen)hydrazin-1-carbothioamid und N-Phenyl-2-(chinolin-2-ylmethylen)hydrazin-1-carbothioamid synthetisiert, die mit längeren Alkylketten funktionalisiert wurden, um eine hohe Affinität für Lipid-basierte Microbubbles als Träger zu erreichen, aus denen die Metallkomplexe dann unter Einwirkung von Ultraschall freigesetzt werden sollten. Es wurden drei verschiedene Ligandenfamilien ausgehend von der Grundstruktur L = R1-CR2=N-NH-C(S)-NH-R3 synthetisiert, wobei R1 = 2-Pyridyl oder 2-Chinolinyl, R2 = H, CH3, C8H17 oder C10H21 und R3 = CH3 oder C6H5 gewählt wurden. Die Umsetzung der Liganden mit Kaliumtetrachloridoplatinat(II), Natriumtetrachloridopalladat(II) oder [PdCl2(cod)] mit cod = 1,5-Cyclooctadien führte zu neutralen N^N^S-Komplexen [MCl(L)] mit M = Pd, Pt in allgemein guter Ausbeute. Die Kristallstruktur von [PtCl(L)] mit R1 = 2-Pyridyl, R2 = C10H21 und R3 = CH3 bestätigte zudem die quadratisch-planar Koordination des Metalls durch den N^N^S-koordinierten Liganden und ein Chlorid-Anion. Die Verbindungen mit R3 = CH3 zeigen im 195Pt NMR zwei Peaks, was auf das Vorliegen eines Isomerengemischs hindeutet, wobei die Daten vermuten lassen, dass neben der N^N^S-gebundenen Hauptspezies noch eine weitere mit N^N^N-koordiniertem Liganden und freier SH-Gruppe vorliegt. Solche Isomerengemische sind für biologischen Anwendungen ungeeignet, da die Isomere eine unterschiedliche Aktivität aufweisen können. Die anderen Platin(II)-Komplexe zeigen dagegen im 195Pt NMR nur einen Peak und sind somit für Cytotoxizitätsstudien geeignet. Mit Hilfe des MTT-Assays wurden EC50-Werte an verschiedenen Gliablastom-Zellinien für zwölf einheitliche Komplexe bestimmt. Für die potentesten Verbindungen wurden EC50-Werte im unteren mikromolaren Bereich ermittelt (2–9 µM), so dass die Aktivität teilweise sogar die von Cisplatin als Referenzverbindung übertraf. Insbesondere die Variation der aromatischen Oberfläche in den Pyridyl- vs. Chinolinylverbindungen hatte jedoch keinen wesentlichen Einfluss auf die EC50-Werte. Zudem führte eine Verlängerung der R2-Seitenkette bei den Palladium(II)-Verbindungen zu einer niedrigeren Aktivität. Die Verteilungskoeffizienten logP ergaben für alle Verbindungen recht ähnliche positive Werte, was die Lipophilie der Neutralkomplexe belegte. Für eine weitere Strukturvariation wurden außerdem zwei Azido-Komplexe [M(N3)(L)] mit M = Pd, Pt in moderater Ausbeute synthetisiert. Diese wurden dann in einer „iClick“-Reaktion unter sehr milden Bedingungen mit Dimethylacetylendicarboxylat (DMAD) und 4,4,4-Trifluorobut-2-insäureethylester zu den Triazolat-Komplexen [M(triazolateR,R')(L)] umgesetzt. Durch 1H NMR- und 19F NMR-spektroskopische Untersuchungen wurden gezeigt, dass diese teilweise als Isomerengemische vorliegen, da das Triazolat entweder über das N1-, N2- oder N3-Stickstoffatom an das Metall gebunden sein kann. Für eine ausgewählte Verbindung mit M = Pt und DMAD als Alkin wurde die Kinetik der „iClick“-Reaktion mit Hilfe der 1H NMR Spektroskopie untersucht. Die ermittelte Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung k2 = (1.82 ± 0.05).10-1 L mol-1 s 1 ist vergleichbar zum Beispiel der der etablierten strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). Für die Einbettung der lipophilen Metallkomplexe in ein Ultraschall-aktivierbares Trägersystem wurden aus Dipalmytoylphosphatidylcholin, 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphat, 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-methoxy(polyethylenglycol)-2000 Ammonium Salz und Komplexlösung unter Zusatz von Octafluopropan gasgefüllte Microbubbles hergestellt. Stabilitätsversuche zeigten, dass die Bläschenzahl selbst unter Normalbedingungen innerhalb von 2 h um 50% abnimmt. Daher sollten die Microbubbles vor jeder Verwendung täglich frisch hergestellt und möglichst unmittelbar danach verwendet werden. Ein unmittelbares Zerplatzen der Bläschen wurde durch Behandlung mit Ultraschall bei 500 Hz erreicht. Die Viabilität der verwendeten GaMG-Zellen wudre unter diesen Bedingungen jedoch nicht beeinträchtigt. Dennoch war die auf die Microbubbles geladene Platin-Konzentration zu niedrig, um mit dem MTT-Assay einen signifikanten Unterschied zwischen beladenen und unbeladenen Bläschen zu erreichen, so dass hier in Zukunft noch weitere Optimierungen erforderlich sein werden.
Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die kurz nach Elektroporation eintretende hämolytische Zellbewegung von humanen Erythrozyten erstmals quantitativ untersucht, um den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Bewegung aus dem Ausstoß von unter Druck stehendem Zytosol resultierte. Durch weitere Experimente wurde die Beteiligung des Nicht-Muskel-Myosins NMIIA am Aufbau des zytosolischen Überdrucks nachgewiesen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein molekular-mechanischer bisher unbekannter NMII-basierter Mechanismus der rapiden Ghostbildung beschrieben. Diese Erkenntnis könnte biomedizinische Relevanz besitzen, da der Abbau von Erythrozyten in der Milz die Transformation zu Hb-armen Ghosts voraussetzt.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Hirntumor Glioblastoma multiforme (GBM), dessen Rezidiv hauptsächlich auf Strahlenresistenz und Zellinvasion zurückzuführen ist. Deshalb wurde mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) die Nanostruktur des DSB-Markers Histon γH2AX und des DNA-Reparaturfaktors DNA-PKcs in bestrahlten GBM-Zellen analysiert. Anhand von dSTORM-Rekonstruktionen wurde erstmals gezeigt, dass die beiden Proteine kaum Kolokalisation im Nanometerbereich aufweisen.
Zunehmend wird die anomale Expression von Membrantransportern aus der SLC-Familie mit der Migration von Krebszellen in Verbindung gebracht. Der finale Abschnitt befasste sich daher mit der subzellulären Lokalisierung der Transporterproteine SLC5A1 und SLC5A3 in GBM-Zellen, um ihre Beteiligung an der Zellmigration nachzuweisen. Dabei wurde erstmals gezeigt, dass der Leitsaum der untersuchten GBM-Zellen deutliches SLC5A1- und SLC5A3-Signal aufwies. Basierend auf diesen Befunden wurden den Transportern unterschiedliche Aufgaben bei der zellmigrativen lokalen Volumenregulation zugeschrieben. Somit ergänzen SLC5A1 und SLC5A3 das migrationsassoziierte Krebszell-Transportom.
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system.
It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models.
In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected.
Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine
In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development.
Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2.
Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt.
In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden.
Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf.
Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe.
Das Glioblastom ist der häufigste hirneigene Tumor des Erwachsenen. Es ist hoch invasiv, stark proliferierend und mit einer schlechten Prognose assoziiert. Heutige Therapiean-sätze zielen, neben der möglichst vollständigen Resektion des Tumorgewebes, vor allem auf Apoptoseinduktion durch DNA-Schäden in Tumorzellen. Daher ist die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Prozesse essentiell, um Verbesserungen bei den Behandlungsmöglichkeiten erzielen zu können. Der Proteasomenaktivator PA28γ wird im Hirngewebe stark exprimiert, über seine Funktion ist jedoch nur wenig bekannt. Er wurde als Interaktionspartner des Zellzyklus- und DNA-Schadensregulators Mad2b in einem Hefe Two-Hybrid Screen identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Wechselwirkung mittels eines GST-Pulldown Experimentes be-stätigt. Obwohl PA28γ in Verbindung mit der Zellproliferation gebracht wird, konnte in GBM-Zelllinien keine signifikante Änderung der Zellteilungsraten beobachtet werden. Allerdings unterstützte die vermehrte Expression von PA28γ die Apoptose. Um durch neue Interaktionspartner von PA28γ Hinweise auf dessen Funktion zu erhalten, wurde ein Hefe Two-Hybrid Screen durchgeführt: PA28gamma steuert den Abbau von p53 und verweist über die hier neu beschriebene Interaktion mit HIPK1 ebenfalls auf den programmierten Zelltod. Dieser pro-apoptotische Zusammen-hang wird unterstützt durch die Interaktion mit 1A6/DRIM-interacting protein. Die Inter-aktion der Sumo E2 Ligase Ubc9 mit PA28gamma war ein erster Hinweis für eine Sumoylierung des Proteasomenaktivators, die die PA28gamma Aktivität regulieren könnte. Gleichzeitig ist Ubc9, wie auch die E3-Ligase PIAS, im Zusammenhang mit Apoptose beschrieben worden. Diese Fragestellungen wurden in weiterführenden Arbeiten erforscht. Einen anderen Aspekt beleuchtet die Interaktion von PA28gammamit Catenin alpha. Durch diese Wechselwirkung könnte PA28gamma Einfluß auf Interzellulärkontakte nehmen. Gerade im Hin-blick auf das GBM, charakterisiert durch ausgeprägtes Migrations- und Invasionsverhal-ten, könnte die Regulation von Interzellulärkontakten von besonderer Bedeutung sein. Aufgrund der oben beschriebenen Eigenschaften von PA28gammasollte dieses Protein für eine Therapie mittels DNA-Schäden induzierter Apoptose erforscht werden. PA28gamma könnte bei diesen Vorgängen ein zentraler Faktor sein, dessen Manipulation die etablierten Therapieformen unterstützen und deren Wirkung verbessern.
Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der primäre maligne Hirntumor mit der höchsten Prävalenz bei Erwachsenen. Dieser astrozytäre Tumor ist durch ein besonders schnelles Wachstum und ein äußerst invasives Verhalten charakterisiert. Deshalb beträgt das mediane Überleben nach Diagnose trotz interdisziplinärer Therapie nur ungefähr 14,6 Monate.
Metastasis Associated in Colon Cancer-1 (MACC1) ist ein neuer prognostischer Marker für Metastasierung im kolorektalen Karzinom. Es ist ein transkriptioneller Regulator von Met, dem Rezeptor des Hepatocyte Growth Factor (HGF). Überexpression von MACC1 führt zur Induktion von Migration und Proliferation. Es wurde gezeigt, dass MACC1 auch in anderen Tumorentitäten wie dem Magenkarzinom, Bronchialkarzinom und hepatozellulärem Karzinom verstärkt exprimiert ist. Jedoch gab es bisher noch keine Daten über die Rolle von MACC1 in astrozytären Tumoren. Obwohl GBM nur selten metastasieren, ist ihr aggressives und invasives Verhalten mit dem von metastasierenden Tumoren vergleichbar. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit zu zeigen, dass MACC1 auch eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Glioblastomen spielen könnte.
Die MACC1-Expression von Glioblastomen wurde zunächst in silico mit frei zugänglichen Microarray-Platformen analysiert. Von Gewebeproben humaner niedergradiger Astozytome (LGA) und GBM wurde die MACC1- und Met-Expression mittels PCR bestimmt. Die Analyse der Expression auf Proteinebene wurde durch Immunhistochemie (IHC) von Patientengewebe durchgeführt. Funktionelle Analysen folgten in Form eines Sphäroidmigrationsassays von primären GBM Zellkulturen. Weiterhin wurde MACC1 in zwei GBM-Zelllinien stabil überexprimiert und deren Migration und Proliferation in Echtzeit gemessen. Komplettiert wurden die funktionellen Versuche durch einen Koloniebildungsassay.
Die Expression von MACC1 stieg mit zunehmendem WHO-Grad auf mRNA- und Proteinebene an. Die Analyse von MACC1 durch IHC erlaubte eine Differenzierung nicht nur zwischen ruhenden LGA und LGA welche später ein Rezidiv bildeten, bzw. Progress zeigten, sondern auch zwischen primären und sekundären GBM. Eine hohe MACC1-Expression war mit einer ungünstigen klinischen Prognose der Patienten assoziiert. Die endogene Expression von MACC1 korrelierte mit der Migrationsaktivität primärer GBM-Zellkulturen. Die Überexpression von MACC1 in GBM-Zelllinien induzierte Proliferation, Migration und Koloniebildung und korrelierte somit mit Schlüsseleigenschaften maligner Zellen.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit zum ersten Mal eine essentielle Rolle von MACC1 für die Pathogenese von Glioblastomen. Deshalb könnte MACC1 ein potentielles neues therapeutisches Ziel für die Behandlung von Glioblastomen sein und eventuell sogar als neuer prognostischer Marker dienen.
TTFields sind eine zugelassene Therapie für die Behandlung von Glioblastom IDH-Wildtyp. Es handelt sich dabei um elektrische Wechselfelder niedriger Intensität und mittlerer Frequenz, die therapeutisch aus zwei Richtungen durch ein tragbares, nicht-invasives Gerät appliziert werden. Sie verhindern die Spindelfaserbildung während der Mitose.
Die Wirkung vieler effektiver Chemotherapeutika ist im ZNS durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) eingeschränkt. Die BHS wird nach TTFields Applikation bei 100 kHz in einem murinen cerebEND-Zell-Modell vorübergehend geöffnet. Dieser Effekt wurde in dieser Arbeit zunächst mit Hilfe von Immunfluoreszenzmikroskopie und dann durch einen fraktionierten Western-Blot bestätigt, dass der mutmaßliche Wirkungsmechanismus von TTFields in der Delokalisierung des tight junction Proteins Claudin-5 von der Membran in das Zytoplasma liegt. TEER-Messungen zeigten, dass sich die Integrität der BHS durch 100 kHz TTFields nach 72 h verringerte und 48 h - 72 h nach Ende der Behandlung wieder normalisierte, auch wenn statt eines Behandlungsendes auf 200 kHz TTFields umgeschaltet wurde. Der zweite Teil der Untersuchung bestand darin, ein BHS-Modell aus humanen HBMVEC Zellen zu etablieren, um die Auswirkungen von TTFields im humanen System verifizieren zu können. Zunächst konnten keine Effekte von TTFields unterschiedlicher Frequenz auf eine HBMVEC-Monokultur festgestellt werden. In einer Kokultur mit Perizyten gab es eine erhöhte Expression von Claudin-5, Occludin und PECAM-1. Allerdings zeigten die TEER-Messungen und ein Permeabilitätsassay keine Unterschiede zwischen den Mono- und Kokultur-Modellen der BHS auf.
Durch eine transiente Öffnung der BHS könnte eine höhere Dosis von Therapeutika, die normalerweise die BHS nicht überwinden können, im ZNS erreicht werden. Damit könnten TTFields eine innovative Methode zur Behandlung von Hirntumoren und anderen Erkrankungen des ZNS darstellen. Die hier präsentierten Daten geben erste Hinweise in diese Richtung, müssen aber noch optimiert und verifiziert werden.