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Neuste Studien haben ergeben, dass Asc-1 Knock-out Mäuse aufgrund einer verminderten intrazellulären Glycinkonzentration in synaptischen Boutons im Gehirn, einen Hyperekplexie-ähnlichen Phänotyp entwickeln. Aufgrund nicht vollständig geklärter Ursachen für die Entstehung des Krankheitsbildes der Hyperekplexie beim Menschen, wurde eine Kohorte von 51 Patienten zusammengetragen, um vor dem Hintergrund der Forschungsergebnisse zu Asc-1 im Tiermodell, das kodierende Gen beim Menschen SLC7A10 als mögliches Kandidatengen auf Sequenzalterationen zu untersuchen. Hierfür wurde aus Vollblut der an Hyperekplexie erkrankten Patienten genomische DNA isoliert, um mittels PCR und anschließendem Screening der Sequenzen, Mutationen innerhalb funktionell wichtiger Bereiche des Gens zu eruieren. Neben weiteren Sequenzunterschieden, die meist in Introns gefunden wurden, wurde die codierende Mutation G307R innerhalb von Exon 7 identifiziert, die letztendlich der Grund für eine Versuchsreihe war, um zu hinterfragen, ob dieser Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz funktionelle Konsequenzen zur Folge hat. HEK293-Zellen wurden mit dem zuvor hergestellten Klon G307R transfiziert, um über Biotinylierung, immuncytochemische Färbungen und funktionelle Untersuchungen die Aktivität des Transporters zu beurteilen. Hier zeigte sich ein Funktionsverlust von über 95 %, bei uneingeschränkter Oberflächenexpression. ASC-1 bestätigt sich damit als neue Ursache in der Ausprägung von Hyperekplexie. Ferner können Zusammenhänge mit geistiger Retardierung und eingeschränkter neuronaler Plastizität bestehen.
Aus vorherigen Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe war bekannt, dass der TRPV1 Hitzerezeptor im Vogel sich vom TRPV1 der Säugetiere hinsichtlich der Capsaicinsensitivität und der Regulation der Expression durch NGF unterscheidet. Unterschiede in den Eigenschaften zwischen beiden Hitzerezeptorsubtypen könnten Rückschlüsse auf funktionelle Strukturen des Säugetier TRPV1 erlauben. In der vorliegenden Arbeit war die übergreifende Fragestellung, ob sich beide Hitzerezeptorsubtypen auch hinsichtlich ihrer Protonensensitivität unterscheiden. Für die Untersuchungen wurden Spinalganglienneurone von Küken isoliert und kultiviert. Mit Hilfe der Cobalt-uptake Methode wurde der Anteil der Neurone bestimmt, die funktionell den Hitzerezeptor TRPV1 exprimieren. Diese Experimente wurden nach 1, 2 und 3 Tagen unter Kulturbedingungen durchgeführt, um eine mögliche Veränderung mit der Zeit zu erfassen. Weiterhin wurde untersucht, ob durch Protonen der Anteil hitzesensitiver Neurone beeinflusst wird. Hierfür wurden die Somata nach einem Tag unter Kulturbedingungen in Kombination von Hitze und Protonen stimuliert. Um eine Sensibilisierung der Hitzeantwort durch Protonen in einzelnen Neuronen zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik in der whole-cell Konfiguration die Amplitude von Hitze-und protoneninduzierten Gesamteinwärtsströmen untersucht. Zunächst wurde mit der Cobalt-uptake Methode untersucht, ob der Anteil hitzesensitiver Neurone durch Protonen von der Zeit unter Kulturbedingungen beeinflusst wird. Bei einer Temperatur von 44°C stieg der Prozentsatz hitzesensitiver Neurone innerhalb der ersten 3 Tage unter Kulturbedingungen an, unabhängig von der Protonenkonzentration (pH 7,4, pH 6,6 und pH 5,8). Die nächste Frage war, wie hoch der Anteil protonensensitiver Neurone bei Raumtemperatur ist. Hierfür wurden die Zellen nach einem Tag in Zellkultur mit einem Medium von pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 oder pH 5,8 stimuliert. Es zeigte sich ein Anstieg von 3,3% ± 0,5% bei pH 7,4 auf 35,0% ± 4,0% bei pH 5,8. Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob dieser Anstieg temperaturabhängig ist. Hierfür wurden entsprechende Experimente bei 37°C, 40°C und 44°C nach einem Tag unter Kulturbedingeungen durchgeführt. Im Vergleich war bei 37°C der Anteil positiver Neurone bereits bei 6,2 so hoch wie bei Raumtemperatur bei pH 5,8. Mit weiter zunehmender Temperatur verringerte sich jedoch der Anteil positiver Neurone mit steigendem pH. So war bei 44°C und pH 5,8 nur noch ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Im letzten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik hitze- und protoneninduzierte Einwärtsströme gemessen. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduziereten Einwärtsstroms temperaturabhängig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduzierten Einwärtsstroms bei einem Medium von pH 6,6 im Vergleich zu pH 7,4 deutlich ansteigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der Küken TRPV1 ähnlich wie der der Säugetiere durch Protonen in Konzentrationen, die im entzündlichen Gewebe vorkommen, sensibilisiert werden kann. Es kommt sowohl zu einer Rekrutierung von weiteren hitzesensitiven Neuronen also auch zu einer verstärkten Antwort bereits hitzesensitiver Neurone.
In their natural environment animals face complex and highly dynamic olfactory input. This requires fast and reliable processing of olfactory information, in vertebrates as well as invertebrates. Parallel processing has been shown to improve processing speed and power in other sensory systems like auditory or visual. In the olfactory system less is known about olfactory coding in general and parallel processing in particular. With its elaborated olfactory system and due to their specialized neuroanatomy, honeybees are well-suited model organism to study parallel olfactory processing. The honeybee possesses a unique neuronal architecture - a dual olfactory pathway. Two mirror-imaged output projection neuron (PN) pathways connect the first olfactory processing stage, the antennal lobe (analog to the vertebrates olfactory bulb, OB), with the second, the mushroom body (MB) known to be involved in orientation and learning and memory, and the lateral horn (LH). The medial antennal lobe-protocerebral tract (m-APT) first innervates the MB and thereafter the LH, while the other, the lateral-APT (l-APT) projects in opposite direction. The neuroanatomy and evolution of these pathways has been analyzed, yet little is known about its physiology. To analyze the function of the dual olfactory pathway a new established recording method was designed and is described in the first chapter of this thesis (multi-unit-recordings). This is now the first time where odor response from several PNs of both tracts is recorded simultaneously and with high temporal precision. In the second chapter the PN odor responses are analyzed. The major findings are: both tracts responded to all tested odors but with differing characteristics. Since recent studies describe the input to the two tracts being rather similar, the results now indicate differential odor processing along the tracts, therefore this is a good indicator for parallel processing. PNs of the m-APT process odors in a sparse manner with delayed response latencies, but with high odor-specificity. PNs of the l-APT in contrast respond to several odor stimuli and respond in general faster. In some PN originating from both tracts, characteristics of odor-identity coding via response latencies were found. Analyzing the over-all dynamic range of the PNs both l- and m-APT PNs were tested over a large odor concentration range (10-6 to 10-2) (3. chapter). The PNs responded with linear and non-linear correlation of the response strength to the odor concentration. In most cases the l-APT is comparatively more sensitive to low odor concentrations. Response latency decreases with increasing odor concentration in both tracts. Alternative coding principles and elaboration on the hypothesis whether the dual olfactory pathway may contribute coincidental innervation to the next higher-order neurons, the Kenyon cells (KC), is subject of the 4. chapter. Cross-correlations and synchronous responses of both tracts show that in principle odors may be coded via temporal coding. Results suggest that odor processing is enhanced if both tracts contribute to olfactory coding together. In another project the distribution of the inhibitory neurotransmitter GABA (gamma-aminobutyric acid) was measured in the bee’s MB during adult maturation (5. chapter). GABAergic inhibition is of high importance in odor coding. An almost threefold decrease in the total amount of GABAergic innervation was found during adult maturation in the l- and m-APT target region, in particular at the change in division of labor during the transition from a young nurse bee to an older forager bee. The results fit well into the current understanding of brain development in the honeybee and other social insects during adult maturation, which was described as presynaptic pruning and KC dendritic outgrowth. Combining anatomical and functional properties of the bee’s dual olfactory pathway suggests that both rate and temporal coding are implemented along two parallel streams. Comparison with recent work on analog output pathways of the vertebrate’s OB indicates that parallel processing of olfactory information may be a common principle across distant taxa.
It has been suggested that the proto-oncogene c-src plays a functional role in developing neurons, and in the mature nerve cells of higher vertebrales. The coelenterate Hydra represents tbe most primitive known organism possessing nerve cells. With Southern blot hybridizations we have demonstrated src-related sequences in Hydra. Antisera specific for the c-src gene product (pp60 c-src) of birds and mammals precipitate a protein from Hydra cell extracts with a tyrosine-specific protein kinase activity. Studies of tissues and cells fractionated from a temperature sensitive mutant of Hydra which is depleted of interstitial (including nerve) cells at tbe non-permissive temperature, have indicated the src-like kinase of Hydra to be preferentially expressed in nerve cells. The high conservation of structural features and of the expression pattern indicates a basic function for pp60c-src in neurons.
The purpose of the experiments reported is to provide an unambiguous demonstration that embryonie skeletal muscle contains factors that act directly on embryonie spinal motor neurons both to support their survival and to stimulate the outgrowth of neurites. Cells of lumbar and brachial ventral spinal cords from 6-day-old chick embryos were separated by centrifugation in a two-step metrizamide gradient, and a motor neuron enriched fraction was obtained. Motor neurons were identified by retrogradely labeling with rhodamine isothiocyanate, and were enriched fourfold in the motor neuron fraction relative to unfractionated cells. In culture, the isolated motor neurons died within 3-4 days unless they were supplemented with embryonie chick skeletal muscle extract. Two functionally distinct entities separable by ammonium sulfate precipitation were responsible for the effects of muscle extracts on motor neurons. The 0-25% ammonium sulfate precipitate contained molecules that alone bad no effect on neuronal survival but when bound to polyornithine-coated culture substrata, stimulated neurite outgrowth and potentiated the survival activity present in muscle. Most of this activity was due to a laminin-like molecule being immunoprecipitated with antisera against laminin, and immunoblotting demonstrated the presence of both the A and B chains of laminin. A long-term survival activity resided in the 25-70% ammonium sulfate fraction, and its apparent total and specific activities were strongly dependent on the culture substrate. In contrast to the motor neurons, the cells from the other metrizamide fraction (including neuronal cells) could be kept in culture for a prolonged time without addition of exogenous factor(s).
Neurodegenerative Erkrankungen des Menschen sind eines der Hauptfelder molekularer neurobiologischer Grundlagenforschung. Um generell molekulare, komplizierte Vorgänge in vivo untersuchen zu können, nutzt man seit geraumer Zeit Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster. In der vorliegenden Arbeit wird die Drosophila-Neurodegenerationsmutante loe (löchrig) beschrieben, die als Modell für die Rolle des Cholesterinhaushalts im Bezug auf Neurodegeneration herangezogen werden kann. Die Fliegen dieser Mutante zeigen stark progressive, altersabhängige Degeneration von Neuronen, dabei unterlaufen diese Nervenzellen einen nekrotischenZelltod. Verantwortlich für diese Mutation ist die Insertion eines P-Elementes in einem Intron des Drosophila-g-5'-AMP-aktivierten Proteinkinase- (AMPK)-Gens. Die verschiedenen Spleißprodukte des loe Gens kodieren für die regulatorische g-Untereinheit des AMPK-Komplexes, der , aktiviert durch 5'AMP, energieintensive Prozesse negativ reguliert. Die Spleißform loeI ist durch die P-Element-Insertion betroffen, Anteile des P-Elementes werden in das loeI-Transkript hineingespleißt. Eine neuronale Expression von loeI im loe-Hintergrund führt zur Revertierung des loe-Phänotypes. Mit der Expression anderer Spleißformen kann dieser Effekt nicht erzielt werden. Das LOE I-Protein birgt in seinem N-Terminus eine Reihe möglicher Interaktionstellen mit anderen Proteinen, die den AMPK-Komplex in einen Kontext mit den Proteinen der APP (Amyloid Precursor Proteins) ?Familie stellen oder z. B. Interaktionen mit dem Cytoskelett herstellen können. Eine molekulare Interaktion mit NiPSNAP, einem Protein, dass vermutlich eine Rolle im Vesikelverkehr spielt, konnte nachgewiesen werden. Ein direktes humanes Homolog von LOE I ist nicht bekannt, wohlgleich es im Menschen drei AMPK-g-Untereinheiten gibt, von denen zwei ähnliche Funktionen übernehmen könnten wie LOE I. Die loe-Mutante interagiert genetisch mit der Mutante clb ? columbus, die einen Defekt im Gen der HMG-CoA-Reduktase trägt. Dieses Emzym ist das Schlüsselenzym der Cholesterinbiosynthese. Die Art der Interaktion belegt eine negative Regulierung der HMG-CoA-Reduktase durch die AMPK. So schwächt die clb-Mutation den neurodegenerativen loe-Phänotyp ab, eine Überexpression von clb verstärkt diesen. Eine Verminderung der Neurodegeneration kann auch mit Medikamenten erreicht werden: Statine, potente Hemmer der HMG-COA-Reduktase, reprimieren deutlich den loe-Phänotyp. In loe ist der Cholesterinester-Spiegel auf 40% abgesenkt. Eine weitere genetische Interaktion von loe konnte nachgewiesen werden: Die Mutante für das Drosophila-Homolog von APP (Appl) verstärkt den neurodegenerativen Phänotyp in loe stark, wogegen die Appl-Mutante selbst keine neurodegenerativen Defekte aufweist. Darüberhinaus zeigt die Doppelmutante Defekte, die keine der Einzelmutanten aufweist: Sterilität oder eine extrem kurze Lebensdauer von nur 3-4 Tagen. Diese Interaktion ließ sich auf molekularer Ebene charakterisieren. Die proteolytische Prozessierung von APPL durch Sekretasen ist in loe alteriert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die loe-Mutation die b-Sekretase aus Vertebraten (BACE) und eine bisher noch nicht beschriebene endogene Sekretase aus Drosophila negativ beeiflusst werden. Ein AMPK-Komplex mit LOE I als g-Untereinheit scheint über den Cholesterinester-Spiegel die Aktivität einer speziellen Untergruppe der Sekretasen zu beeinflussen. Die Missfunktion dieser Sekretasen ist ein kritischer Punkt in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Die loe-Mutation wirft neues Licht auf die bekannten Verbindungen zwischen Cholesterin-Stoffwechsel, Vesikelverkehr und Prozessierung von APP(L). Mit den großen Möglichkeiten, die die Drosophila-Genetik bietet, stellt diese neue Mutante ein weiteres Werkzeug zur Charakterisierung von Therapie-Ansätzen für die Alzheimer-Kankheit dar. Die vorliegende Arbeit belegt um ein weiteres Mal, dass Drosophila ein potentes Modellsystem zur Untersuchung humaner, neurodegenerativer Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson oder der Alzheimer Krankheit ist.
Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts"
(2000)
Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unlöslich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der Hämodialyse eine Rolle, für die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrillärer Bündel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl für eine Akutphasenreaktion als auch für oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von Übergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, lässt sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizität unterschiedlicher Modell-AGEs ist abhängig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Präparationen in vitro. Die AGE-Toxizität ist hauptsächlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress lässt sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellulärer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors für AGEs (RAGE) mit spezifischen Antikörpern konnte die Zahl überlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgelöster Stress führt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu Störungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verhältnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Veränderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anfänglich erhöhter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktatausschüttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien können die Störungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschwächen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringfügig erhöhter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verläuft der durch AGEs ausgelöste Zelltod verläuft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch über rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Veränderungen im Metabolismus der Zelle. Dies führt u. a. dazu, dass für die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr genügend Energie zur Verfügung steht. AGE-Stress trägt damit in einer selbstverstärkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren könnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen.
Calcium ions can activate intracellular signalling cascades that control key functions in all types of neurons. These functions include neuronal excitability and excitation, synaptic plasticity, cell migration, transmitter release, gene transcription, and apoptosis. The major intracellular neuronal store for calcium is the endoplasmic reticulum (ER), a continuous and dynamic, membranous organelle that extends through all parts of neurons, from axons to dendrites. The calcium concentration in the ER is appr. one thousand fold higher than in the cytosol and this calcium gradient is built up by the sarco-/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump that pumps calcium from the cytosol into the ER.
Despite detailed knowledge about various induced calcium signals within neurons, it was still elusive, how resting neurons maintain their ER calcium content at rest. In order to shed light on the calcium homeostasis at rest, the targeted-esterase induced dye loading (TED) technique was improved. TED allows the direct and non-disruptive visualization of ER calcium in presence of extracellular calcium, thus enabling to visualize the dynamic flow of ER calcium. TED is based on the overexpression of an ER-targeted mouse carboxylesterase. Inside the ER the carboxylesterase cleaves the acetoxymethyl ester calcium dye Fluo5N, AM, thereby converting this dye into a calcium sensitive, low-affinity, cell membrane impermeable calcium indicator that is trapped in the ER. When bound to calcium ions and excited by fluorescent light, its fluorescence intensity increases one hundredfold compared to the calcium-free state.
It was observed that calcium withdrawal from resting neurons led to a rapid loss of calcium from both the ER and the cytosol, which recovered upon calcium re-addition. It was concluded that a strong calcium influx and efflux must exist under resting conditions that maintain a constant calcium concentration in neurons at rest. TED calcium imaging could visualize this resting calcium influx event. When the inhibitor of store-operated calcium entry (SOCE), SKF-96365, was acutely added to neurons an immediate decline in ER calcium levels was observed, whereas cytosolic calcium levels remained constant. Based on these findings, a novel calcium homeostasis model is proposed in which a strong SOCE-like calcium influx and a corresponding calcium efflux maintain the ER calcium levels at rest. These fluxes are adapted to disturbances in order to maintain a constant calcium level in resting neurons.
This study visualizes for the first time the resting calcium flow into the ER. The calcium enters the neurons via a store-operated calcium entry-like mechanism, a form of calcium influx that was thought to be induced by signalling events.
Genetische Inaktivierung des somatischen Cytochrom C Gens der Maus Cytochrom C wurde als ein Interaktionspartner im Apoptosom beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, die Rolle von Cytochrom C bei der Apoptose von Nervenzellen in vivo durch genetische Inaktivierung in der Maus zu untersuchen. Die homozygote Deletion des Cytochrom C Gens führt jedoch zu einem sehr frühen Entwicklungsdefekt: Schon am 8. Embryonaltag findet man nur noch Embryonen ohne erkennbare Körperachse. Im weiteren wurden daher heterozygote Tiere untersucht, die in bestimmten Geweben, wie Gehirn und Rückenmark, eine Reduktion der Menge von Cytochrom C aufweisen. Am ersten Tag nach der Geburt konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit einem oder zwei Cytochrom C Genen in Bezug die Anzahl von Motoneuronen gefunden werden. Auch nach perinataler Fazialisläsion war die Rate des Zelltods bei Tieren mit heterozygoter Deletion des Cytochrom C Gens unverändert. In vitro zeigte sich jedoch eine erhöhte Resitenz von Motoneuronen gegenüber Fas-induzierter Apoptose. Bei der Analyse der Apoptose von Thymozyten zeigte sich ein Trend, der eine kleine, aber reproduzierbare Verzögerung einer späten Zelltodphase nach UV-induzierter Apoptose nahelegt. Erste Experimente deuten außerdem auf einen Effekt der Cytochrom C Gendosis auf den Verlauf einer Experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE) hin. Charakterisierung der NFL-Cre Maus Die zelltypspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System umgeht einige der größten Probleme der klassischen Methode der Geninaktivierung in Mäusen, indem nur in bestimmten Geweben oder Zelltypen, eventuell sogar nur ab einem bestimmten Zeitpunkt, ein Gen gezielt ausgeschaltet werden kann. Allerdings hängt das Cre/loxP System von der Verfügbarkeit von brauchbaren Cre-transgenen Mauslinien mit entsprechenden Expressionsmustern und –kinetiken ab. Wir haben eine transgene Mauslinie etabliert und analysiert, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des humanen Neurofilament-L Promotors exprimiert. Das Expressionsmuster von Cre wurde in mehreren Geweben mit RT-PCR und durch Verkreuzung mit einer Reportergenmaus untersucht. Im Gehirn wurden Cre exprimierende Zelltypen mit in-situ Hybridisierung, Immunhistochemie und wiederum mit Hilfe der Reportermaus identifiziert. Dabei zeigte sich eine spezifische Cre Expression in bestimmten Neuronpopulationen wie hippocampalen Pyramidenzellen und spinalen und cranialen Motoneuronen. Unsere NFL-Cre Maus besitzt einige Eigenschaften, die bisher publizierte Cre-Linien nicht aufweisen, so z.B.eine starke Cre Expression in hippocampalen Pyramidenzellen, aber nicht in Körnerzellen des Gyrus dentatus; Expression in cortikalen Pyramidenzellen, aber keine Expression im Striatum; Expression in zerebellären Purkinje-, aber nicht Körnerzellen; sowie die Expression in spinalen und cranialen Motoneuronen, aber nicht in angrenzenden Interneuronen. Die Rolle von Stat3 für das Überleben von Motoneuronen Die Mitglieder der CNTF/LIF/Cardiotrophin Genfamilie sind potente Überlebensfaktoren für embryonale und lädierte Motoneurone sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Faktoren binden an Rezeptorkomplexe, die gp130 und LIFR als signaltransduzierende Komponenten enthalten. Im Gegensatz zu den Rezeptoren für andere neurotrophe Faktoren, führt die Aktivierung von gp130 und LIFR zur Phosphorylierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Stat3. Es war aber zu Beginn dieser Arbeiten unklar, ob die Aktivierung von Stat3 für den Überlebenseffekt der neuropoietischen Zytokine notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde Stat3 in Motoneuronen mit Hilfe des Cre/loxP Systems konditional inaktiviert. Stat3 ist nicht für das Überleben embryonaler Motoneurone essentiell, obwohl man in vitro eine Verschiebung der Dosis-Wirkungskurve für CNTF findet. In vivo hingegen kann kein erhöhter Zelltod von Motoneuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu, kommt es bei adulten Tieren mit Inaktivierung von Stat3 in Motoneuronen zu einem erhöhten Zelltod nach Fazialisläsion. Diese Neurone können wiederum durch die Applikation neurotropher Faktoren, einschließlich CNTF, gerettet werden. Durch semiquantitative RT-PCR kann man zeigen, daß Stat3-regulierte Gene, deren Expression nach Nervenläsion induziert wird, in Neuronen mit Inaktivierung von Stat3 weniger stark exprimiert werden. Zu diesen Genen gehören Reg-2, ein Mitogen für Schwannzellen, das von regenerierenden Neuronen exprimiert wird, und Bcl-xL, ein Gen, welches direkt in die Apoptoseregulation eingreift. Diese Daten zeigen, daß Stat3 Aktivierung eine essentielle Rolle für das Überleben nach Läsion von postnatalen Motoneuronen spielt, aber nicht während der Embryonalentwicklung. Das bedeutet, daß die Signalwege ein und desselben neurotrophen Faktors sich während der Entwicklung und reifung des Organismus verändern können.
Bag-1 Defizienz in Mäusen führt in der embryonalen Entwicklung zu einem lethalen Phänotyp mit schweren Defekten in Nervensystem und Leber. Neben der Expression der Inhibitor of Apoptosis Proteinen (IAP), ist ein Komplex aus Akt, Hsp70, Bag-1 und B-Raf für die Phosphorylierung eines spezifischen AS-Restes des pro-apoptotischen Proteins Bad für das Überleben wichtig (Gotz und Wiese et al., 2005). Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Funktionen der Maus Bag-1 Isoformen in der neuronalen Entwicklung anhand von in vitro Modellen näher zu charakterisieren. Überexpression von Bag-1S und Bag-1L in PC12 Zellen zeigte, dass Bag-1S im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert wird, Bag-1L nur im Zellkern. Eine eingeführte Punktmutation, die die Interaktion mit Hsp70 verhindert, führte zu einer zytoplasmatischen Expression von Bag-1Sm. Die Mutante Bag-1Lm blieb nukleär lokalisiert. Überexpression von Bag-1S führte zu einer Reduktion der Neuritenlänge. Bag-1L und die mutanten Isoformen zeigten diesen Effekt nicht. Der inhibierende Einfluss von Bag-1S auf das Neuritenwachstum ist bislang spekulativ. Die Regulation erfolgt vermutlich über den Komplex Bag-1, Hsp70, Akt und B-Raf. Die Analyse von Bag-1 - /- Neuralen Stammzellen zeigte im Vergleich zu Bag-1 +/+ Neuralen Stammzellen eine erhöhte Apoptose. Wurde durch Vireninfektion Bag-1S oder Bag-1L zurück in die Zellen gebracht, waren diese wieder in der Lage zu überleben. Die Mutanten zeigten diese Effekte nicht, so dass Hsp70 ein notwendiger Interaktionspartner für die überlebensfördernde Wirkung von Bag-1 ist. Bag-1 -/- Neurale Stammzellen zeigten außerdem gliale Differenzierungsdefekte, die nicht durch eine Rückführung der Isoformen gerettet werden konnten. Zusätzliche Experimente, die Neurale Stammzellen gezielt in die gliale Differenzierung durch Gabe von CNTF oder LIF leiten, zeigten, dass Bag-1 -/- Neurale Stammzellen durchaus in der Lage sind, gliale Zellen zu bilden. Bag-1 gilt auch als Modulator nukleärer Rezeptoren, wie dem Glucocorticoid-Rezeptor (GR). Die Kotransfektion der Bag-1 Isoformen mit GR-GFP, zeigte Änderungen des Expressionsmusters bei Bag-1L und Bag-1Lm, jedoch nicht bei Bag-1S und Bag-1Sm. Die Etablierung einer Methode zur in vivo Analyse von Glucocorticoid-Signalwegen in der Neuroneogenese von adulten Mäusen, war in ihren ersten Ansätzen erfolgreich, so dass diese nach einigen Optimierungen für weitere Analysen genutzt werden kann.