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- Institut für Geographie und Geologie (4)
- Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie (Chirurgische Klinik I) (4)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Deutsches Zentrum für Herzinsuffizienz (1)
- Didaktik der Chemie (1)
- Endokrinologie (1)
- Fraunhofer Institut für Silicatforschung ISC (1)
- Fraunhofer-Institut für Silicatforschung (1)
- Fraunhofer-Institut für Silicatforschung, Würzburg (1)
- Hochschule für angewandte Wissenschaften München, Fakultät für Tourismus (1)
- Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin der Universität Würzburg (1)
- Siemens Corporate Technology, Erlangen (1)
- Stanford University (1)
ResearcherID
- D-3057-2014 (1)
- N-8985-2015 (1)
Nach einem akuten Myokardinfarkt (MI) oder bei Herzinsuffizienz gelten Betablocker als Therapiemittel der Wahl. Durch die Hemmung des Sympathikus wirken sie so dem Überschuss an Katecholaminen entgegen und erzielen eine kardioprotektive Wirkung. Ziel dieser Arbeit war, ein Modell zur Langzeitbetablockade der Maus zu etablieren und molekularbiologisch zu charakterisieren, welches für die Erforschung des IRI und der Kardioprotektion durch Anästhetika-induzierte Konditionierung dienen soll. Die Betablockade mit Metoprolol erfolgte über 21 Tage mittels subkutan implantierten Pumpen. Neben der invasiven Messung der Hämodynamik wurde die Molekularbiologie der Proteine Beta1-Rezeptor (ß1-AR), Alpha-Untereinheit des G-Proteins (Gnas) und Beta-Arrestin (Arrb1) untersucht und die Herzinfarktgröße am in vivo Herzinfarktmodell der Maus bestimmt.
Es zeigte sich bei der invasiven Messung mittels Conductance-Katheter eine Verbesserung der linksventrikulären Kontraktilität und eine konstant bleibende Herzfrequenz unter Dobutaminstimulation während der Betablockade. Zudem ergab sich für ß1-AR eine erhöhte mRNA-Konzentration bei gleichbleibender Proteinkonzentration. Für Gnas und Arrb1 konnte in der molekularbiologischen Auswertung keine veränderte mRNA-Expression festgestellt werden. Die Herzinfarktgröße wurde unter Metoprologabe nicht signifikant beeinflusst. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die Betablockade Veränderungen in der Molekularbiologie im untersuchten ß1-Signaltransduktionsweg hervorruft. Auch die invasive Messung mit Hilfe des Conductance-Katheters ergab die bei einer ß1-AR Blockade mit Metoprolol zu erwartenden positiven hämodynamischen Veränderungen.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde bestätigt, dass die Methode der invasiven Messung charakterisiert wurde und sich das Herzinfarktmodell der Betalangzeitblockade mit Metoprolol an der Maus etabliert hat. Dieses Modell kann für zukünftige Forschungen hinsichtlich der Anästhetika-induzierten Konditionierung und des IRI angewendet werden.
Die T1-Relaxationszeiten der gesunden Kontrollgruppe (Reifgeborene) lag durchschnittlich bei 662 ± 55 ms bei Raumluft und 591 ± 48 ms bei reinem Sauerstoff, die relativen Differenzen bei 10,7 ± 2,3 %. Dies deckt sich mit in der Literatur angegebenen Werten. Die relative Differenz gibt Aufschluss über den Sauerstofftransfer im Blut: je mehr Sauerstoff gelöst im Blut vorliegt, desto niedriger wird der T1-Wert und desto höher die absolute Differenz. Bei der Gruppe der Frühgeborenen mit BPD (Bronchopulmonale Dysplasie) zeigte sich eine geringere relative Differenz (Mittelwert = 9,2 +/- 3,1%) im Vergleich zu dem Mittelwert der Frühgeborenen ohne BPD (10,8 +/- 3,0%) sowie der Reifgeborenen (10,7 +/-2,3%), was auf einen geringeren Sauerstofftransfer in der Lunge schließen lässt. Bei statistischer Auswertung der einzelnen Schichten zeigte sich lediglich in der medialen linken Schicht ein signifikanter Unterschied der relativen Differenz der T1-Werte. Die Differenz war in der Gruppe der Frühgeborenen mit BPD signifikant niedriger als in der Gruppe der Frühgeborenen ohne BPD bzw. der Kontrollgruppe. Bei den ausgewerteten T1-Karten konnten keine lokalen Auffälligkeiten festgestellt werden. Auch morphologisch ergaben sich keinerlei Auffälligkeiten. Es scheint ein globales Problem im Sauerstofftransfer vorzuliegen.
Die Ergebnisse legen nahe, dass bei Kindern, die nach Geburt an einer schweren Form der BPD erkrankt sind, bis zumindest ins Schulkindesalter ein persistierend gestörter Sauerstofftransfer im Lungenparenchym gegeben ist. Diese funktionelle Einschränkung betrifft die gesamte Lunge, die höheren Abweichungen der Messergebnisse in einzelnen Lungenabschnitten bei den ehemaligen Frühgeborenen mit BPD legen eine höhere regionale Diversität nahe. Bei Frühgeborenen ohne chronische Lungenerkrankung sind in MRT-Messungen keine Unterschiede zu Reifgeborenen nachzuweisen. Es ist also anzunehmen, dass nicht allein durch die Frühgeburtlichkeit und das geringe Geburtsgewicht eine obstruktive Einschränkung in der Lungenfunktion als Langzeitfolge im Kindesalter weiter fort besteht, sondern der Faktor der BPD zusätzlich zu einem verminderten Gastransfer in der Lunge führt, welcher am ehesten durch eine verminderte Alveolarisierung und Vaskularisation in der Lunge bedingt ist.
Liganden und Rezeptoren des Körpers spielen eine multifaktorielle Rolle in der Regulierung zellulärer Prozesse des Körpers. Der Tumornekrosefaktor (TNF), ein proinflammatorisches Zytokin, bindet natürlicherweise an zwei Rezeptoren, den TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) oder den TNFR-Rezeptor 2 (TNFR2) und kann durch Aktivierung vielfältiger Signalwege unterschiedliche Zelleffekte im Körper auslösen. Während TNF in membrangebundener Form vorkommend TNFR1 sowie TNFR2 optimal stimulieren kann, ist lösliches TNF in der Lage zwar an beide Rezeptoren zu binden, natürlicherweise jedoch nur den TNFR1 zu stimulieren. Da eine unkontrollierte Bindung bzw. Aktivierung von beiden Rezeptoren schwere unerwünschte Nebenwirkungen wie Inflammationen haben kann, wurden zur konkreten Aktivierung der einzelnen Rezeptoren TNFR1 und TNFR2 spezifische TNF-Mutanten, wie TNF80 zur Bindung an TNFR2 und TNF60 zur Bindung an TNFR1 konstruiert. Durch die TNF-Mutante TNF80 gelingt es die TNFR2 Wirkungskette zu aktivieren, während die TNFR1-Stimulation verhindert wird. Die Aktivierung des TNFR2-Rezeptors hat eine Stimulierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs) zur Folge.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden einerseits die TNF-TNC-Formen weiterentwickelt, indem die konstante Domäne der schweren Antikörperkette des humanen IgG1 (Fc) hinzukloniert wurde. Hier wurde primär der Effekt der Oligomerisierung mit der aktivierenden Wirkung auf TNFR2 erforscht. Weiterhin wird jedoch durch die Bindungsspezifität des Fc-Fusionsproteins von TNF80 an Tregs eine antitumorale Wirkung ausgelöst, indem durch das ausgelöste ADCC die Tregs zerstört werden.
Andererseits wurden Kombinationskonstrukte von TNF80 und IL2 kloniert um die Bindungsspezifität des Fusionsproteins auf TNFR2, ebenso wie den IL2-Rezeptor welcher auf regulatorischen T-Zellen hoch exprimiert wird, herzustellen.
Die spezifische Stimulation von Tregs würde der Therapie von Autoimmunerkrankungen dienen.
In der Abteilung für Molekulare Innere Medizin in Würzburg wurde eine kovalent verknüpfte, nonamere Form von TNF, nämlich eine single-chain-TNF-TNC-Form hergestellt, sodass auch die Aktivierung von TNFR2 durch lösliches TNF möglich ist, was zur klinischen Anwendung (durch Injektionen) notwendig ist.
Nach Klonierung und Produktion der Konstrukte in HEK293-Zellen erfolgte deren Aufreinigung und Quantifizierung. Letztendlich wurde mittels Bindungsstudien die Funktionalität der aufgereinigten Fusionsproteine überprüft.
Zukünftige Studien müssen nun aufklären, ob die IL8-Produktion durch TNF80(h)-Flag-IL2(h) bzw. TNF80(mu)-Flag-IL2(mu) stimuliert wird, nachdem der IL2-Teil der Konstrukte den IL2-Rezeptor gebunden hat.
Antikörper, die Oberflächenantigene erkennen, sind sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie verschiedener Erkrankungen von enormer Bedeutung. Damit Antikörper in diesen Bereichen eingesetzt werden können, ist es sehr wichtig, dass die Interaktion eines Antikörpers oder auch eines Antikörperkonjugats mit seinem Antigen oder Fc-Rezeptoren ausreichend charakterisiert wird. Hierfür werden meist zellfreie Verfahren angewandt, wie die isotherme Titrationskalorimetrie oder die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Diese unterliegen verschiedenen Limitationen, beispielsweise der Verfügbarkeit von rekombinantem Antigen. Vor allem aber werden zelluläre Einflüsse, die die Bindungseigenschaften der Antikörper beeinflussen, nicht berücksichtigt. Aber auch die derzeit angewandten Verfahren für zelluläre Bindungsstudien können problematisch sein, da sie meist auf Antikörpern basieren, die biochemisch markiert worden sind, was zu funktionellen Beeinträchtigungen führen kann. Außerdem zeigen solche Antikörper häufig keine einheitliche Stöchiometrie der jeweiligen Reporterstoffe und die Reproduzierbarkeit des Markierungsverfahrens ist in den meisten Fällen nicht gewährleistet. Positionsspezifische Markierungen sind jedoch vergleichsweise sehr aufwendig.
Um die genannten Probleme zu umgehen, wurden in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des Fn14-spezifischen Antikörpers 18D1 Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert, die an verschiedenen Positionen genetisch mit der Gaussia princeps Luziferase (GpL) fusioniert worden sind. Dabei zeigte sich, dass die Positionierung der Luziferase am C-Terminus der leichten Kette des Antikörpers (GpL(CT-LC)) die Bindungseigenschaften der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine an Fn14 und an die verschiedenen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) nicht oder nur in geringem Umfang beeinflusst. Auch die agonistische Aktivität der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine, welche abhängig ist von der Oligomerisierung über Protein G oder der FcγR-Bindung, wurde durch die GpL-Markierung nicht wesentlich beeinflusst. Diese Ergebnisse ließen sich am Bespiel von 18D1 ebenfalls auf die dimeren Antikörper-Isotypen IgG2, mIgG1 und mIgG2A übertragen. GpL-Fusionsproteine der Antikörper E09-IgG1 (CD95-spezifisch), G28.5-IgG1 (CD40-spezifisch) und BHA10-IgG1 (LTβR-spezifisch) zeigten gleichfalls keine gravierenden Veränderungen der Bindungseigenschaften oder den funktionellen Eigenschaften, was für eine breite Anwendbarkeit von GpL-Antikörper-Fusionsproteinen spricht.
Zusammenfassend betrachtet zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass die genetische Fusion der Gaussia princeps Luziferase an das C-terminale Ende der leichten Antikörperkette eine sehr gute Möglichkeit darstellt, Antigen-Antikörper-Interaktionen zu charakterisieren ohne dabei mit den Eigenschaften des Antikörpers zu interferieren. Dabei besticht dieser Ansatz im Vergleich zu anderen gängigen Verfahren durch seine Reproduzierbarkeit, eine einfache Handhabung, geringe Kosten und eine extrem hohe Sensitivität. Außerdem könnte dieses Antikörper-Fusionsproteinformat zukünftig auch in vielen Bereichen als Tracer eingesetzt werden mit dem Vorteil, dass keinerlei Radioaktivität benötigt werden würde.
Ausgehend von chlorhaltigem Oligosilan, erhalten durch Disproportionierung der „Disilan-Fraktion“ der Müller-Rochow-Synthese, wurde mit verschiedenen Aminen dechloriert bzw. strukturell modifiziert. Die auf diese Weise in das Oligosilan eingeführten Baugruppen wurden spektroskopisch und durch Vergleich mit geeigneten Modellverbindungen identifiziert. Vernetzungsgrad und keramische Ausbeute der erzeugten Materialen wurden bestimmt.
Mit Ammoniak oder einwertigen Aminen wie Methylamin werden Produkte erhalten, die sich nicht zu Keramikfasern verarbeiten lassen. Letzteres scheitert daran, dass entweder keine signifikante Molekulargewichtserhöhung des Oligosilans erreicht wird, oder führt dazu, dass das Oligomer vergelt und damit in Toluol unlöslich wird.
Durch Umsetzung des Oligosilans mit zweiwertigen Aminen wie EDA oder TMDA als Vernetzungsreagenz gelang es, eine Syntheseroute zu entwickeln, die – anders als bei der am ISC etablierten Route – keinen thermischen Vernetzungsschritt erfordert, d.h. die gesamte Synthese findet bei Temperaturen ≤200 °C statt. Hierbei wird eine kontrollierbare Erhöhung des Molekulargewichts erreicht. Die Verwendung von TMDA hat gegenüber EDA den Vorteil, dass aufgrund des Ausbleibens von Ringbildung ein höher vernetztes Polymer erhalten wird.
Darüber hinaus wurde gefunden, dass Grünfasern während der Pyrolyse durch radikalisch vernetzbare Gruppen (C=C-Doppelbindungen) im Polymer stabilisiert werden können. Diese Gruppen lassen sich entweder durch Dechlorierung mit Allylamin oder durch Umsetzung mit Vinyl-Grignard-Reagenzien einführen. Allylamin erwies sich hierbei als geeigneter, da es preiswerter und leichter handhabbar ist und außerdem – im Gegensatz zu Vinyl-Grignard-Reagenzien – eine vollständige Dechlorierung des Polymers gestattet.
Alle Polymere wurden auf ihre Verarbeitbarkeit zu Grün- und anschließend zu Keramikfasern untersucht. Hierbei wurde gefunden, dass die im Hinblick auf die Eigenschaften der resultierenden Keramikfasern günstigste Rezeptur in der Umsetzung eines zuvor mit DMA vollständig dechlorierten Oligosilans mit 18,2 mol-% TMDA und 40 mol-% Allylamin (bezogen auf NMe2-Gruppen) besteht. Die aus diesem Polymer erhaltenen Keramikfasern zeigen die für noch nicht technisch ausgereifte, im Stadium der Entwicklung befindliche Fasern typischen Festigkeiten und entsprechen damit denjenigen, die auf der am ISC bereits etablierten Route erhältlich sind. Dies macht sie zu aussichtsreichen Kandidaten für die weitere Optimierung.
Krebs gehört zu einem der zentralen Leiden der 21. Jahrhunderts und ist in den einkommensstarken Ländern die zweithäufigste Todesursache. Die Erkrankung Multiples Myleom (MM) gehört mit 1.3 % aller Krebserkrankungen zwar zu den seltenen Formen, verläuft jedoch meist tödlich und zeichnet sich durch eine unkontrollierte Entartung der monoklonaler Plasmazellen im Knochenmark aus. Da maligne Zellen dauerhaft internen und externen Stressfaktoren ausgesetzt sind und auf die Hitzeschutzantwort angewiesen sind, stellen die Komponenten des Hitzeschocksystems wie z.B. Chaperone HSP70 und HSP90 bzw. der Hitzeschockfaktor HSF1 ein attraktives therapeutisches Ziel dar. Nachweislich führt die Inhibition des Chaperons HSP90 zur HSF1-vermittelten Hochregulation des Proteins HSP70, sodass die Hitzeschutzantwort der zytotoxischen Aktivität der Inhibitoren entgegenwirkt und die Therapieerfolgschancen mindert.
Die vorliegende Doktorarbeit, die im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) ausgearbeitet wurde, befasste sich einerseits mit der Erweiterung der bereits vorhandenen Substanzbibliotheken sowohl zur Inhibition des Proteins HSP70 als auch des Transkriptionsfaktors HSF1. Hierdurch sollten detailliertere Struktur-Wirkungs-Bezeugungen evaluiert werden. Weiterhin wurden die kooperierenden Arbeitsgruppen des Forschungsprojektes durch die Entwicklung und Herstellung von Substanzen unterstützt, um mit Hilfe vielseitiger Methoden die exakten Wirkmechanismen beider Verbindungsklassen zu verstehen und aufzuklären.
Die bereits bestehende Substanzbibliothek der 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivate aus der vorangehenden Arbeit wurde erfolgreich um neue Carbonsäure- ((±) 6a-j) und Carbonsäureamidverbindungen ((±) 7b-e) erweitert. Durch die Substitution phenolischer Seitengruppen der Isoquinolinone gelang es, Säurederivate herzustellen, die eine höhere Zytotoxizität auf den INA-6-Zellen als die Leitstruktur AH073t aufwiesen. Dabei handelt es sich um die monobromierte Verbindung (±) 6c (EC50 = 0.17 µM) oder das Derivat mit einem kurzem Bromoethoxylinker (±) 6j (EC50 = 0.18 µM). Parallel hierzu wurde festgestellt, dass die Substitution aromatischer Seitengruppen durch aliphatische Reste ((±) 6h-i) zum kompletten Aktivitätsverlust führte. Durch dir fortführende Umsetzung zu den Amiden gelang die Herstellung des Derivates (±) 7c (EC50 = 0.47 µM), welches eine ähnliche Aktivität im Vergleich zu der Struktur AH122t ((±) 7a) zeigte. Weiterhin wurde Verbindung (±) 7d identifiziert, die eine sechsfach höhere Zytotoxizität von 34.8 nM im Vergleich zu der Leitstruktur (±) 7a (EC50 = 200 nM) aufwies.
Die Trennung der trans-Enantiomere der Leitstruktur AH073t wurde erfolgreich mit Hilfe einer chiralen chromatographischen Methode durchgeführt und die Absolutkonfiguration mit Hilfe der Circulardichroismus-Spektroskopie (Arbeitskreis Bringmann) bestimmt. Durch die biologische Untersuchung an den MM-INA-6-Zellen (Arbeitskreis Chatterjee) wurde die enantiospezifische Aktivität des 3R,4R-Enantiomers bestätigt, wohingegen das 3S,4S-Isomer hingegen nicht aktiv war. Die angestrebte Amidierung zu enantiomerenreinen Substanzen führte gegen die Erwartung zu einem Diastereomerengemisch, da aufgrund des aciden Protons am Kohlenstoff C-4 die Carbonsäuren im Laufe der Synthese epimerisierten.
Um die Epimerisierung an der aciden Position zu vermeiden, wurden neuartige Isochinolinoncarbonsäure-Derivate hergestellt, die erstmalig an dem Kohlenstoff C 4 substituiert wurden. Mit Hilfe einer Schutzgruppentechnik wurden in drei Syntheseschritten erfolgreich drei neue Derivate, nämlich eine fluorierte ((±) 11), methylierte ((±) 15) und ethylierte Verbindung ((±) 16), erhalten. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der fluorierten und ethylierten Spezies gelang durch die Röntgenstrukturanalyse der Einkristalle (Arbeitskreis Braunschweig). Dabei wurde festgestellt, dass die Alkylierungsreaktion stereospezifisch verliefen und ausschließlich cis-Derivate erhalten wurden. Die biologische Untersuchung dieser Substanzen bestätigte die Konfiguration, da alle drei Verbindungen keine Aktivität auf MM-INA-6-Zellen zeigten (EC50 >100 µM). Weiterhin wurde mit Hilfe einer UV-metrischen Messung die Sättigungskonzentration der neuen Derivate untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die Substitution am Kohlenstoff C-4 zur Senkung der Löslichkeit geführt hat.
Anhand der Proteinkristallstruktur des bHSC70 (C.Grimm) wurde ein TMAO-Molekül in der Nähe der der Interface-Oberfläche identifiziert. Basierend auf diesem Ergebnis wurde eine Methode zur Herstellung eines TMAO-Isochinolinonhybrides entwickelt, welches sich an der Leitstruktur AH073t orientierte. Während der Synthesesequenz ist es zu der Decarboxylierung des angestrebten 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivates gekommen, wodurch das neue Derivat 17 erhalten wurde. Nachdem die Reaktionsbedinungen variiert und die gewünschte Verbindung nicht erhalten wurde, wurde 17 im darauffolgenden Syntheseschritt erfolgreich zum TMAO-Hybrid 18 umgesetzt.
Der Szintillationsnähenachweis (SPA) ist eine etablierte Methode, um mit Hilfe von radioaktivmarkierten Liganden Bindungsstudien im Hochdurchsatzformat durchzuführen und hier die Bindungsposition der Isochinolinon-Derivate zu untersuchen. Die Substanz AH122t diente hierbei als Leitstruktur zur Entwicklung einer Methode zur Radioaktivmarkierung der potentiellen HSP70-Inhibitoren, sodass die aktivierte Stanylverbindung (±) 19 erhalten wurde. Diese Verbindung konnte in der Gegenwart von Chloramin T und des NaI-Salzes innerhalb von wenigen Sekunden zum Radioliganden (±) 7d* umgesetzt werden. Die Herstellung des Radioliganden wurde mittels einer entwickelten HPLC-Methode analysiert und validiert.
Eine weitere Möglichkeit zur Evaluieren der potentiellen Bindungspartner der hergestellten Isochinolinon-Verbindungen bietet die Affinitätschromatographie gekoppelt mit der proteomischen Analyse mittels quantitativer Massenspektrometrie (Arbeitskreis Schlosser). Es gelang die Herstellung der Biotin-markierter Liganden (±) 23, der sich an der Leitstruktur AH073t orientierte, und (±) 25, der sich an AH081t orientierte. Die ersten Analysen mittels Affinitätschromatographie zeigten, dass mit dem Liganden (±) 23 überraschenderweise keine Proteine signifikant angereichert wurden, während mit dem Liganden (±) 25 zwar keine HSP70-Proteine angereichert, aber einige Komponenten der Hitzeschutzantwort wie die Phosphatidylinositol-Kinasen DNA-PK und ATM, und die Untereinheiten des Chaperons HSP90 identifiziert werden konnten.
Die bereits bestehende Substanzbibliothek der -Acylaminocarboxamide wurde erfolgreich mit Hilfe der Ugi-Multikomponentenreaktion um die Derivate (±) 38c-g erweitert. Die Evaluierung der biologischen Aktivität erfolgte semiquantitativ mittels Westernblot und quantitativ mittels ELISA-Assay (Arbeitskreis Chatterjee), wobei die Beurteilung indirekt anhand des HSF1-vermittelten Regulationslevels des Chaperons HSP72 erfolgte. Hierbei wurden neue Verbindungen (±) 38c und (±) 38g mit dem ,-gesättigten Carbonylsystem identifiziert, die eine vergleichbare inhibitorische Aktivität wie die bereits bekannten ungesättigten Derivaten (±) 37l oder (±) 37m zeigten, was darauf hinweist, dass die inhibitorische Aktivität der Acylaminocarboxamide nicht von der kovalenten Bindung des Michael-Systems verursacht wird.
Um das Target der -Acylaminocarboxamide zu evaluieren, wurde auch hier die Durchführung der Affinitätschromatographie gekoppelt mit der Analyse mittels der quantitativer Massenspektrometrie angestrebt (Arbeitskreis Schlosser). In Anlehnung an die Synthesemethodik für die HSP70-Liganden wurden hierfür die Biotin-markierten Liganden (±) 42, (±) 44 und (±) 46 erfolgreich hergestellt, die sich durch die Position des Biotinlinkers unterscheiden.
Die proteomische Untersuchung wurde erfolgreich mit den Liganden (±) 44 und (±) 46 durchgeführt und es wurden 68 Proteine signifikant angereichert. Viele dieser Proteine tragen die sogenannte Armadillo-Domäne, die eine wichtige Rolle in der Protein-Protein-Interaktion spielt und eine hochkonservierte Bindungstasche aufweist. Unter den angereicherten Proteinen befanden sich mitunter der MICOS-Komplex, der CCR4-NOT-Komplex und die Kinasen des Phosphatidylinositol-Signalwegs. Von den letzteren konnten explizit die Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR identifiziert werden, die möglicherweise die HSF1-regulierte HSP70-Expression beeinflussen. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Position des Linkers die Bindung an zwei unterschiedliche Proteingruppen beeinflusst. Während der Ligand (±) 44 ausschließlich mit den Proteinen des CCR4-NOT-Komplexes interagierte, wurden für den Liganden (±) 46 die Komponenten des COG Komplexes identifiziert.
Bisher getestete Knochenkleber zeigen häufig geringe Klebeeigenschaften auf Knochen bei Zutritt von Feuchtigkeit. Gegenstand dieser Arbeit war es, die Haftfähigkeit im feuchten Milieu zu verbessern. Hierfür wurde der Einfluss sternförmiger, mit Isocyanaten funktionalisierter Poly(ethylenglykol) Moleküle (NCO-sP(EO-stat-PO)) auf die Klebefestigkeit und Alterungsbeständigkeit einer photopolymerisierbaren Poly(ethylenglykol)dimethacrylat-Basis (PEGDMA) untersucht. Die Polymerisation mittels energiereicher Strahlung erlaubt hohe Reaktionsraten bei Körpertemperatur sowie zeitliche und örtliche Kontrolle über die Polymerisationsreaktion. Durch den Zusatz degradierbarer, keramischer Füllstoffe auf Calciumsulfat- und Magnesiumphosphat-Basis in die Matrix sollten durch Lösungsprozesse Poren geschaffen werden. Diese könnten das Einwachsen neuer Knochensubstanz in das ausgehärtete Material ermöglichen. Die Veränderungen der kristallinen Strukturen wurden mittels Röntgendiffraktometrie beobachtet. Zudem wurden die Proben infrarotspektroskopisch und mikroskopisch untersucht. Die Klebefestigkeit auf kortikalem Rinderknochen im Abscherversuch ebenso wie die Biegefestigkeit vor und nach Lagerung in feuchter Umgebung wurde unter Variation des NCO-sP(EO-stat-PO)-Gehaltes ermittelt. Anschließend sollten die mikroskopische Analyse und energiedispersive Röntgenspektrometrie (EDX) Aufschluss über das Bruchverhalten des Materials beim Klebeversuch geben.
Es konnte gezeigt werden, dass durch die Zugabe von 20 bis 40 Gew.-% NCO sP(EO-stat-PO) zur Matrix die Klebefestigkeit auf Knochen von initial etwa 0,15 bis 0,2 MPa auf etwa 0,3 bis 0,5 MPa gesteigert werden kann. Während alle Referenzproben ihre Haftung an Knochen innerhalb von weniger als 24 Stunden verloren, zeigten Proben mit NCO sP(EO-stat-PO) auch nach 7-tägiger Lagerung noch Festigkeiten von 0,18 bis 0,25 MPa. Die höchste Festigkeit nach 7 Tagen war bei Proben mit dem Füllstoff Newberyit und einem NCO-sP(EO-stat-PO)-Anteil von 40 Gew.-% zu verzeichnen. Diese Proben wiesen auch in der mikroskopischen Analyse und im EDX eindeutig ein rein kohäsives Versagen auf. 20%-ige Proben zeigten zumindest in geringem Maße auch adhäsives Versagen.
Die 3-Punkt Biegefestigkeit lag initial bei 3,5 bis 5,5 MPa. Durch die Lagerung in PBS sank die Festigkeit auf ~1 MPa. Die Zugabe von NCO-sP(EO-stat-PO) und die Art des eingesetzten Füllstoffes hatten kaum einen Einfluss auf diese.
In dieser Arbeit wird die Photophysik von Einzelphotonenemittern unterschiedlicher Materialklassen, wie Fehlstellen in Diamant und Siliziumcarbid sowie organischer Moleküle bei Raumtemperatur untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein hochauflösendes konfokales Mikroskop konzipiert und konstruiert, welches die optische Detektion einzelner Quantensysteme ermöglicht. Zusätzlich werden verschiedene Methoden wie die Rotationsbeschichtung, das Inkjet-Printing und das Inkjet-Etching in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Strukturierbarkeit von organischen Leuchtdioden (OLEDs) verglichen. Im weiteren Verlauf werden die optoelektronischen Prozesse in dotierten OLEDs untersucht, ausgehend von hohen Dotierkonzentrationen bis hin zur Dotierung mit einzelnen Molekülen. Dadurch kann die Exzitonen-Ladungsträger Wechselwirkung auf und in der Umgebung von räumlich isolierten Molekülen analysiert werden.
Einsatz biokompatibler Polymermembranen zur Therapie kongenitaler Bauchwanddefekte im Rattenmodell
(2017)
Kongenitale Bauchwanddefekte sind dramatische Fehlbildungen der vorderen Bauchwand. Zu den Defekten gehören neben der Nabelhernie und dem Blasenextrophie-Komplex im engeren Sinne die Gastroschisis und die Omphalozele. Die Therapie stellt die behandelnden Kinderchirurgen und Neonatologen vor eine große Herausforderung. Methode der Wahl ist der primär operative Bauchdeckenverschluss. Falls aufgrund der Größe des abdominellen Defekts oder der viszeroabdominellen Diskrepanz ein primärer Verschluss nicht möglich ist, wird eine Schusterplastik angelegt oder ein Patch implantiert. Bei den Implantaten unterscheidet man nicht-resorbierbare Materialien wie Polypropylen und Polytetrafluorethylene (GoreTex®) von resorbierbaren Patchs wie zum Beispiel humane Dura, porkine Dünndarmsubmukosa, oder azellularisiertes Rinderperikard (Lyoplant®). Die Ansprüche an ein solches Implantat sind hoch und das perfekte Material wurde bis heute noch nicht gefunden. Ideale Eigenschaften sind eine gute Handhabung und Nähbarkeit, Resorbierbarkeit, Anti-Adhäsivität zum Intestinum, Stabilität und Elastizität sowie die Transplantatakzeptanz.
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung bipolarer Polymermembranen zur sicheren und effektiven Therapie kongenitaler Bauchwanddfekten im Rattenmodell. Bei den Polymermembranen handelt es sich um zweischichtige Implantate, welche aus einem Film und einem aufgesponnen Vlies bestehen. Der Film besteht aus dem Resomer LR708, dem linearen PEG-PLA und dem Polyurethan CW1681. Der mittels Electrospinning auf den Film aufgebrachte Vlies ist aus reinem PLA. Die Implantate sind zwischen 20 und 67 µm dick. Als Vergleich diente das bereits im Klein- und Großtiermodell von Meyer et al. etablierte Kollagen-Mesh Lyoplant®.
Als Versuchstiere des Experiments dienten n=34 männliche Wistar Furth Ratten, denen intraoperativ ein 2 x 2 cm großer Bauchwanddefekt zugeführt wurde, der anschließend mit einem gleich großen Patch verschlossen wurde. N=25 Tiere erhielten eine bipolare Polymermebran, n=2 Tiere Lyoplant und n=7 Ratten dienten zur Kontrolle. Nach 21 Tagen fand ein erneuter Eingriff statt. Hierbei wurde das Implantat samt umliegendem Gewebe explantiert und histologisch ausgewertet. Neben der Gewichtszunahme wurden die Ratten auf die Bildung von Hernien und intraabdominellen Adhäsionen sowie auf histologische Veränderungen untersucht. Von n=34 Ratten verstarben n=9 aus unterschiedlichen Gründen. Alle explantierten Wistar Furth Ratten (n=25) zeigten im dreiwöchigen postoperativen Verlauf (Δt=3 Wochen) physiologische Gewichtskurven. Alle Ratten mit Polymer-Implantat entwickelten im dreiwöchigen Verlauf eine abdominelle Hernie sowie Adhäsionen. Eine Zellinfiltration und Gefäßeinsprossung im Sinne einer Neovaskularisation konnte nicht nachgewiesen werden. Die histologische Auswertung ergab eine bindegewebige Veränderung im angren-zenden Gewebe, die zusammen mit der immunhistochemisch gesicherten hohen Anzahl an CD68 positiven Zellen (Makrophagen) einer Immunreaktion über den TH1-Pathway entspricht. Bei fehlender Integration in das Gewebe, kommt dies einer Implantatabstoßung gleich. In den Tieren mit Lyoplant® konnten wir die Ergebnisse von Meyer et al. bestätigen.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass die bipolaren Polymermembranen viele Eigenschaften eines idealen biokompatiblen Materials erfüllen, jedoch aufgrund der fehlenden mechanischen Stabilität nicht zur Therapie von kongenitalen Bauchwanddefekten geeignet sind. Lyoplant® hingegen erwies sich in Bezug auf fehlende Hernienbildung und Adhäsionen, Gefäßeinsprossung und Trans-plantatakzeptanz im Vergleich zu den Polymeren als äußerst gut geeignetes Material. Um das operative Ergebnis weiter zu perfektionieren, könnte die Besiedelung des Kollagen-Meshs mit Stammzellen experimentell getestet werden. Inwieweit Lyoplant® dann für die Therapie der kongenitalen Bauchwanddefekte geeignet ist, müssen weitere klinische Studien zeigen.
Stickstoffdioxid ist ein Luftschadstoff, der mit dem Auftreten von allergischen Atemwegserkrankungen assoziiert ist. In dieser Studie wurde ein möglicher proallergischer Effekt von Stickstoffdioxid auf die durch eine Hausstaubmilbenallergie verursachte allergische Rhinitis untersucht. Primärzellkulturen aus nasalen Epithelzellen wurden einer einstündigen Gasexposition mit 0,1 ppm, 1 ppm und 10 ppm Stickstoffdioxid unterzogen, gefolgt von einer Exposition mit dem Hausstaubmilbenallergen Der p 1. Zellkulturen, die einer kombinierten Exposition aus 0,1 ppm Stickstoffdioxid und Der p 1 oder 1 ppm Stickstoffdioxid unterzogen wurden, zeigten eine erhöhte Induktion der Zytokine IL-6 und IL-8. Kein Effekt war bei einer reinen Exposition mit Der p 1 oder einer reinen Gasexposition zu beobachten. Über eine verstärkte Induktion von IL-6 und IL-8 kann Stickstoffdioxid einen proinflammatorischen Einfluss auf das Entzündungsgeschehen der allergischen Rhinitis nehmen und die Entstehung einer Sensibilisierungsreaktion fördern. Ein proinflammatorischer Effekt wurde bereits bei einer Stickstoffdioxidkonzentration von 0,1 ppm nachgewiesen, welche in Ballungsräumen von Industriestaaten regelmäßig erreicht wird.