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Die Infektion mit dem Masernvirus (MV) stellt weltweit immer noch ein großes Problem dar. Trotz des vorhandenen Lebendimpfstoffs, der eine Erkrankung sicher zu verhindern vermag, haben nicht nur die Entwicklungsländer, in denen ein flächendeckender Impfschutz schwieriger zu erreichen ist, mit der Erkrankung und ihren Komplikationen zu kämpfen. Hat sich die Erkrankung klinisch manifestiert gibt es keine kausalen Therapiemöglichkeiten und es kann nur noch symptomatisch behandelt werden. Dies ist v.a. auch in Hinblick auf die schweren Komplikationen der Maserninfektion von Bedeutung. Bei Erstkontakt mit dem Masernvirus ist die Suszeptibilität nicht geimpfter Menschen sehr hoch. Das bedeutet, dass es in 95-98 % der Fälle nach einer Infektion mit dem Masernvirus auch zum klinischen Bild der Masern kommt, unabhängig von Alter und Geschlecht. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, potentielle Hemmstoffe der Maserninfektion auf ihre Wirkung zu testen und zu verstehen, wo im Infektions- und Replikationszyklus des MV sie eingreifen. Es wurden eine Reihe Substanzen mit potentiell-inhibitorischen Eigenschaften in Infektions-Hemmtests und im Zytotoxizitätstest untersucht, von denen im Anschluss die drei besten Inhibitoren (JK80, QD6-8 und Droseron) weiter untersucht wurden. JK80 und QD6-8 waren beide mit IC50-Werten um 30 µM und SI-Werten von über 2 nur mäßig spezifisch antiviral wirksam. Während JK80 vermutlich den Eintritt des MV in die Zellen verhindert, hemmt QD6-8 die intrazelluläre Virusreplikation und wäre im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger, spezifischer Medikamente gegen die Maserninfektion von grossem Interesse. Eine Zielmolekülanalyse der Substanz und die Testung anderer Derivate könnten Aufschluss darüber geben, wie Substanzen aussehen müssten, die eine spezifische Hemmung der intrazellulären Replikation bewirken können. Der Naturstoff Droseron könnte mit einer spezifischen Hemmung (IC50 ca. 10 µM; SIWert 6 im Fluoreszenzreader, bzw. IC50 ca. 2 µM; SI-Wert 30 in der Titration) eine mögliche Leitsubstanz für einen neuen MV-Inhibitor darstellen. Allerdings waren alle bisher getesteten Droseron-Derivate entweder weniger inhibitorisch wirksam oder deutlich zytotoxischer als Droseron selbst. Die Ergebnisse der Infektionshemmversuche mit Zugabe von Droseron vor, während oder nach der Infektion mit MV sprechen dafür, dass Droseron den Eintritt des Virus in die Zelle stört.
Die Infektion mit MV Wildtypvirus führt zu einer starken Immunsuppression und Sekundärinfektionen, die bei der Immunisierung mit einem attenuierten Vakzinestamm nicht auftreten. In vitro Studien zeigen, dass sowohl MV Wildtyp- als auch Impfstamminfizierte Zellen die Mitogen-induzierte Proliferation von humanen Blutlymphozyten inhibieren. Zur Bestätigung dieser Befunde im Baumwollrattenmodell wurde gezeigt, dass in vitro MV-infizierte Zellen die Proliferation der naiven Milzzellen hemmen und keine Unterschiede zwischen Wildtypen und Impfstämmen bestehen. Im Gegensatz dazu wurden nach intranasaler Infektion von Baumwollratten Unterschiede hinsichtlich der Proliferationsinhibition, Virusreplikation und Ausbreitung zwischen Wildtypvirus WTF und Impfstamm Edm gefunden. Nach intranasaler Infektion mit 105 TCID50 WTF war am Tag 4 die Proliferation bis zu 40% inhibiert. Bis zu 20 Tagen nach Infektion mit WTF wurde eine Proliferationsinhibition gemessen und das Virus in den drainierenden Lymphknoten bis Tag 4 nachgewiesen. Die intranasale Infektion mit Dosen von 103 TCID50 WTF bzw. mit 2-4x106 TCID50 Edm konnten im gleichem Maße die T-Zell- Proliferation hemmen. Somit war eine 1000fach niedrigere Dosis an WTF ausreichend, die gleiche hemmende Wirkung zu erzielen. Der gleiche Effekt wurde bei weiteren Wildtypstämmen (Bilthoven, ICB) und Impfstämmen gefunden. Eine Ursache für den unterschiedlich immunsuppressiven Effekt zwischen Wildtypen und Impfstämmen könnte die unterschiedliche Rezeptornutzung sein. Wildtypviren benutzen CD150 als Rezeptor und Impfstämme sowohl CD150 als auch CD46. Die Impfstämme wurden ursprünglich von Edm Wildtyp durch Passagierung auf Fibroblasten-Zellinien attenuiert und adaptierten an die CD46-Rezeptornutzung. Durch die dabei erfolgte Adaptation an CD46 wurde der Virus attenuiert. Dieses Phänomen konnte auch nach Passagierung eines Wildtypvirus auf verschiedenen Zelllinien gezeigt werden. Der auf lymphoiden Zellen passagierte Wildtyp WTFb und der auf Fibroblasten-Zellen WTFv passagierte haben unterschiedliches immunsuppressives Potential. Interessanterweise zeigte Edm-Wildtyp nach 9 Passagen auf Fibroblasten- Zellinien einen attenuierten Phänotyp im Baumwollrattenmodell. Allerdings revertierte dieser Virus bereits nach 3 Passagen in der Baumwollratte zu einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus. Die Untersuchung der rekombinanten Viren Edm (WTF H), Edm (WTF F) und Edm (WTF H+F) zeigte, dass Impfstämme, welche das Oberflächenprotein H von WTF anstelle des H-Proteins von Edm tragen, proliferationshemmend sind und sich im Organismus ausbreiten. Das F-Protein von Edm oder WTF hatte keinen Einfluß auf Immunsuppression und Virusausbreitung, Die Rückmutation in dem WTF H-Protein an der Aminosäure-Position 481 von Aspargin zu Tyrosin (N481Y) veränderte die Rezeptornutzung von CD46 auf CD150 und den Phänotyp von einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus zu einem nichtimmunsuppressiven, nicht-ausbreitenden Virus. Da die Aminosäureposition 481 einen starken Einfluß auf die Benutzung von CD46 oder CD150 ausübt, scheint somit das HProtein von WTF die immunsuppressive Wirkung und Virusausbreitung maßgeblich zu beeinflussen. Wie beim Menschen konnten in der Baumwollratte MV-infizierte Makrophagen nachgewiesen werden. Durch die Infektion mit einem GFP-MV wurde die Virusreplikation nachgewiesen, das Virus wurde aus Makrophagen rückisoliert und durch Kokultivierung mit Indikatorzellen die Ausprägung des zytopathischen Effektes fluoreszenzmikroskopisch beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten Unterschiede zwischen WTF und Edm-infizierten Makrophagen hinsichtlich der Proliferationsinhibition von Milzzellen. Der direkte Kontakt von Wildtyp WTFinfizierten Makrophagen hemmte die T-Zell-Proliferation. Dagegen wurde durch Edminfizierte Makrophagen keine T-Zell-Proliferationinhibition ausgelöst. Erklären läßt sich das möglicherweise mit dem unterschiedlichen Sekretionsprofil verschiedener Interleukine von WTF und Edm-infizierten Makrophagen, da bei WTF-infizierten Makrophagen eine Unterdrückung der Produktion von IL-12 gefunden wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die im Menschen beobachteten Unterschiede hinsichtlich Virusausbreitung und Immunsuppression zwischen Wildtypenund Impfstämmen mit den Befunden in der Baumwollratte übereinstimmen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Interaktion von MV H-Protein und den Rezeptoren mit der Immunsuppression und Virusausbreitung korreliert. Die Unterdrückung der Sekretion von IL-12 in Makrophagen aus der Baumwollratte könnte die Hypothese unterstützen, dass die Immunsuppression während der MV-Infektion durch eine fehlgeleitete Th2-Antwort begünstig wird.
Das Masernvirus (MV) gehört zu den negativ-strängigen RNA-Viren der Familie der Paramyxoviridae und verursacht beim Menschen akute und subakute Enzephalitiden. Es wurde beschrieben, dass sich MV-RNA in den Endothelzellen von SSPE (subakute sklerosierende Panenzephalitis)-Gehirnen nachweisen lässt (Cosby & Brankin, 1995). In dieser Arbeit konnte ich eine CD46- und CD150-unabhängige Infektion von Endothelzellen durch Wildtyp-MV nachweisen. Ferner wurde beschrieben, dass das Typ II-Interferon (IFN-g) im Serum von Patienten mit akuten Masern und nach einer Masernimpfung erhöht ist (Okada et al., 2001; Ovsyannikova et al., 2003) und dieses Zytokin lässt sich auch in Gehirnläsionen von SSPE-Patienten detektieren (Nagano et al., 1994). Basierend auf diesen Erkenntnissen, konnte ich eine durch das Enzym Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) vermittelte antivirale Aktivität von IFN-g gegen MV nachweisen. Endothelzellen (EZ) sind bei der akuten Masernerkrankung oder nachfolgenden Komplikationen, die auf einer persistierenden Infektion basieren, wichtige Zielzellen. CD46 und CD150 (signalling lymphocytic activation molecule, SLAM) wurden als zelluläre Rezeptoren für MV beschrieben (Dörig et al., 1993; Naniche et al., 1993; Tatsuo et al., 2000). Es konnte gezeigt werden, dass humane EZ aus dem Gehirn und aus der Nabelschnurvene (HBMECs und HUVECs) zwar CD46, aber auf RNA- und auf Proteinebene kein SLAM exprimieren. Diese Zellen konnten jedoch mit den Wildtyp-MV, die CD46 nicht als Rezeptor benutzen, infiziert werden. Diese Untersuchungen deuten auf die Präsenz eines zusätzlichen Rezeptors für die Aufnahme und Verbreitung von MV in humanen EZ hin. Der antivirale Effekt von Interferonen spielt bei der MV-Vermehrung eine entscheidende Rolle und variiert jedoch in Abhängigkeit von der Wirtszelle (Schnorr et al., 1993). Im Gegensatz zu den attenuierten MV-Impfstämmen können Wildtyp-MV den antiviralen Effekt von Typ I-IFN blockieren, indem sie die Induktion von IFNa/b hemmen und die Sensivität gegenüber dem antiviralen Effekt vermindern. Dabei spielen die V- und C-Proteine des MV eine Rolle (Naniche et al., 2000; Patterson et al., 2000; Shaffer et al., 2003), die mit zellulären STAT-Proteinen und IRF-9 interagieren (Palosaari et al., 2003; Takeuchi et al., 2003; Yokota et al., 2003). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IFN-g die Replikation aller MV-Stämme vorwiegend in Endo- und Epithelzellen hemmen kann und, dass diese durch IFN-g induzierte, antivirale Aktivität mit der Induktion der Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) korreliert. IDO ist ein Enzym, welches in Anwesenheit von Sauerstoff den Abbau von Tryptophan zu Kynurenin katalysiert (Hirata et al., 1975) und hauptsächlich antiparasitäre, antibakterielle und antivirale (Bodaghi et al., 1999; Adams et al., 2004) Effekte vermittelt. Im Zusammenhang mit Masern wurde beschrieben, dass die Tryptophan Katabolite in SSPE-Patienten erhöht sind (Kurup & Kurup, 2002). Die Daten in dieser Arbeit zeigen, dass die durch IFN-g-induzierte antivirale Aktivität durch Zugabe von L-Tryptophan nahezu aufgehoben werden kann und daher IDO im Zuge der anti-MV Aktivität eine entscheidende Rolle spielt.
Im Gegensatz zu genetisch modifizierten Viren ermöglicht der Einsatz von siRNA zur RNA Interferenz (RNAi) die post-transkriptionelle Inhibition der Gen-Expression zur Analyse von Infektionen mit völlig identischen Viren. Mittels RNase-III hergestellter siRNA wurde die Expression der sechs Masernvirus Gene unterbunden. Ist die siRNA gegen das Nukleokapsid (N)-, das Phospho (P)- oder gegen das Large (L)- Protein gerichtet, kommt es zur effektiven Einschränkung der Replikation und der generellen Gen-Expression. Diese drei Proteine sind für Transkription und Replikation essentiell, da die Genprodukte dieser drei Proteine die RNA-abhängige RNA Polymerase und den Ribonukleoproteinkomplex (RNP) bilden. SiRNA gegen das Fusionsprotein (F) und das Hämagglutinin (H) schränken das Ausmaß der Zell-Zell Fusion ein. Interessanterweise führt die Inhibition der Expression des Matrix-Proteins (M) nicht nur zu einer Verstärkung der fusogenen Aktivität, sondern erhöht gleichzeitig die Expression der übrigen viralen mRNA und genomischer RNA um den Faktor 2-2,5, so dass das Verhältnis mRNA:Genom konstant bleibt. Dieser Befund lässt darauf schließen, dass M als negativer Regulator der viralen Polymeraseaktivität wirkt, und sowohl die Produktion von mRNA wie auch die Genom- Replikation in gleichem Maß beeinflusst. Anschließend wurden synthetische siRNAs gegen die L-mRNA gesucht. Effektive Sequenzen wurden dann, in Form einer shRNA Expressionskassette, in einen lentiviralen Vektor einkloniert. Damit sollen dann lentivirale Partikel hergestellt werden, mit denen Zellen infiziert werden können, so dass diese Zellen dann stabil siRNA exprimieren. Dieser Teil der Arbeit war zum Zeitpunkt der Niederschrift noch nicht beendet.
Semaphorin receptors in the immunological synapse: regulation and measles virus-driven modulation
(2010)
Measles virus (MV) infection causes approximately 164,000 deaths per year worldwide (WHO, 2008). The main cause of death is MV-induced immunosuppression but the underlying mechanisms are not fully understood. It has been suggested that MV renders T cells dysfunctional by disrupting the integrity of actin dynamics while MV infection of dendritic cells results in their inability to sustain T cell activation. During neuronal development, semaphorins (SEMAs), especially SEMA3A, induce a collapse of growing dendrites via the binding to plexin-A1 (plexA1) and its coreceptor neuropilin-1 (NP-1). The collapse results from a disruption of actin dynamics. In this study, the roles of these three molecules were investigated in human immune cells and their possible role in MV induced immunosuppression. The present data have shown that plexA1 is an important component of human immunological synapse (IS). It translocated transiently to the surface of T cells after CD3/28 ligation and accumulated at the stimulatory interface between T cells and DCs (or CD3/28 coated beads). When plexA1 expression was inhibited (RNAi) or its function was disrupted (exogenous blocking or dominant negative expression), T cell expansion was reduced. Upon MV exposure, translocation of plexA1 and NP-1, another important component of IS, towards the stimulatory interface in T cells was abrogated. Moreover, MV infection interfered with plexA1/NP-1 turnover in maturing DCs and promoted early and substantial release of SEMA3A from these cells, particularly in the presence of allogenic T cells. As revealed by scanning electron microscopy, the release of SEMA3A caused a transient loss of actin-based protrusions on T cells. SEMA3A affected chemotactic migration of T cells and DCs, and reduced formation of allogenic DC/T cell conjugates. In conclusion, MV targeted SEMA receptor function both by disrupting their recruitment to the IS and by promoting a premature release of their repulsive ligand, SEMA3A. Both of which could contribute to MV-induced immunosuppression.
Dendritische Zellen (DCs) sind als Zielzellen des MV für dessen Pathogenese von zentraler Bedeutung und fördern sowohl Dissemination und Transmission des Virus. Auf zellulärer Ebene findet sich eine Modulation des Sphingolipidmetabolismus in MV-infizierten DC-Kulturen. S1P selbst ist ein bioaktives Sphingolipid, das über auto- und parakrine S1P-Rezeptorstimulation Funktion, Migration und Positionierung von Immunzellen, aber auch als intrazellulärer Botenstoff Calcium-Haushalt, Apoptose und Proliferation reguliert. Über die an der Vermittlung der intrazellulären S1P-Effekte beteiligten Strukturen ist bisher weniger bekannt und der S1P-Metabolismus einzelner Zellen trotz Kompartiment-abhängiger Schwankungen der S1P-Konzentrationen kaum adressiert. Für murine DCs konnte eine kontinuierliche S1P-Produktion und Sekretion nachgewiesen werden. Ob dies auch auf humane DCs zutrifft und pathophysiologisch im Rahmen einer MV-Infektion moduliert wird, ist bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen S1Ps sowie dessen Metabolismus in humanen DCs quantitativ erfasst, und der Einfluss inflammatorischer, bakterieller und viraler (MV) Stimuli einbezogen. In Anbetracht der bekannten chemoattraktiven Potenz wurde nachfolgend der Beitrag S1Ps für die DC-induzierte T-Zellmigration untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass beide SphK Isoenzyme und auch die irreversibel degradierende SPL in humanen unreifen DCs (iDCs) auf mRNA-Ebene exprimiert werden. S1P konnte intrazellulär nachgewiesen werden, eine mit Erythroyzten vergleichbare Speicherkapazität ist nicht anzunehmen. Unter bakteriell oder inflammatorisch vermittelter Ausreifung (mDCs) wurde eine Reduktion des S1P Gehalts in DCs beobachtet. Abweichend davon behielten insbesondere stark MV infizierte DC-Kulturen die hohen S1P-Spiegel unreifer DCs bei, was möglicherweise neben der modulierten Chemokinsynthese und Oberflächenexpression ko-stimulatorischer Moleküle einen weiteren Parameter ihrer inkompletten Reifung nach MV Infektion reflektiert. Da die Veränderungen zwischen MV-infizierten DCs und mDCs nur für S1P, nicht aber für andere Sphingolipidmetaboliten messbar waren, liegt ihnen wohl eine Regulation der Sphingosinkinasen oder S1P degradierender Enzyme zugrunde. Bei unveränderter Akkumulation der hierfür spezifischen mRNAs müsste dies auf Ebene der Translation, Stabilität oder Aktivität der Enzyme beruhen.
Die indirekte Messung des extrazellulären S1Ps anhand der gegenläufigen S1P1-Dichte ließ vermuten, dass in DCs synthetisiertes S1P extrazellulär wirken konnte. Es kann dabei autokrin auf DCs wirken, beispielsweise deren Motilität oder Genexpression regulieren, ist aber auch Voraussetzung zum Aufbau eines S1P-Gradienten und damit parakriner Regulation lymphozytärer Migrationsvorgänge. Einen Beitrag S1Ps zur mDCs-induzierten T Zellchemotaxis konnte durch die erhobenen Daten mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Bezüglich der durch iDCs oder MV infizierte DCs induzierten T Zellchemotaxis konnte aufgrund experimenteller Limitationen keine abschließende Aussage zur Beteiligung S1Ps getroffen werden. Die T-Zellmigration auf DCs erwies sich im 2 D-System als gerichtete Bewegung. Weder Ausreifung noch MV-Infektion der DCs hatten Auswirkungen auf die Quantität der T-Zellmigration. Differentielle Expressionsmuster von Chemokinen in iDCs, mDCs und MV infizierten DCs sind jedoch bekannt und legen Variationen der Subset-Komposition innerhalb der migrierenden T Zellen nahe. Diese sollten gezielt in nachfolgenden Arbeiten untersucht werden.
Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit eine kontinuierliche Synthese S1Ps in DCs mit Stimulus-abhängiger Fluktuation nach. Eine MV Infektion löst dabei einen zu inflammatorischen und bakteriellen Stimuli divergenten Effekt auf den S1P-Gehalt aus mit möglichen pathophysiologischen Konsequenzen. Eine Modulation der T Zellchemotaxis und damit der DC-T-Zell-Interaktion wäre im Rahmen inflammatorischer, bakterieller oder viraler Szenarien denkbar. Unter inflammatorischen und bakteriellen Bedingungen trug S1P jedoch nicht zur T-Zellchemotaxis bei, für MV blieb dies unklar. Dahingegen zeigten weitere Experimente der Arbeitsgruppe einen autokrin vermittelten Beitrag des intrazellulär produzierten S1Ps zur Migration MV-infizierter DCs im respiratorischen Epithel und identifizierten damit einen bisher unbekannten Einflussfaktor einer erfolgreichen MV-Transmission.
Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen, die Pathogene erkennen und nach erfolgreicher Reifung spezifische adaptive Immunität induzieren. Die Infektion unreifer DCs durch Masernviren (MV) erfolgt CD150-abhängig und DC-SIGN-unterstützt. Infizierte DCs vermitteln wahrscheinlich den MV-Transport vom Respirationstrakt in sekundäre lym-phatische Gewebe, wo die MV-spezifische Immunität und die generalisierte Immunsuppressi-on initiiert werden sowie die MV-Transmission an T-Zellen stattfinden kann, die wesentlich für die Dissemination des Virus ist. Die MV-Infektion von iDCs initiierte deren Ausreifung begleitet von der moderaten Hochre-gulierung der CD150-Oberflächenexpression. Die Akkumulation viraler Proteine als auch die Freisetzung viraler Partikel waren in DCs im Vergleich zu Virus-produzierenden B-Zelllinie B95a beeinträchtigt. Diese Arbeit verglich die subzelluläre Verteilung der viralen Proteine in DCs und B95a-Zellen. In DC wiesen Matrix (M)-Proteine eine prominente Assoziation mit den Komponenten des Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes auf. Die ausgeprägte Relokali-sierung des Tetraspanins CD81 zu Phospho (P)-Protein-Kompartimenten und die Inhibition der räumliche Interaktion der untersuchten Tetraspanine waren spezifisch für B95a-Zellen. Weder in B95a-Zellen noch für DC konnte für MV ein virus-containing compartment (VCC) detektiert werden, das für HIV-1 zuvor beschrieben wurde. Um den zellulären Transport des M-Proteins in infizierten, lebenden DCs untersuchen zu können, wurde das Protein carboxyterminal mit dem Tetracystein (TC)-Tag fusioniert. Das M-TC Fusionsprotein zeigte alle untersuchten biologischen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins bezüglich seiner subzellulären Verteilung, der Assoziation mit DRMs sowie der Generierung und Freisetzung von virus-like particles (VPLs). Innerhalb des Viruskontextes interferierte der TC-Tag allerdings stark mit der Virusreplikation bzw. Freisetzung. Durch die Verminderung der Partikelproduktion in DCs wird eine spezielle MV-Transmissionsstruktur für die effiziente Übertragung an T-Zellen benötigt. Die MV-Transmission an autologe T-Zellen basierte vorwiegend auf Infektion von DCs (cis-Infektion) und weniger auf DC-SIGN-gebundenen Virus (trans-Infektion). Die Interaktion zwischen dem MV-Glykoprotein H mit seinem Rezeptor CD150 war wichtig für die Transmission. Die Transmission von MV erfolgte hauptsächlich durch die Bildung von Kontaktflächen, entspre-chend den beschriebenen virologischen Synapsen, wo virale Proteine akkumulierten und CD150 aktinabhängig rekrutiert wurde, und seltener über aktinreiche Filopodien. Die HIV-VS Markerproteine ICAM-1, aktiviertes LFA-1, CD81, DC-SIGN und der phosphorylierte Ezrin / Radixin / Moesin (ERM)-Proteinkomplex polarisierten zur MV-VS. Moesin und der Substanz P Rezeptor (SPR), die Prozesse des MV-Eintritts oder der Aufnahme unterstützen, akkumulierten ebenfalls in den Transmissionsstrukturen. Zusammengefasst zeigte diese Arbeit, dass die gebildete Plattform für MV-Transmission (MV-VS) wichtige Gemeinsamkeiten mit der HIV-VS teilt. In der MV-VS akkumulierten Proteine, die Aktindynamiken regulieren, die die Konjugatstabilität verstärken und die die Membranfusion unterstützen, die einen effizienten Eintritt des MV in T-Zellen ermöglichen.