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6.0. Zusammenfassung und Ausblick Die Signaltransduktion vermittelt zelluläre Stimuli von der Zellmembran ins Zellinnere (Zytosol bzw. Zellkern) und steuert physiologische und pathophysiologische Vorgänge in der Zelle. Die Aufschlüsselung des komplexen Netzwerks der Signaltransduktion ist eine Voraussetzung für die gezielte experimentelle und auch therapeutische Beeinflussung zellulärer Vorgänge. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Beteiligung von p38 MAPK beim Remodeling-Prozeß nach Myokardinfarkt in vivo und bei der Fibronektin-Expression in Rahmen der Neointima- Entstehung nach Angioplastie in vitro durchgeführt. Im Bereich der kardiovaskulären Forschung hat die Familie der Mitogen Aktivierten Protein Kinasen besonderes Interesse gewonnen. Sie besteht aus drei Subgruppen - JNK, ERK und p38 MAPK. Diese sind durch Vermittlung vieler neurohumoraler, mechanischer und inflammatorischer Stimuli am Remodeling-Prozeß des Herzmuskelgewebes und der arteriellen Gefäßwand beteiligt. In vitro Experimente zeigten eine p38 MAPK-Aktivierung bei akuter Ischämie und eine konsekutive Beteiligung dieser Kinase bei der Hypertrophie bzw. Apoptose von Kardiomyozyten. Die Rolle von p38 MAPK bei der absoluten Ischämie in vivo wurde bislang nicht untersucht. Als erstes sollte in einer Pilotstudie untersucht werden, ob p38 MAPK nach akutem Myokardinfarkt eine erhöhte Aktivität in vivo aufweist. Des Weiteren sollte, für den Fall einer erhöhten p38 MAPK Aktivität, der zeitliche Verlauf beschrieben werden. Von besonderem Interesse dabei war, wie lange eine erhöhte p38 MAPK Aktivität nach Myokardinfarkt nachweisbar ist. Bei länger anhaltender p38 MAPK Aktivität liegt es nahe, daß diese Kinase am postischämischen Remodeling- Prozeß beteiligt ist. Man würde damit einen möglichen Ansatzpunkt für eine pharmakologische Beeinflussung gewinnen. Darüber hinaus sollte anhand klinischer Parameter und Remodelingmarker, wie des atrialen natriuretischen Peptides (ANP), untersucht werden, ob ein zeitlicher Zusammenhang zwischen der p38 MAPK Aktivität und der Entstehung einer Herzinsuffizienz besteht. Es wurden in einem ersten Teil der Arbeit mittels Ligatur der linken Koronararterie Myokardinfarkte bei männlichen 4 Monate alten Lewis Ratten erzeugt. Schein operierte Ratten dienten als Kontrollgruppe. Die Infarktgröße wurde echokardiographisch, sowie bei Organentnahme visuell beurteilt. Die p38 MAPKAktivierung wurde mittels nicht radioaktivem MAPK-Assay und anschließendem Western Blot nach 15 Minuten, 1, 4, 24 Stunden, sowie 1, 3 und 6 Wochen im linksventrikulären Myokard gemessen. Pro Zeitpunkt wurden mindestens 10 Tiere untersucht. Zur Bestimmung von ANP im Serum und im linksventrikulären Gewebe wurde die ELISA Methode angewandt. Wichtigstes Ergebnis war, daß eine deutliche p38 MAPK-Aktivierung bis 6 Wochen nach Myokardinfarkt im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt wurde. Im Verlauf zeigten sich zwei signifikante Spitzen der p38 MAPK-Aktivierung, nämlich nach 1 Stunde und nach 1 Woche. Innerhalb der unterschiedlichen Gruppen wurde eine deutlichere p38 MAPK-Aktivierung bei mittelgroßen bis großen Myokardinfarkten beobachtet. In diesen Proben wurde auch eine linksventrikuläre ANP-Expression nachgewiesen. Somit konnte in dieser Untersuchung erstmalig eine prolongierte p38 MAPK-Aktivität bis zu 6 Wochen nach Myokardinfarkt in vivo gezeigt werden. Die Tatsache, daß p38 MAPK bei mittelgroßen und großen Infarkten, die mit einer ventrikulären ANP Expression einhergehen, aktiviert ist, weist auf eine Beteiligung von p38 MAPK beim Remodeling-Prozeß nach Myokardinfarkt hin. Die erste Spitze der p38 MAPK Aktivität nach einer Stunde ist im Zusammenhang der akuten Ischämie und der erhöhten Wandspannung, evtl. auch mit der Manipulation bei der Operation zu sehen und ist in ihrer Bedeutung nicht geklärt. P38 MAPK könnte hier möglicherweise zum einen proapoptotische Vorgänge auslösen, zum anderen aber auch eine Zellprotektion im Rahmen der durch die akute Ischämie bedingten Entstehung von Zellnekrosen, z. B. mittels Heat Schock Proteine, vermitteln. Die zweite Spitze der p38 MAPK Aktivität nach einer Woche weist auf eine Beteiligung an den adaptiven Prozessen nach Myokardinfarkt hin und wird am ehesten durch Neurohormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren chronisch unterhalten. Die Ergebnisse unserer Studie können hier als Grundlage für zukünftige Untersuchungen bezüglich der Rolle von p38 MAPK nach Myokardinfarkt dienen. Von besonderem Interesse wäre die Bestimmung der beiden im kardialen Gewebe nachgewiesenen p38 MAPK Isoformen, der p38α MAPK und der p38β MAPK. Diese könnten unterschiedliche Auswirkungen bezüglich der Apoptose und des Zellüberlebens aufweisen, sowie zeitlich getrennt aktiviert werden. Weiterer wichtiger Ansatz zukünftiger Untersuchungen ist die Lokalisation der p38 MAPK Aktivität im ischämischen Gewebe, im direkt angrenzenden Gebiet, sowie im übrigen Myokard. Eine Restenose ist eine häufige Komplikation nach Angioplastie. Sie entsteht aufgrund einer Neointimabildung. Die Neointima ist charakterisiert durch die Proliferation und Migration von Zellen der glatten Gefäßmuskulatur, sowie durch eine überschießende und in ihrer Zusammensetzung veränderte extrazelluläre Matrix- Bildung. Ein in vivo Experiment, von dem die vorliegende Arbeit einen Teilaspekt darstellt (61), zeigte eine erhöhte p38 MAPK Aktivität während der Neointimaentstehung nach PTA für 28 Tage. Die Hemmung der p38 MAPK Aktivität mittels eines selektiven Inhibitors führte zu einer verringerten Neointima-Bildung. Bisherige Untersuchungen weisen auf eine Beteiligung von p38 MAPK bei den Prozessen der Migration und der Proliferation von Zellen der glatten Gefäßmuskulatur hin, wobei diese zum Teil kontrovers diskutiert werden. Eine Untersuchung zur Beteiligung von p38 MAPK bei der Modulation der extrazellulären Matrix-Zusammensetzung war bis lang nicht untersucht worden. Fibronektin ist ein Bestandteil der Extrazellulärmatrix und spielt eine wichtige Rolle in der Frühphase der Neointimabildung. Fibronektin trägt zur phänotypischen Änderung der glatten Gefäßmuskelzellen bei und ermöglicht deren Proliferation und Migration. TGF-ß ist ein bekannter Stimulus für eine verstärkte Fibronektin-Expression. Es wird unmittelbar nach Angioplastie durch Thrombozyten in der Gefäßwand freigesetzt. Die Signaltransduktion von TGF-ß kann durch p38 MAPK vermittelt werden. Der Zusammenhang zwischen einer TGF-ß induzierten p38 MAPK Aktivierung und der Fibronektin-Expression in Zellen der glatten Gefäßmuskulatur war bislang nicht geklärt. Daher wurden im zweiten Teil dieser Arbeit primäre Kulturen aus Zellen der glatten Gefäßmuskulatur aus der Arterie femoralis von Kaninchen (6 Monate alt, männlich) angelegt und mit TGF-β über 48h stimuliert. Durch unterschiedliche Konzentrationen von SB 239063, einem spezifischen p38 MAPK Inhibitor, wurde die Beteiligung von p38 MAPK bei der Fibronektin-Expression untersucht. Die Bestimmung der Expression von zellulärem Fibronektin erfolgte im Western Blot. TGF-β bewirkte eine verstärkte Expression von zellulärem Fibronektin in Zellen der glatten Gefäßmuskulatur. Die Fibronektinproduktion konnte durch SB 239063 konzentrationsabhängig signifikant reduziert werden. Am Beispiel der Induktion der Fibronektin-Expression konnte erstmalig ein Hinweis auf eine Beteiligung der p38 MAPK an der Modulation der Extrazellulärmatrix bei der Restenose nach perkutaner transarterieller Angioplastie gewonnen werden. Dies ist in den ersten Tagen nach Angioplastie von besonderer Bedeutung, da Fibronektin die Dedifferenzierung, Proliferation und Migration von Zellen der glatten Gefäßmuskulatur fördert. Somit könnte p38 MAPK direkt bei den Umbauvorgängen der Extrazellulär-Matrix beteiligt sein und indirekt auch die Proliferation und Migration der Zellen der glatten Gefäßmuskulatur nach PTA beeinflussen.
Nevirapin ist ein Nicht-Nukleosidaler Reverse Transkriptase Inhibitor, welcher seit 1996 in der Therapie der HIV-Infektion eingesetzt wird. Im wissenschaftlichen Labor des Schwerpunktes Hepatologie/Infektiologie der Medizinischen Klinik und Poliklinik II des Universitätsklinikums Würzburg werden im Rahmen der therapiebegleitenden Diagnostik bei Patienten mit HIV-Infektion regelmäßig Nevirapin-Plasmakonzentrationen bestimmt. Anhand einer statistischen Auswertung der von 1996 bis 7/2002 gemesssenen Nevirapinspiegel werden in der vorliegenden Arbeit zunächst Einflussgrößen auf inter- und intraindividuelle Variabilität der Plasmakonzentrationen identifiziert. Den stärksten Einfluss auf die interindividuelle Streuung hat dabei das Patientengewicht, weitere Einflussfaktoren sind Rauchen und Compliance der Patienten. Auf Grundlage der Ergebnisse werden Kriterien für eine Dosisanpassung in bestimmten klinischen Situationen erarbeitet. Im zweiten Teil der Arbeit werden akute und langfristige Nebenwirkungen der Nevirapintherapie untersucht. Hautausschlag und Leberwerterhöhung treten vor allem in den ersten Wochen der Therapie auf. Weibliches Geschlecht und hohe CD 4-Zellzahl am Therapiebeginn können als Risikofaktoren für das Auftreten dieser Nebenwirkungen identifiziert werden. Eine Steroidtherapie erscheint aufgrund der vorliegenden Einzelfalldarstellungen vorteilhaft und damit indiziert. Im langfristigen Verlauf steigt die GGT-Aktivität auf etwa das doppelte des Ausgangswertes an, GOT- und GPT-Aktivitäten ändern sich kaum und bei der LDH und der AP kann ein Anstieg in den ersten acht Therapiewochen beobachtet werden. Hepatitis B- und C-Koinfetion haben in dieser Auswertung keinen Einfluss auf nevirapinbedingte Leberwerterhöhung. In Übereinstimmung mit Daten aus der Literatur wird ein deutlicher Anstieg des HDL unter der Nevirapintherapie gefunden. Schließlich wird im dritten Teil dieser Untersuchung die Wirksamkeit der NVP-Therapie anhand von Viruslast- und CD4-Veränderungen analysiert. Bei der Mehrzahl der Patienten kann eine gute Wirksamkeit mit anhaltender Suppression der Viruslast und kontinuierlichem Anstieg der CD4-Zellzahl beobachtet werden.
Durch ihre Aufgaben im Metabolismus der Schilddrüsenhormone kommt der Enzymfamilie der Deiodasen im feinregulierten Zusammenspiel der Aktivierung und Inaktivierung dieser signalgebenden Stoffe eine zentrale Rolle zu. Störungen in diesem System ziehen weitreichende Folgen auf der Ebene der Entwicklung und Steuerung des gesamten Organismus nach sich. Verminderte Aktivität der 5´DI, sei sie durch unzureichende Expression des Gens oder posttranskriptionelle Fehlsteuerung bedingt, geht dabei mit einer sogenannten „Konversionshemmung“ einher, die sich in erhöhten T4- und rT3-Spiegeln bei vermindertem Plasma-T3-Gehalt äußert. Diese Konstellation wird in Tiermodellen, bei denen ein 5´DI-Defekt auf molekularer Ebene bekannt ist, beobachtet. Ein derartiger Defekt ist jedoch beim Menschen bislang nicht festgestellt worden. Eine routinemäßige Untersuchung des 5´DI-Gens von Patienten, bei denen ein Enzymdefekt die Ursache ihrer Symptomatik sein könnte, ist mit Hilfe des hier aufgeführten Verfahrens unter einfachen Bedingungen möglich. In dieser Arbeit wird neben der Beschreibung eines stummen Polymorphismus im Exon 1 erstmals eine potentiell relevante Veränderung im translatierten Bereich des 5´DI-Gens beschrieben. Ausgewählte Patienten, deren Symptome den Verdacht auf eine Konversionshemmung aufkommen lassen, sind (bei sonst unveränderter Exonstruktur) heterozygot für eine Punktmutation im Codon 108 im Exon 1. Durch den Austausch von G durch A ergibt sich bei ihnen aus dem Codon UGG für die Aminosäure Tryptophan das Stop- beziehungsweise SeCys-Codon UGA. Im ersten Fall entsteht dadurch ein etwa um die Hälfte verkürztes und damit wohl funktionsunfähiges Protein, im zweiten ein in Konformation und Aktivität sicherlich beeinträchtigtes Enzym, vorausgesetzt, das im 3’-untranslatierten Bereich der mRNA befindliche SECIS-Element ist für dieses UGA-Codon wirksam. Bei beiden Varianten ist jedoch zu klären, ob der Defekt durch das zweite wildtypische Allel teilweise oder völlig kompensiert werden kann, wozu Untersuchungen von Gewebeproben aus Leber und Niere beziehungsweise die Expression des veränderten Gens in Zellkultur erforderlich wären.
Zusammenfassung: Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung des Western Blots für den semiquantitativen Nachweis von humanem SeP in Rektumbiopsien. Kernstück der Arbeit war die Anpassung der einzelnen Verfahrensschritte des Western Blots an die besonderen Gegebenheiten bei der Verarbeitung von Schleimhautbiopsien. Bei der Probenaufbereitung, Auftrennung und Detektion des SeP musste besonders der geringe SeP-Gehalt der Biopsien beachtet werden. Bei Patienten mit Selensubstitution waren zumeist schwächere Signale der SeP-Banden und der meisten anderen Banden im Vergleich zu Patienten ohne Selensubstitution erkennbar. Die Selensubstitution spiegelte sich also nicht im SeP-Gehalt der Biopsien wider. Beim Vergleich der Biopsien gesunder Rektumschleimhaut mit den dazugehörigen Adenombiopsien derselben Patienten ergab sich ein deutlich höherer SeP-Gehalt in den Biopsien der gesunden Rektumschleimhaut. Auch das Bandenmuster bei den Adenomen zeigte Unterschiede zur normalen Rektumschleimhaut. So waren bei den Adenomen vermehrt größere Proteine, bei der normalen Rektumschleimhaut vermehrt kleinere Proteine als SeP detektierbar. Auffallend war eine 87 kD-Bande, die gehäuft bei Adenomen auftrat, deren Herkunft bisher nicht bekannt ist. Die niedermolekularen Banden könnten deglykosyliertes oder an einem der UGA-Codons trunkiertes SeP darstellen. Eine genaue Analyse und Identifizierung dieser Banden und ihre Bedeutung steht aber noch aus. In der Zusammenschau der aktuellen Studienlage scheint die Gewährleistung einer ausreichenden täglichen Selenzufuhr, gegebenenfalls auch durch orale Substitution als Nahrungsergänzung, im Hinblick auf die Prävention maligner Tumore sinnvoll und bei schwerkranken Personen prognoseverbessernd zu sein. Die genauen Ansatzpunkte der Selenwirkung sind aber nach wie vor noch nicht vollständig geklärt.
Although the role of B-cells in autoimmunity is not completely understood, their importance in the pathogenesis of autoimmune diseases has been more appreciated in the past few years. It is now well known that they have roles in addition to (auto) antibody production and are involved by different mechanisms in the regulation of T-cell mediated autoimmune disorders. The evolution of an autoimmune disease is a dynamic process, which takes a course of years during which complex immunoregulatory mechanisms shape the immune repertoire until the development of clinical disease. During this course, the B-cell repertoire itself is influenced and a change in the distribution of immunoglobulin heavy and light chain genes can be observed. B-cell depletive therapies have beneficial effects in patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), highlighting also the central role of B-cells in the pathogenesis of this disease. Nevertheless, the mechanism of action is unclear. It has been hypothesised that B-cell depletion is able to reset deviated humoral immunity. Therefore we wanted to investigate if transient B-cell depletion results in changes of the peripheral B-cell receptor repertoire. To address this issue, expressed immunoglobulin genes of two patients suffering from RA were analysed; one patient for the heavy chain repertoire (patient H), one patient for the light chain repertoire (patient L). Both patients were treated with rituximab, an anti-CD20 monoclonal antibody that selectively depletes peripheral CD20+ B-cells for several months. The B-cell repertoire was studied before therapy and at the earliest time point after B-cell regeneration in both patients. A longer follow-up (up to 27 months) was performed in patient H who was treated a second time with rituximab after 17 months. Heavy chain gene analysis was carried out by nested-PCR on bulk DNA from peripheral B-cells using family-specific primers, followed by subcloning and sequencing. During the study, patient H received two courses of antibody treatment. B-cell depletion lasted 7 and 10 months, respectively and each time was accompanied by a clinical improvement. Anti-CD20 therapy induced two types of changes in this patient. During the early phase of B-cell regeneration, we noticed the presence of an expanded and recirculating population of highly mutated B-cells. These cells expressed very different immunoglobulin VH genes compared before therapy. They were class-switched and could be detected for a short period only. The long-term changes were more subtle. Nevertheless, characteristic changes in the VH2 family, as well as in specific mini-genes like VH3-23, 4-34 or 1-69 were noticed. Some of these genes have already been reported to be biased in autoimmune diseases. Also in autoimmune diseases, in particular in RA, clonal B-cells have been frequently found in the repertoire. B-cell depletion with anti-CD20 antibody resulted in a long term loss of clonal B-cells in patient H. Thus, temporary B-cell depletion induced significant changes in the heavy chain repertoire. For the light chain gene analysis, the repertoire changes were analysed separately for naive (CD27-) and memory (CD27+) B-cells. Individual CD19+ B-cells were sorted into CD27- and CD27+ cells and single cell RT-PCR was performed, followed by direct sequencing. During the study, patient L received one course of antibody treatment. B-cell depletion lasted 10 months and the light chain repertoire was studied before and after therapy. Before therapy, some differences in the distribution of VL and JL genes were observed between naive and memory B-cells. In particular, the predominant usage of Jk-proximal Vk genes by the CD27- naive B-cells indicated that the receptor editing was less frequent in this population compared to memory cells. In VlJl rearrangements also, some evidence for decreased receptor editing was noticed, with the overrepresentation of the Jl2/3 gene segments. The CDR3 regions of naive and memory cells showed different characteristics: the activity of the terminal deoxynucleotidyl transferase and exonuclease in Vl(5’) side was greater in memory cells. Also in the light chain repertoire, we observed some changes induced by the B-cell depletive therapy. There was a tendency of a less frequent usage of Jk-proximal Vk genes in the naive population. Some Vl genes, previously described in autoimmune diseases and connected to rheumatoid factor activity, such as 3p, 3r, 1g, were not found after therapy. The different characteristics of the CDR3 regions of VlJl rearrangements were not observed anymore. Very significantly, the ratio Vk to Vl was shifted toward a greater usage of Vk genes in the naive population after therapy. Taken together, these results indicate that therapeutic transient B-cell depletion by anti-CD20 antibody therapy modulates the immunoglobulin gene repertoire in the two RA patients studied. Measurable changes were observed in the heavy chain as well as in the light chain repertoire, which may be relevant to the course of the disease. This also supports the notion that the composition of the B-cell repertoire is influenced by the disease and that B-cell depletion can reset biases that are typically found in autoimmune diseases.
Die Schilddrüse gehört zu den Organen mit dem höchsten Gehalt an Selen (Se). Dieses ist hauptsächlich in Form von Selenoproteinen gebunden. Hierzu gehören die 5'DI, die in den Stoffwechsel der Schilddrüsenhormone involviert ist, die TRxR, die unter anderem die Redoxstatus-abhängige Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren reguliert, SePP, ein Protein, dem vor allem eine Funktion als Transportprotein zugeschrieben wird, und einige GPx, die während der H2O2-abhängigen Schilddrüsenhormonbiosynthese eine Rolle beim Abbau von H2O2 spielen. Die Zelllinie XTC.UC1 ist eine hoch differenzierte Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie. Sie wurde aus der Weichteilmetastase eines onkozytären Schilddrüsenkarzinoms (Hürthle-Zell-Karzinoms). Hürthle-Zell-Karzinome weisen charakteristische Anomalien auf, wie z.B. eine hohe Zahl an Mitochondrien und verminderten Iodidtransport. Vermehrte Mitochondrien erzeugen eine erhöhte Belastung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Dies wirft die Frage auf, ob die Expression von Selenoproteinen, die in erster Linie für den Schutz der Zellen vor oxidativer Schädigung verantwortlich sind, in Hürthle-Zell-Tumoren intakt ist. Im Rahmen der Arbeit wurde die Synthese der oben genannten Selenoproteine in XTC-Zellen überprüft. Retinsäure (RA) bewirkt bei mäßig differenzierten Schilddrüsenkarzinom-Zelllinien wie FTC 133 und 238 eine partielle Redifferenzierung. Aufgrund des seltenen Ansprechens auf eine Radioiodtherapie und der vergleichsweise hohen Tendenz oxyphiler Tumorzellen zur weiteren malignen Entartung wurde die Reaktion von XTC-Zellen auf eine Stimulation mit RA untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivitäten der untersuchten Selenoproteine in XTC-Zellen mit den Aktivitäten in anderen Schilddrüsenzelllinien vergleichbar sind. Die GPx-Aktivität steigt nach Se-Behandlung bis zu einem Maximum bei 300 nmol/l Na2SeO3 an. In der Zeitkurve wird auch nach 144 h Inkubation kein Plateau erreicht. Sie ist klar von der Se-Konzentration im Kulturmedium abhängig und kann als Marker für den Se-Status betrachtet werden. Die Aktivität der TrxR wird in der Dosiskurve schon durch 1 nmol/l Na2SeO3 stimuliert und in der Kinetik nach 24 h. Beide Kurven steigen abrupt an und erreichen rasch ein Plateau. Höhere Na2SeO3-Konzentrationen oder längere Inkubation haben keinen zusätzlichen Effekt. GPx und TRxR können mittels Enzymassay auch in konditioniertem Medium nachgewiesen werden. Auch SePP kann im Western Blot aus konditioniertem Medium nachgewiesen werden, zeigt aber keine Reaktion auf Na2SeO3-Stimulation. Überraschende Ergebnisse zeigt die Untersuchung der 5'DI-Aktivität: Bei Passagenzahlen zwischen 20 und 22 wird die Aktivität der 5'DI zeit- und dosisabhängig durch Na2SeO3 stimuliert. Bei Passagenzahlen zwischen 28 und 31 reagiert die 5'DI nicht länger auf Stimulation mit Na2SeO3, kann aber durch zusätzliche Stimulation mit 1 µmol/l RA wieder induziert werden. Dieses ungleiche Ansprechen auf Se- und RA-Stimulation entspricht der unterschiedlichen Regulation des Enzyms in verschiedenen Schilddrüsenzelllinien: In differenzierten Zelllinien wie FRTL-5, wo eine hohe basale Aktivität an 5'DI vorhanden ist, zeigt RA keinen Einfluss. In eher entdifferenzierten follikulären Karzinom-Zelllinien wie FTC 133 und 238 ist die basale 5'DI-Aktivität niedrig, kann durch Behandlung mit RA aber induziert werden. Dieser Wechsel in der Reaktion auf Se und RA vollzieht vermutlich einen Teil der Veränderungen nach, die während der Entdifferenzierung normaler Thyrozyten zu follikulären Tumorzellen auftreten. Die Selenhierarchie unter den verschiedenen Selenoenzymen ist auch in XTC-Zellen intakt. Wie in anderen Systemen wird die 5'DI in XTC-Zellen im Vergleich zur cGPx bevorzugt mit Se versorgt. Bereits Konzentrationen von 1 nmol/l Na2SeO3 bewirken einen deutlichen Aktivitätszuwachs. Bei Se-Depletion kann man noch 5 Tage nach Beginn des Se-Entzugs 50 % der Maximalaktivität messen, Hinweis auf eine Umverteilung des Se zugunsten der 5'DI. Insgesamt sind also Expression und Aktivität der untersuchten Selenoenzyme in XTC-Zellen im Vergleich mit anderen Schilddrüsenzelllinien nicht erhöht, wie man es als Reaktion auf eine verstärkte Belastung durch ROS erwarten könnte. Andererseits ist die Aktivität auch nicht vermindert, was als Ursache für eine besonders ausgeprägte oxidative Zellschädigung inklusive DNA-Mutation und eine dadurch geförderte Tumorentstehung gewertet werden könnte. Diese Resultate bieten keinen Anhaltspunkt für eine Rolle von Selenoenzymen bei der Entstehung dieser Art von Schilddrüsentumoren. Ferner scheint die Responsivität verschiedener Selenoproteine auf Stimulation mit Na2SeO3 in XTC-Zellen von Passagenzahl oder Differenzierungsstadium abhängig zu sein. Diese Zelllinie könnte daher ein interessantes Modell darstellen, um das Ansprechen menschlicher Schilddrüsenkarzinome auf eine Redifferenzierungstherapie mit RA und evtl. Adjuvanzien wie Se weiter zu untersuchen.
Von den bisher entdeckten Selenoproteinen im Organismus von Eu- und Prokaryonten sind nur wenige Proteine hinsichtlich ihrer biologischen Funktion weitgehend analysiert. Mit zunehmenden Erkenntnisgewinn über Funktion und Regulation einzelner Selenoproteine kristallisiert sich eine Gewebsspezifität heraus. Über die Genexpression von Selenoproteinen im Gastrointestinaltrakt des Menschen gibt es nur wenige Daten. Da für die kontinuierliche nutritive Selensupplementation ein eindrucksvoller präventiver Effekt auf die Inzidenz kolorektaler Karzinome nachgewiesen wurde, erscheint der Gastrointestinaltrakt als wichtiges Zielorgan für Selen und Selenoproteine. In der vorliegenden Arbeit wurden molekularbiologische und proteinbiochemische Untersuchungen zur Genexpression und Funktion einzelner Selenoproteine im Gastrointestinaltrakt durchgeführt. Dabei wurden mit Selenoprotein P (SeP), Thioredoxinreduktase (TrxR1) und den beiden Isoformen der Glutathionperoxidase GPx-GI und pGPx erstmals vier verschiedene gastrointestinale Selenoproteine auf mRNA-Ebene identifiziert. Hier zeigte sich ein differenzielles Expressionsmuster in den verschiedenen Kompartimenten des humanen Verdauungstraktes. Dieser Befund bildete die Grundlage für weitere Untersuchungen, in welchen veränderte Expressionsmuster der Selenoproteine in gastrointestinalen Präkanzerosen wie kolorektale Adenome oder Barrett-Ösophagus nachgewiesen werden konnten. Analog hierzu fand sich eine Expression dieser Selenoproteine in den humanen Kolon- und Magenkarzinomzelllinien Caco 2 und ST23132, was diese als geeignetes Zellkultursystem zur Untersuchung der Regulation der Genexpression ausweist. Die Detektion der zu den genannten Proteinen zugehörigen Banden in metabolischen Markierungsversuchen mit 75Se (in Zellkultur und gastrointestinalen Schleimhautbiopsien) ist als Nachweis der Translation dieser Gene zu werten. Von besonderem Interesse ist die Rolle der GPx-GI bei der gastrointestinalen Karzinogenese. Die aus epidemiologischen Daten als Karzinogene einzustufenden Stoffe Ethanol und Tamoxifen bewirken in der Zellkultur eine gesteigerte Genexpression der GPx-GI. Die vermehrte Bildung von GPx-GI wurde auch in kolorektalen Adenomen, einer fakultativen Präkanzerose, gefunden. Der Stellenwert der veränderten Genexpression von gastrointestinalen Selenoproteinen im Rahmen der Karzinogenese bleibt noch weiter zu untersuchen. Eine Wirkung von Östrogen auf die gastrointestinalen Selenoproteine war nicht nachweisbar. Diese Frage war Gegenstand dieser Arbeit, da für Östrogen (wie auch für Selen) epidemiologisch ein Schutzeffekt gegen kolorektale Karzinome bekannt ist. Zu den zukünftig weiter zu klärenden Fragen gehört insbesondere die weitere Aufklärung der biologischen Funktionen von Selenoproteinen.
In der vorliegenden Arbeit werden drei Fragen behandelt: 1.Kann die elektrischen Leitfähigkeit des Harns, die als Abfallprodukt moderner durchflußzytometrischer Harnanalysen anfällt, zur Beurteilung der Harnkonzentriertheit und der renalen Diurese herangezogen werden? 2.Welche der typischerweise im Harn gelößten Stoffe werden durch diese Messung erfaßt? 3.Inwiefern ist die Aussagekraft dieser Messgrößen mit den etablierten Methoden zur Bestimmung der Harnkonzentration vergleichbar?
Durch die Entwicklung neuer antiretroviral wirksamer Therapieschemata konnte in den letzten Jahren die Letalität HIV-Positiver deutlich gesenkt werden. Zur Gruppe der Hochaktiven Antiretroviralen Therapie (HAART) gehören die Proteaseinhibitoren (PI) mit den Substanzen Ritonavir (RTV), Saquinavir (SQV), Indinavir (IDV) und Nelfinavir (NVF) sowie den neueren Substanzen Amprenavir und Lopinavir, die in Kombination mit Substanzen der Nukleosidischen- (NRTI) und Nicht-Nukleosidalen-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) eingenommen werden. Nach Einführung einer solchen HAART trat ein bisher ätiologisch unbekannter Symtpomenkomplex auf, den man vor allem mit den Proteaseinhibitoren in Verbindung brachte. Dazu gehört die Ausbildung einer Fettverteilungsstörung mit Fettatrophie im Gesicht, an den Extremitäten, am Gesäß und Fettakkumulation im Brust-, Bauch- und Nackenbereich. Diese äußerlichen Fettumverteilungen können mit metabolischen Veränderungen im Sinne einer Hypertriglyzeridämie oder Hypercholesterinämie, einer Insulinresistenz und seltener einer diabetische Stoffwechsellage einhergehen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung einer HAART für die Entstehung des HIV-assoziierten Lipodystrophiesyndroms untersucht. Von besonderem Interesse waren dabei die Plasmakonzentrationen der verschiedenen Proteaseinhibitoren. Die Triglyzerid-, Cholesterin- und Glukosewerte im Blut von 79 HIV-Infizierten, deren Laborparameter sowohl vor als auch nach PI-Therapiebeginn bekannt waren, erhöhten sich unter PI-Medikation signifikant. Ebenso fand sich ein signifikanter Anstieg der Anzahl von Personen mit Hypertriglyzeridämie und Hypercholesterinämie nach PI-Medikation. Eine Hyperglykämie wurde im gesamten Kollektiv von 91 Patienten bei nur einem diagnostiziert. Die Plasmakonzentrationen der PI-Substanzen Ritonavir und Saquinavir korrelierten bei 91 Patienten positiv mit den Cholesterinwerten. Die Triglyzeride und Glukosewerte korrelierten positiv mit der Höhe der Plasmakonzentrationen von Saquinavir. Darüber hinaus zeigte sich ein Zusammenhang zwischen den Plasmakonzentrationen der PI-Substanzen Ritonavir und Saquinavir und dem Auftreten von Hypertriglyzeridämien sowie Hypercholesterinämien. Patienten mit derartigen Fettstoffwechselstörungen hatten signifikant höhere RTV- und SQV- Plasmakonzentrationen als Patienten mit Lipidwerten im Normbereich. Ritonavir und Saquinavir sind beides PI-Substanzen, die bisher vornehmlich mit Veränderungen im Fettstoffwechsel in Verbindung gebracht wurden. Nach den vorliegenden Ergebnissen könnten deren Plasmakonzentrationen Einfluss auf die Entstehung von Hyperlipidämien haben. Bei 21 der 91 Patienten (23%) wurde eine Fettverteilungsstörung unterschiedlichen Ausmaßes diagnostiziert, davon bei 13 eine milde, bei 6 eine moderate und bei 2 Patienten eine schwere Form. Bei 3 der 21 Patienten trat eine isolierte Fettatrophie ohne Anzeichen einer Fettakkumulation auf, die restlichen 18 Patienten zeigten eine Kombination aus beiden Komponenten. Ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Fettverteilungsstörungen und den einzelnen PI- Plasmakonzentrationen konnte in dieser Untersuchung nicht gefunden werden. Es zeigte sich jedoch ein Zusammenhang zwischen der Einnahme der NRTI-Substanzen Stavudin (D4T) und Didanosin (DDI) und den Fettverteilungsstörungen. Patienten mit einer solchen Körperfettumverteilung wurden signifikant länger mit diesen beiden Medikamenten behandelt als Patienten, bei denen keine Fettverteilungsstörung auftrat. Die NRTI sind Substanzen, die vermutlich aufgrund ihrer Mitochondrialen Toxizität für das Auftreten von Fettatrophien verantwortlich sind. Den stärksten Einfluss scheint dabei bisherigen Studien zufolge die Substanz Stavudin zu haben. Die Dauer einer Therapie mit Stavudin korrelierte in der vorliegenden Untersuchung ebenfalls signifikant mit dem Auftreten von Hypertriglyzeridämien. Aufgrund der längeren Überlebenszeit und des ausgeprägten kardiovaskulären Risikoprofils wird der Arteriosklerose eine zunehmende Bedeutung bei der Behandlung HIV-Infizierter zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit hatten insgesamt 4 der 91 Patienten eine kardiovaskuläre Komplikation: Bei einem Patienten trat ein apoplektischer Insult auf und 3 Patienten erlitten einen Herzinfarkt. Als kardiovaskuläre Risikofaktoren fanden sich bei 2 der Patienten mit Herzinfarkt erhöhte mittlere Cholesterin- und Triglyzeridwerte, ein Nikotinabusus sowie eine famliliäre Disposition für kardiovaskuläre Erkrankungen. Die Inzidenz von Herzinfarkten lag in der vorliegenden Untersuchung mit 3,3% innerhalb von 4 Jahren bzw. 0,8% pro Jahr weit über der derzeitigen Inzidenz von Herzinfarkten in der Bundesrepublik Deutschland (0,3% pro Jahr).
Für Patienten im terminalen Stadium der Herzinsuffizienz bleibt häufig als letzte Alternative die orthotope Herztransplantation. Weltweit wurden bis heute 63.000 Herztransplantationen durchgeführt. Postoperativ sind lebenslang engmaschige Kontrolluntersuchungen notwendig, um typische Komplikationen wie Transplantatvaskulopathie, akute Transplantatabstoßung, Myokardfibrose und andere Begleiterkrankungen frühzeitig diagnostizieren und therapieren zu können. Trotz der Notwendigkeit regelmäßiger Überwachung bedeutet die Herztransplantation für viele Patienten eine deutliche Verbesserung ihrer Lebensqualität. Die Komponenten der Nachsorge von herztransplantierten Patienten sind komplex, so dass diese vorwiegend an spezialisierten Einrichtungen erfolgt.7 Aufgrund der verbesserten immunsuppressiven Therapie und der dadurch bedingten längeren Überlebenszeiten nach Herztransplantation gewinnt die Transplantatvaskulopathie in der Langzeitprognose immer mehr an Bedeutung. Die Echokardiographie in Ruhe und unter Belastung ist die wichtigste nicht-invasive Methode, um mit der Transplantatvaskulopathie einhergehende Wandbewegungsstörungen rasch und kostengünstig zu diagnostizieren. Voraussetzung für eine aussagekräftige Beurteilung von Wandbewegungsstörungen ist die gute Abgrenzbarkeit von Cavum und Endokard. Die Verwendung von lungengängigen Kontrastmitteln erlaubt eine bessere ventrikuläre Kontrastierung und Endokarddelineation. Durch vergleichende Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe zwischen nativen Dobutamin- Stressechokardiographien (DSE) mit intravaskulärem Ultraschall und der Koronarangiographie wurde die DSE als sensitive Methode zur Detektion der Transplantatvaskulopathie etabliert. Es ist jedoch ungeklärt, ob eine bessere Kontrastierung des Cavums nach Kontrastmittelapplikation eine präzisere Detektion von Wandbewegungsstörungen bei herztransplantierten Patienten und damit eine zuverlässigere Aussage zur Langzeitprognose erlaubt. Akosah et al. konnten bereits zeigen, dass der nativen Dobutamin-Stressechokardiographie eine prognostische Aussagekraft bezüglich kardialer Ereignisse zukommt. Zur prognostischen Aussagekraftder kontrastmittelverstärkten Dobutamin-Stressechokardiographie liegen bislang keine veröffentlichten Daten vor. Ebenso ist unklar, ob und welche im klinischen Alltag routinemäßig erhobenen Patientencharakteristika und Verlaufsparameter zur Prognoseabschätzung beitragen. Die vorliegende Arbeit untersucht an einem konsekutiv rekrutierten Kollektiv herztransplantierter Patienten die diagnostische und prognostische Wertigkeit der kontrastmittelverstärkten Dobutamin-Stressechokardiographie.