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Der permanente Hypoparathyreoidismus ist charakterisiert durch eine unzureichende Produktion des Peptidhormons Parathormon. Die häufigste Ursache für einen Hypoparathyreoidismus sind Operationen im Halsbereich. Nach Schätzungen des Statistischen Bundesamtes kommen allein in Deutschland jährlich 500-4000 Neuerkrankungen hinzu. Die aus Kalzium und Vitamin D-Analoga bestehende Standardtherapie kann den Kalziumverlust durch die Niere nicht verhindern. Langfristig führt diese chronische Hyperkalzurie zur Niereninsuffizienz. Die bei anderen Hormonmangel-Erkrankungen wie Nebenniereninsuffizienz, Hypothyreose und Diabetes mellitus sehr erfolgreiche Hormonsubstitution befindet sich bei der Behandlung des Hypoparathyreoidismus noch im experimentellen Stadium. Einen Sonderfall der Hormonsubstitution stellt die Transplantation dar. Durch die Übertragung von Nebenschilddrüsengewebe wird die tagesrhythmische Parathormonsekretion wiederhergestellt. Im Gegensatz zur Autotransplantation, bei der nach Schilddrüsenoperationen Teile der eigenen Nebenschilddrüse vom Halsbereich in die Unterarmmuskulatur verlegt werden, kommt es bei der Allotransplantation (hier sind Transplantat und Empfänger genetisch nicht identisch) zur gefürchteten Abstoßung. Nur die dauerhafte Einnahme nebenwirkungsreicher immunsuppressiver Medikamente kann diese Immunantwort unterdrücken. Aus diesem Grund werden allogene Nebenschilddrüsentransplantationen in der Klinik auch nur in solchen Fällen durchgeführt, in denen der hypoparathyreoide Patient bereits transplantiert ist und daher ohnehin Immunsuppressiva erhält. Zur Immunologie der Abstoßung allogener Nebenschilddrüsentransplantate liegen kaum experimentelle Daten vor. In der vorliegenden Arbeit wurde insbesondere das Zusammenspiel von T-Lymphozyten und Makrophagen bei der Zerstörung von Nebenschilddrüsentransplantaten untersucht. Es scheint, dass die das Transplantat infiltrierenden Makrophagen neben ihrer Fähigkeit zur Antigenpräsentation auch als Effektorzellen an der Transplantatzerstörung beteiligt sind und dass dies durch aktivierte T-Lymphozyten gesteuert wird. In syngenen und allogenen Nebenschilddrüsentransplantaten, d.h. Transplantate, die zum Empfänger genetisch identisch bzw. nicht-identisch sind, wurden aktivierte Makrophagen nachgewiesen, die MHC-Klasse-II-Moleküle und kostimulatorische Moleküle auf der Zelloberfläche exprimieren. Zwischen Tag 3 und Tag 11 nach Transplantation befanden sich aktivierte T-Lymphozyten in den allogenen Transplantaten und zwischen Tag 4 und Tag 15 waren iNOS-positive Makrophagen als mögliche Effektorzellen nachzuweisen. Im Gegensatz dazu wurden in syngenen Nebenschilddrüsentransplantaten zwar aktivierte Makrophagen, aber keine aktivierten T-Lymphozyten nachgewiesen. Die aktivierten Makrophagen waren zudem nicht iNOS-positiv. Bei der Transplantatabstoßung handelt es sich um eine von T-Lymphozyten vermittelte Immunantwort. Um dies auch am Modell der heterotopen Nebenschilddrüsentransplantation zu untersuchen – hierzu werden die Nebenschilddrüsentransplantate unter die Nierenkapsel gelegt – wurden hypokalzämische Tiere mit dem für T-Lymphozyten immunogenen Peptid P1 sieben Tage vor Transplantation immunisiert. Wie erwartet, verkürzte sich die Transplantatfunktionszeit in diesen sensibilisierten Tieren von 15.8±1.8 Tagen auf 9.4±0.9 Tage. Das Muster der Zellinfiltration war ähnlich dem nicht-sensibilisierter Tiere. Wieder kam es kurz nach der Präsenz aktivierter T-Lymphozyten zum Auftreten iNOS-positiver Makrophagen, die bis zur vollständigen Zerstörung in den allogenen Nebenschilddrüsentransplantaten blieben. Aufgrund der Daten dieser Arbeit wird vermutet, dass die aktivierten Makrophagen bestimmte Signale von den aktivierten T-Lymphozyten erhalten, woraufhin diese das zur Produktion des zellschädigenden Stickstoffmonoxids (NO) notwendige Enzym iNOS exprimieren. Diese Ergebnisse deuten auf eine sehr eng abgestimmte Interaktion zwischen Makrophagen und T-Lymphozyten im Transplantat hin, die bisher so nicht beschrieben ist. Nebenschilddrüsentransplantate stellen somit ein attraktives Modell zur detaillierten Analyse der Immunologie der Transplantatabstoßung dar. Auch ist dieses Modell geeignet, insbesondere solche therapeutischen Strategien zu testen, die die Interaktion zwischen Makrophagen und T-Lymphozyten gezielt stören.
Die Infektion mit MV Wildtypvirus führt zu einer starken Immunsuppression und Sekundärinfektionen, die bei der Immunisierung mit einem attenuierten Vakzinestamm nicht auftreten. In vitro Studien zeigen, dass sowohl MV Wildtyp- als auch Impfstamminfizierte Zellen die Mitogen-induzierte Proliferation von humanen Blutlymphozyten inhibieren. Zur Bestätigung dieser Befunde im Baumwollrattenmodell wurde gezeigt, dass in vitro MV-infizierte Zellen die Proliferation der naiven Milzzellen hemmen und keine Unterschiede zwischen Wildtypen und Impfstämmen bestehen. Im Gegensatz dazu wurden nach intranasaler Infektion von Baumwollratten Unterschiede hinsichtlich der Proliferationsinhibition, Virusreplikation und Ausbreitung zwischen Wildtypvirus WTF und Impfstamm Edm gefunden. Nach intranasaler Infektion mit 105 TCID50 WTF war am Tag 4 die Proliferation bis zu 40% inhibiert. Bis zu 20 Tagen nach Infektion mit WTF wurde eine Proliferationsinhibition gemessen und das Virus in den drainierenden Lymphknoten bis Tag 4 nachgewiesen. Die intranasale Infektion mit Dosen von 103 TCID50 WTF bzw. mit 2-4x106 TCID50 Edm konnten im gleichem Maße die T-Zell- Proliferation hemmen. Somit war eine 1000fach niedrigere Dosis an WTF ausreichend, die gleiche hemmende Wirkung zu erzielen. Der gleiche Effekt wurde bei weiteren Wildtypstämmen (Bilthoven, ICB) und Impfstämmen gefunden. Eine Ursache für den unterschiedlich immunsuppressiven Effekt zwischen Wildtypen und Impfstämmen könnte die unterschiedliche Rezeptornutzung sein. Wildtypviren benutzen CD150 als Rezeptor und Impfstämme sowohl CD150 als auch CD46. Die Impfstämme wurden ursprünglich von Edm Wildtyp durch Passagierung auf Fibroblasten-Zellinien attenuiert und adaptierten an die CD46-Rezeptornutzung. Durch die dabei erfolgte Adaptation an CD46 wurde der Virus attenuiert. Dieses Phänomen konnte auch nach Passagierung eines Wildtypvirus auf verschiedenen Zelllinien gezeigt werden. Der auf lymphoiden Zellen passagierte Wildtyp WTFb und der auf Fibroblasten-Zellen WTFv passagierte haben unterschiedliches immunsuppressives Potential. Interessanterweise zeigte Edm-Wildtyp nach 9 Passagen auf Fibroblasten- Zellinien einen attenuierten Phänotyp im Baumwollrattenmodell. Allerdings revertierte dieser Virus bereits nach 3 Passagen in der Baumwollratte zu einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus. Die Untersuchung der rekombinanten Viren Edm (WTF H), Edm (WTF F) und Edm (WTF H+F) zeigte, dass Impfstämme, welche das Oberflächenprotein H von WTF anstelle des H-Proteins von Edm tragen, proliferationshemmend sind und sich im Organismus ausbreiten. Das F-Protein von Edm oder WTF hatte keinen Einfluß auf Immunsuppression und Virusausbreitung, Die Rückmutation in dem WTF H-Protein an der Aminosäure-Position 481 von Aspargin zu Tyrosin (N481Y) veränderte die Rezeptornutzung von CD46 auf CD150 und den Phänotyp von einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus zu einem nichtimmunsuppressiven, nicht-ausbreitenden Virus. Da die Aminosäureposition 481 einen starken Einfluß auf die Benutzung von CD46 oder CD150 ausübt, scheint somit das HProtein von WTF die immunsuppressive Wirkung und Virusausbreitung maßgeblich zu beeinflussen. Wie beim Menschen konnten in der Baumwollratte MV-infizierte Makrophagen nachgewiesen werden. Durch die Infektion mit einem GFP-MV wurde die Virusreplikation nachgewiesen, das Virus wurde aus Makrophagen rückisoliert und durch Kokultivierung mit Indikatorzellen die Ausprägung des zytopathischen Effektes fluoreszenzmikroskopisch beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten Unterschiede zwischen WTF und Edm-infizierten Makrophagen hinsichtlich der Proliferationsinhibition von Milzzellen. Der direkte Kontakt von Wildtyp WTFinfizierten Makrophagen hemmte die T-Zell-Proliferation. Dagegen wurde durch Edminfizierte Makrophagen keine T-Zell-Proliferationinhibition ausgelöst. Erklären läßt sich das möglicherweise mit dem unterschiedlichen Sekretionsprofil verschiedener Interleukine von WTF und Edm-infizierten Makrophagen, da bei WTF-infizierten Makrophagen eine Unterdrückung der Produktion von IL-12 gefunden wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die im Menschen beobachteten Unterschiede hinsichtlich Virusausbreitung und Immunsuppression zwischen Wildtypenund Impfstämmen mit den Befunden in der Baumwollratte übereinstimmen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Interaktion von MV H-Protein und den Rezeptoren mit der Immunsuppression und Virusausbreitung korreliert. Die Unterdrückung der Sekretion von IL-12 in Makrophagen aus der Baumwollratte könnte die Hypothese unterstützen, dass die Immunsuppression während der MV-Infektion durch eine fehlgeleitete Th2-Antwort begünstig wird.
THP-1-Zellen und differenzierte Makrophagen weisen TRB3 in geringer Menge auf. Bei einer Stimulation der Zellen mit Thapsigargin zeigt sich eine dosisabhängige Zunahme von TRB3, CHOP und BAX in beiden Zelttypen, wobei die Effekte bei Makrophagen stärker ausgeprägt waren. Während Thapsigargin die TRB3- Konzentration in THP-1-Zellen und differenzierte Makrophagen auch unter Knockdownbedingungen erhöhte, unterschied sich das Ausmaß des Knockdowneffektes dabei nicht wesentlich von dem bei unbehandelten, nicht-Thapsigargin stimulierten Zellen. Es scheint, dass die CHOP- und BAX- Regulation nicht allein TRB3-abhängig ist, da ein signifikanter Knickdown von TRB3 nur mit einer tendenziellen Verminderung von BAX und einer leichten, ebenfalls nicht-signifikanten Erhöhung von CHOP einherging. Unter Behandlung mit Thapsigargin zeigte sich bei beiden Zelttypen eine dosisabhängige Reduktion der Cholesterinaufnahme, wobei diese TRB3- unabhängig erscheint, zumal sich bei TRB3-Knockdown keine signifikante Änderung in der Cholesterinaufnahme erkennen ließ.
The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy
(2015)
Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B.
In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response.
These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages.
Cardiac healing after myocardial infarction (MI) represents the cardinal prerequisite for proper replacement of the irreversibly injured myocardium. In contrast to innate immunity, the functional role of adaptive immunity in postinfarction healing has not been systematically addressed. The present study focused on the influence of CD4+ T lymphocytes on wound healing and cardiac remodeling after experimental myocardial infarction in mice. Both conventional and Foxp3+ regulatory CD4+ T cells (Treg cells) became activated in heart draining lymph nodes after MI and accumulated in the infarcted myocardium. T cell activation was strictly antigen-dependant as T cell receptor-transgenic OT-II mice in which CD4+ T cells exhibit a highly limited T cell
receptor repertoire did not expand in heart-draining lymph nodes post-MI. Both OT-II and major histocompatibility complex class II-deficient mice lacking a CD4+ T cell compartment showed a fatal clinical postinfarction outcome characterized by disturbed scar tissue construction that resulted in impaired survival due to a prevalence of left-ventricular ruptures. To assess the contribution of anti-inflammatory Treg cells on wound healing after MI, the Treg cell compartment was depleted using DEREG mice that specifically express the human diphtheria toxin receptor in Foxp3-positive cells, resulting in Treg cell ablation after diphtheria toxin administration. In a parallel line of experiments, a second model of anti-CD25 antibody-mediated Treg cell immuno-depletion was used. Treg cell ablation prior to MI resulted in adverse postinfarction left-ventricular dilatation associated with cardiac deterioration. Mechanistically, Treg cell depletion resulted in an increased recruitment of pro-inflammatory neutrophils and Ly-6Chigh monocytes into the healing myocardium. Furthermore, Treg cell-ablated mice exhibited an adverse activation of conventional non-regulatory CD4+ and CD8+ T cells that
showed a reinforced infiltration into the infarct zone. Increased synthesis of TNFα and IFNγ by conventional CD4+ and CD8+ T cells in hearts of Treg cell-depleted mice provoked an M1-like macrophage polarization characterized by heightened expression of healing-compromising induced NO synthase, in line with a reduced synthesis of healing-promoting transglutaminase factor XIII (FXIII), osteopontin (OPN) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1).
Therapeutic Treg cell activation by a superagonistic anti-CD28 monoclonal antibody stimulated Treg cell accumulation in the infarct zone and led to an increased expression of mediators inducing an M2-like macrophage polarization state, i.e. interleukin-10, interleukin-13 and TGFβ1. M2-like macrophage differentiation in the healing infarct was associated with heightened expression of scar-forming procollagens as well as scar-stabilizing FXIII and OPN, resulting in improved survival due to a reduced incidence of left-ventricular ruptures. Therapeutic Treg cell activation and the induction of a beneficial M2-like macrophage polarization was further achieved by employing a treatment modality of high clinical potential, i.e. by therapeutic administration of IL-2/ anti-IL-2 monoclonal antibody complexes. The findings of the present study suggest that therapeutic Treg cell activation and the resulting improvement of healing may represent a suitable strategy to attenuate adverse infarct expansion, left-ventricular remodeling, or infarct ruptures in patients with MI.
Die Charcot-Marie-Tooth Typ 1 Erkrankungen sind eine genetisch heterogene Gruppe, aktuell nicht kurativ therapierbarer, erblicher Neuropathien des Peripheren Nervensystems. Klinische Manifestationen reichen von Sensibilitäts-störungen, verminderten Muskeleigenreflexen, sowie fortschreitenden Lähmungen, bis hin zu Muskelatrophie und bedeuten für die betroffenen Patienten eine starke Einschränkung der Lebensqualität. Anhand früherer Studien wurde Makrophagen, als Teil des angeborenen Immunsystems, eine entscheidende Rolle in der Pathogenese dreier CMT1-Unterformen zugeschrieben. Abgesehen von den morphologischen Manifestationen der demyelinisierenden CMT1-Erkrankungen, wie simultanes Auftreten von Dedifferenzierung, sowie Hypo-, und Demyelinisierung erkrankter Schwann-Zellen, sind pathologische Veränderungen der Domänengliederung der Ranvier’schen Schnürringe betroffener Nervenfasern ebenfalls von der Aktivierung pathogener Makrophagen abhängig.
Auf der Basis verschiedener veröffentlichter Studien, welche sowohl demyelinisierende Erkrankungen des ZNS, aber auch primär durch axonale Schäden gekennzeichnete Erkrankungen des PNS beinhalten, besteht ein möglicher räumlicher Zusammenhang zwischen Architekturstörungen der RS und aktivierten pathogenen Mikrogliazellen bzw. Makrophagen.
In dieser Studie konnte, anhand morphologischer Analysen von peripherem Nervengewebe, in Wt-Mäusen erstmals eine unerwartete präferentielle Lokalisation von Makrophagen im räumlichen Umfeld von RS beobachtet werden. Hierbei scheint, trotz des Fehlens einer direkten Zell-Zell-Interaktion zwischen Makrophagen und RS, vor allem im Hinblick auf die ebenfalls im räumlichen Umfeld von RS nachweisbare EZM und Fibroblasten, eine funktionelle Relevanz der assoziierten Makrophagen für die Aufrechterhaltung der Domänengliederung bzw. elektrophysiologischen Eigenschaften myelinisierter peripherer Nervenfasern denkbar.
Im Gegensatz dazu wurde trotz der signifikanten Zunahme der Makrophagenanzahlen in den drei untersuchten CMT1-Mausmodellen keine erhöhte räumliche Assoziation mit den RS der mutierten Schwann-Zellen beobachtet. Vielmehr konnten anhand des Vergleiches mit wildtypischen Kontrollmäusen signifikant erniedrigte Assoziationsraten beider Strukturen in den CMT1-Modelltieren festgestellt werden. Folglich scheint die von der Einwanderung und Aktivierung pathogener Makrophagen abhängige Störung der Domänengliederung der RS der mutierten Schwann-Zellen, nicht durch eine direkte Interaktion bzw. räumliche Assoziation von Makrophagen mit RS ausgelöst zu werden.
Leishmanien besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die humorale und zelluläre Immunabwehr effektiv zu unterlaufen. Diese hängen eng mit der Expression von hauptsächlich zwei Glykokonjugaten auf der Parasitenoberfläche zusammen, dem gp63 und dem Lipophosphoglykan. Die Parasiten sind einerseits schlechte Aktivatoren des alternativen Komplementweges und umgehen damit ihre eigene extrazelluläre Lyse. Oberflächengebundene Komplementfaktoren fördern andererseits die Aufnahme der Leishmanien durch Makrophagen. Solange diese nicht durch T-Zellen aktiviert sind, dienen sie den Parasiten als "Refugium". Dies gilt insbesondere, als Leishmanien in der Lage sind, 1. den "oxidative burst" zu hemmen; 2. toxische Sauerstoffmetaboliten zu entgiften; 3. abbauende lysosomale Enzyme zu hemmen und 4. das saure Milieu in den Lysosomen für ihren eigenen Metabolismus auszunutzen. Schließlich unterlaufen Leishmanien die zelluläre Immunabwehr des Wirts, indem sie die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmen und die Expansion von T-Zell-Sub-populationen bewirken, die für ihr eigenes Überleben nützlich sind.
Atherosklerose ist ein wichtiger Faktor bezüglich der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen, indem sie Einfluss auf die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Gefäße nimmt. Wegen dieser Bedeutung ist es wichtig, diese Erkrankung und deren Zusammenhänge genau zu erforschen.
Einige Studien konnten zeigen, dass die Pulswellengeschwindigkeit mit Gefäßwand-eigenschaften, insbesondere deren Steifigkeit, zusammenhängt. So konnte in Untersuchungen von Gotschy et al.27 eine Zunahme der lokalen Pulswellen-geschwindigkeit, als Marker für Gefäßwandsteifigkeit, in Aortenanteilen von ApoE(-/-)-Mäusen im Zeitverlauf mittels MRT gezeigt werden, ohne dass makroskopische Veränderungen in frühen Stufen atherosklerotischer Entwicklung sichtbar waren. Dies wird nun als Ausgangspunkt herangezogen, um zu erforschen, durch welche histologischen Veränderungen des Gefäßes innerhalb der Atherogenese eine frühe Zunahme der lokalen PWV erklärt werden kann.
Hierzu wird zum einen die mit der Gefäßwandsteifigkeit in Zusammenhang gebrachte Elastinfragmentierung innerhalb der elastischen Laminae der Aorta ascendens und abdominalis mittels histologischer Untersuchung quantitativ bestimmt. Die elastischen Schichten werden durch modifizierte Elastika-van-Gieson-Färbung dargestellt. Zur vergleichenden Bestimmung wird ein Quotient aus der Anzahl bei mikroskopischer Betrachtung erkennbarer Brüche der elastischen Laminae und bestimmter Gefäßwandquerschnittsfläche erstellt. Die Ausprägung der Elastinfragmentierung unterscheidet sich signifikant in den zwei höchsten Altersklassen der Test- und Kontrollmäuse in beiden untersuchten Aortenabschnitten, wobei die ApoE(-/-)-Tiere stets den höheren Wert aufweisen. Anhand der Ähnlichkeit hinsichtlich der Entwicklung der Messwerte von beschriebener lokalen PWV und der hier gezeigten Elastinfragmentierung kann vermutet werden, dass diese zu einer Erhöhung der Gefäßwandsteifigkeit beiträgt. Die gezeigten histologischen Parameter können so als Indikator für Veränderungen der Gefäßeigenschaften während der Atherogenese und als möglicher Grund einer Veränderung der Gefäßwandsteifigkeit mit konsekutiver Erhöhung der lokalen PWV angesehen werden.
Als weiterer Einflussfaktor auf die mechanischen Eigenschaften des Blutgefäßsystems wird die Entwicklung des Kollagengehaltes anteilig an der Aortenwand bestimmt. Es wurde in vielen Publikationen beschrieben, welchen großen Stellenwert Kollagenfasern für die Gefäßwandsteifigkeit haben. Auch wird das untersuchte Kollagen hinsichtlich seiner Faserdicken nochmals genauer untersucht. Die Kollagenfasern werden mittels Pikro-Sirius-Rot gefärbt und anschließend unter zirkulär polarisiertem Licht analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen keinen eindeutigen Trend hinsichtlich ihrer Entwicklung. Sie lassen sich auch nicht mit der aufgestellten Hypothese in Übereinkunft bringen, da keine zeitliche Dynamik verglichen mit der Entwicklung der anderen Parameter nachgewiesen werden kann.
Um den beschriebenen entzündlichen Charakter der Atherogenese ebenso zu berücksichtigen, wird das Einwanderungsverhalten von Makrophagen in die Gefäßwand betrachtet. Es wird die relative Fläche der durch Makrophagen besiedelten Gefäßwandanteile bestimmt und als Indikator einer Entzündungsreaktion angesehen, welche direkt oder indirekt Einfluss auf Gefäßwandeigenschaften haben könnte. Mittels eines Antikörpers gegen das makrophagenspezifische Protein CD68 und Kombination mit anti-antikörpervermittelt bindenden fluoreszierenden Substanzen, werden Makrophagen in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und die besiedelte Fläche softwaregestützt bestimmt. Dabei kommt die vorliegende Untersuchung zu dem Ergebnis, dass sich die Makrophagenbesiedelung in beiden betrachteten Aortenabschnitten deutlich im Zeitverlauf bei den ApoE(-/-)-Tieren erhöht. Der relative Gefäßwandanteil der von Makrophagen besiedelten Flächen erreicht seinen höchsten Wert innerhalb der Aorta ascendens bei 18 Wochen alten ApoE(-/-)-Tieren; in der Aorta abdominalis bei 30 Wochen alten. Die absolute CD68-Fläche in beiden Aortenabschnitten steigt bis zum Versuchsende hin an, wobei der stärkste Anstieg in der Zeit von sechs zu 18 Wochen geschieht. Dagegen zeigt die Kontrollgruppe eine sehr geringe Zunahme dieser beiden Messgrößen, wobei diese stets auf einem sehr niedrigen Niveau bleiben und keineswegs mit der Entwicklung der Testtiere zu vergleichen sind. Besonders zu beachten ist, das bereits in der jüngsten Altersstufe von sechs Wochen ein höheres Maß an Makrophagenbesiedelung bei Aortenanteilen der ApoE(-/-)-Tiere zu verzeichnen ist, als bei den entsprechenden Kontrollen. Auf Grund dieser Beobachtung, lässt sich ein möglicher Zusammenhang mit der schon früh ansteigenden Gefäßsteifigkeit vor sichtbarer Plaqueentwicklung herstellen.
Bei der Klärung der zentralen Fragestellung dieser Arbeit nach einem histomorphologischen Korrelat für die frühzeitige Erhöhung der lokalen PWV zeigt sich folgendes Ergebnis: Insgesamt können die gemessenen histologischen Charakteristika, vor allem die Entwicklung der Elastinfragmentierung innerhalb der Gefäßwand und der Grad der Makrophagenbesiedelung, frühe Indikatoren für Veränderungen morphologischer und funktioneller Gefäßwandspezifikationen sein. Sie kommen daher als denkbare Ursache für den Anstieg der lokalen Pulswellengeschwindigkeit in Betracht, besonders da die zuvor erwähnten histologischen Parameter zeitlich wie diese einen ähnlichen Verlauf hinsichtlich ihrer Entwicklung zeigen.
Die Atherogenese und deren zahlreiche Einflussfaktoren bleiben weiterhin Forschungs-gegenstand und es gilt mehr denn je mögliche Mechanismen aufzudecken, um eine Gefäßwandschädigung frühzeitig und effektiv verhindern zu können. Hiervon würde ein Großteil der Bevölkerung profitieren, da die Atherosklerose durch ihre Folgeerkrankungen nach wie vor, nicht nur in Deutschland, die Todesursachenstatistik anführt.
The steroid hormones corticosterone/cortisol and aldosterone are synthesized and secreted by the adrenal gland in response to stress or an altered salt-water balance. This is controlled by a negative feedback mechanism referred to as the HPA axis and the RAAS. Actions of these steroid hormones are mediated by the glucocorticoid receptor (GR) and the mineralocorticoid receptor (MR), which reside in the cytoplasm in a complex with heat-shock proteins. Both, the GR and the MR belong to the nuclear receptor superfamily and share a common protein structure consisting of three separate domains. However, they have different affinities for various ligands, their actions depend on hormone concentration, they are modulated by pre-receptor mechanisms such as the 11β-HSD2 and they are differently distributed in several tissues. Aldosterone acts via the MR in epithelial and in non-epithelial cells and regulates sodium-water homeostasis, cardiovascular function, neuronal excitability and adipocyte differentiation. So far the analysis of gene inactivation in vivo was limited to mice, but disease models in rats sometimes more closely reflect the situation encountered in humans. Since embryonic stem cells and thus gene targeting in rats is not available, we generated MR knock-down transgenic rats by lentiviral delivery of a shRNA. The F1 progeny of the founder rats showed a wide range of reduced MR mRNA and protein levels in kidney and hippocampus, the two major sites of MR expression. In contrast, expression of the highly homologous GR was unaltered, indicating specificity of gene inactivation. The two MR target genes, Sgk1 and ENaC, were up-regulated while the mRNA levels of other genes such as IK1 and SCD2 was reduced. Similar to the knock-out mice and human patients, the knock-down rats displayed typical signs of pseudohypoaldosteronism type I such as increased serum levels of aldosterone and renin as well as growth retardation. Importantly, we found a linear relationship between MR mRNA expression in kidney, serum aldosterone levels and body weight. Thus, our MR knock-down rats are amongst the first examples of RNAi in vivo and confirm that this technique allows to accomplish graded levels of gene inactivation that mimick human genetic diseases. Secondly, we investigated the role of the GR and the MR for the immunomodulatory activities of glucocorticoids (GCs) in peritoneal macrophages. GCs are involved in the modulation of macrophage function and thereby control the host’s immune responses to pathogens. Therefore, GCs are widely used for the treatment of inflammation and autoimmune diseases. However, concerning these GC activities neither the role of hormone concentration nor the differential contribution of the GR and the MR are known. At first we confirmed that both receptors but not 11β-HSD2 are expressed in peritoneal macrophages. Next, we showed that low levels of corticosterone enhance NO production as well as mRNA expression of pro-inflammatory cytokines, chemokines and enzymes required for mediator synthesis. In contrast, at high corticosterone concentrations macrophage function was strongly repressed. Importantly, inactivation of the GR by lentiviral delivery of siRNAs abrogated both the immunostimulatory and the immunosuppressive GC actions whereas inactivation of the MR had no effect. Furthermore, removal of endogenous GCs by adrenalectomy in vivo induced a pre-activated state in macrophages that could be modulated by corticosterone. We conclude that GCs exert distinct effects on macrophage function dependent on their concentration, and that they act through the GR despite concomitant expression of the MR. In summary, our results confirm that lentiviral delivery of shRNAs is an efficient means to down-regulation gene expression in primary cells and transgenic rats and thereby allows to perform functional studies on gene function that were previously limited to mice.
This thesis concerned the design and examination of a scaffold for tissue engineering applications. The template for the presented scaffold came from nature itself: the intercellular space in tissues that provides structure and support to the cells of the respective tissue, known as extracellular matrix (ECM). Fibres are a predominant characteristic feature of ECM, providing adhesion sites for cell-matrix interactions. In this dissertation a fibrous mesh was generated using the electrospinning technique to mimic the fibrous structure of the ECM. Two base polymers were explored: a biodegradable polyester, poly(D,L-lactide-co-glycolide); and a functional PEG-based star polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). This topic was described in three major parts: the first part was materials based, concerning the chemical design and characterisation of the polymer scaffolds; the focus was then shifted to the cellular response to this fibrous scaffold; and finally the in vivo performance of the material was preliminarily assessed. The first steps towards an electrospun mesh started with adjusting the spinning parameters for the generation of homogeneous fibres. As reported in Chapter 3 a suitable setup configuration was on the one hand comprised of a spinning solution that consisted of 28.5 w/v% PLGA RG 504 and 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL acetone, 50 µL DMSO and 10 µL of an aqueous trifluoroacetic acid solution. On the other hand an ideal spinning behaviour was achieved at process parameters such as a flow rate of 0.5 mL/h, spinneret to collector distance of 12-16 cm and a voltage of 13 kV. The NCO-sP(EO-stat-PO) containing fibres proved to be highly hydrophilic as the functional additive was present on the fibre surface. Furthermore, the fibres featured a bulk degradation pattern as a consequence of the proportion of PLGA. Besides the morphologic similarity to ECM fibres, the functionality of the electrospun fibres is also decisive for a successful ECM mimicry. In Chapter 4, the passive as well as active functionality of the fibres was investigated. The fibres were required to be protein repellent to prevent an unspecific cell adhesion. This was proven as even 6.5 % sP(EO-stat-PO) in the PLGA fibres reduced any unspecific protein adsorption of bovine serum albumin and foetal calf serum to less than 1 %. However, avidin based proteins attached to the fibres. This adhesion process was avoided by an additional fibre surface treatment with glycidol. The active functionalisation of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres was investigated with two fluorescent dyes and biocytin. A threefold, chemically orthogonal, fibre modification was achieved with these dyes. The chapters about the chemical and mechanical properties laid the basis for the in vitro chapters where a specific fibre functionalisation with peptides was conducted to analyse the cell adhesion and biochemical expressions. Beginning with fibroblasts in Chapter 5 the focus was on the specific cell adhesion on the electrospun fibres. While NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres without peptides did not allow any adhesion of fibroblasts, a fibre modification with GRGDS (an adhesion mediating peptide sequence) induced the adhesion and spreading of human dermal fibroblasts on the fibrous scaffolds. The control sequence GRGES that has no adhesion mediating qualities did not lead to any cell adhesion as observed on fibres without modifications. While the experiments of Chapter 5 were a proof-of-concept, in Chapter 6 a possible application in cartilage tissue engineering was examined. Therefore, primary human chondrocytes were seeded on fibrous scaffolds with various peptide sequences. Though the chondrocytes exhibited high viability on all scaffolds, an active interaction of cells and fibres was only found for the decorin derived sequence CGKLER. Live-cell-imaging revealed both cell attachment and migration within CGKLER-modified meshes. As chondrocytes undergo a de-differentiation towards a fibroblast-like phenotype, the chondrogenic re-differentiation on these scaffolds was investigated in a long term cell culture experiment of 28 days. Therefore, the glycosaminoglycan production was analysed as well as the mRNA expression of genes coding for collagen I and II, aggrecan and proteoglycan 4. In general only low amounts of the chondrogenic markers were measured, suggesting no chondrogenic differentiation. For conclusive evidence follow-up experiments are required that support or reject the findings. The success of an implant for tissue engineering relies not only on the response of the targeted cell type but also on the immune reaction caused by leukocytes. Hence, Chapter 7 dealt with primary human macrophages and their behaviour and phenotype on two-dimensional (2D) surfaces compared to three-dimensional (3D) fibrous substrates. It was found that the general non-adhesiveness of NCO-sP(EO-stat-PO) surfaces and fibres does not apply to macrophages. The cells aligned along the fibres on surfaces or resided in the pores of the meshes. On flat surfaces without 3D structure the macrophages showed a retarded adhesion kinetic accompanied with a high migratory activity indicating their search for a topographical feature to adhere to. Moreover, a detailed investigation of cell surface markers and chemokine signalling revealed that macrophages on 2D surfaces exhibited surface markers indicating a healing phenotype while the chemokine release suggested a pro-inflammatory phenotype. Interestingly, the opposite situation was found on 3D fibrous substrates with pro-inflammatory surface markers and pro-angiogenic cytokine release. As the immune response largely depends on cellular communication, it was concluded that the NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres induce an adequate immune response with promising prospects to be used in a scaffold for tissue engineering. The final chapter of this thesis reports on a first in vivo study conducted with the presented electrospun fibres. Here, the fibres were combined with a polypropylene mesh for the treatment of diaphragmatic hernias in a rabbit model. Two scaffold series were described that differed in the overall surface morphology: while the fibres of Series A were incorporated into a thick gel of NCO-sP(EO-stat-PO), the scaffolds of Series B featured only a thin hydrogel layer so that the overall fibrous structure could be retained. After four months in vivo the treated defects of the diaphragm were significantly smaller and filled mainly with scar tissue. Thick granulomas occurred on scaffolds of Series A while the implants of Series B did not induce any granuloma formation. As a consequence of the generally positive outcome of this study, the constructs were enhanced with a drug release system in a follow-up project. The incorporated drug was the MMP-inhibitor Ilomastat which is intended to reduce the formation of scar tissue. In conclusion, the simple and straight forward fabrication, the threefold functionalisation possibility and general versatile applicability makes the meshes of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres a promising candidate to be applied in tissue engineering scaffolds in the future.