Refine
Has Fulltext
- yes (14)
Is part of the Bibliography
- yes (14)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (11)
- Journal article (3)
Keywords
- Lymphozyt (14) (remove)
Institute
- Institut für Virologie und Immunbiologie (7)
- Kinderklinik und Poliklinik (3)
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (1)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (1)
- Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkrankheiten, plastische und ästhetische Operationen (1)
- Pathologisches Institut (1)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (1)
Newly isolated lymphocytes from mousespleensexpress the c-fos oncogene even in the absence of mitogen with maximal mRNA levels 60 min post preparation of single cell suspension, whereas c-myc mRNA Ievels increase only after mitogenic Stimulation with maximal mRNA Ievels 6 h post Stimulation. The half-lives of c-fos mRNA are generally very short; they increase from 14 min (after 30 min of culture) to 70 min (after 2 h of culture). The half-lives of c-myc mRNA decrease from 50 min (at 2 and 6 h post stimulation with concanavalin A) to 12 min (at 48 h post stimulation). The c-fos gene transcription is already tumed on in time-0 lymphocytes 10 min after disruption of the organ structure of the spleens and is down-regulated after 2 h and later. In nuclear run-on experiments with nonstimulated lymphocytes there is already significant transcription of the first exon of c-myc, but almost no elongation of the transcript to exon 2 and 3. In concanavalin A-treated lymphocytes elongation is stimulated about 5-fold within 6 h and returns to background levels at 48 h post Stimulation. · The nuclear run-on analyses of nonactivated lymphocytes showed a signal for RNA complementary to c-myc mRNA detected with a probe specific for the exon 1/intron 1 boundary of c-myc, which disappeared with increasing time of concanavalin A Stimulation. This anti-sense transcription may play a role in regulating the elongation of cmyc transcripts.
Protein kinase B (PKB), a serine threonine kinase, is highly involved in the regulation of cellular proliferation and survival. To characterize PKB’s function in lymphocyte development and activation, transgenic (tg) mice that express a membrane targeted constitutively active form of PKBa (myr PKB) in T and B cells were analysed. Thymocytes from myr PKB tg mice showed enhanced proliferation after T cell receptor (TCR) engagement compared to wild type (wt) mice. Astonishingly, myr PKB tg thymocytes were capable to proliferate in response to PMA only and were also less sensitive to inhibition by the calcineurin inhibitors CsA or FK506, which indicates the proliferative response of myr PKB tg T cells is relatively independent of calcium mobilisation and calcineurin activity. In addition, when TCR signalling was inhibited by the MEKinase inhibitor PD98059 or the Srckinase inhibitor PP1 myr PKB tg thymocytes again were more resistant to inhibition. Western blot analysis revealed myr PKB enhances activation of the kinases Lck, Raf and Erk after TCR/CD3 stimulation. Thus, myr PKB renders proliferative responses of thymocytes more sensitive to TCR signals by positive regulation of the Lck-Raf-MEK-Erk signalling pathway. Studies on the cellular location of the tg protein showed myr PKB is located in membrane socalled “lipid rafts”. Furthermore, we found that after TCR/CD3 ligation endogenous cytoplasmic PKB moves into “lipid rafts”, which highlights PKB as a crucial mediator of TCR proximal signalling events. Analysing three different TCR tg model systems for positive and negative selection of immature precursors in the thymus, we found myr PKB promotes positive selection of CD4+ but not CD8+ T cells. This most likely results from PKB’s positive cross-talk on Lck-Raf-Erk signalling, which is known to influence thymocyte selection and CD4/CD8-lineage choice. Furthermore, myr PKB enhances phosphorylation of glycogen synthase kinase 3 (GSK3), a negative regulator of the transcription factor NFAT (nuclear factor of activated T cells) and T cell activation, and of the adapter protein c-Cbl. Concerning negative selection, myr PKB enhanced (OT1 mice), reduced (HY mice) or had no influence (OT2 mice) on negative selection. Thus, myr PKB’s effect on negative selection strongly depends on the model system analysed and this most likely results from differences in TCR affinity/avidity and TCR specificity for MHC. 106 Peripheral CD4+ T cells from myr PKB tg mice showed enhanced production of both Th1 and Th2 cytokines. Furthermore, after TCR/CD3 stimulation in the presence of TGF-b1, wt CD4+ T cells showed a drastic inhibition of proliferation, whereas myr PKB tg CD4+ T cells proliferated even better, i.e. they were resistant to the inhibitory TGF-b1 signals. Expression of myr PKB in B cells leads to reduced Ca2+ flux and proliferation after BCR stimulation, but activation of Lyn, SLP-65, c-Cbl and GSK-3 were enhanced. When we analysed B cell subsets in myr PKB tg mice, a decrease in immature and mature B cells became obvious, whereas cell numbers for marginal zone (MZ) B cells were normal. In aged myr PKB tg mice we detected a very strong reduction of pro/pre and immature B cell populations in the bone marrow, indicating PKB is very important for maintenance of B cell development. Furthermore, myr PKB also lead to a strong reduction of peritoneal B-1 cells. However, expression of NFATc1, which is required for B-1 cell development, was comparable between wt and myr PKB tg B-1 cells. To analyse the effect of myr PKB on immunoglobulin production, mice were immunized with thymus dependent (TD) and independent (TI) antigens. In both cases, B cell responses were strongly elevated in myr PKB tg mice. Finally, RT-PCR analyses of in vitro expanded B cells revealed increased Blimp-1 and Notch3 expression in myr PKB tg B cells, which might be primary candidates involved in their enhanced effector function. In summary, this study clearly shows an important cross-talk between PKB and various critical signalling molecules downstream of the TCR and BCR. Thereby active PKB modulates and regulates the thresholds for thymocyte selection and T cell activation as well as for B cell development and function.
Neben dem bekannten Tropismus des Masernvirus für CD150-positive aktivierte Zellen des Immunsystems, spielt der Endothelzelltropismus für die akute Masernviruserkrankung einschließlich ihren nachfolgenden Komplikationen eine wichtige pathogene Rolle. Die Infektion der Endothelzellen steht in Zusammenhang mit dem Auftreten des MV-Exanthems. Es ist auch möglich, dass die „Akute Enzephalitits“ und der Viruseintritt ins zentrale Nervensystem wie im Falle der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) durch Endothelzellinfektion vermittelt wird. Ziel der Arbeit war herauszufinden, wie und ob das MV Endothelzellbarrieren überwinden kann mittels Transport infizierter Leukozyten oder durch Infektion von EZs mit basolateraler Virusfreisetzung. Es wurde untersucht, ob die Fähigkeit von primären humanen T- Zellen durch polarisierte Zellschichten von „human brain microvascular endothelial cells“ (HBMECs) zu wandern durch die Infektion beeinflusst wird. Die Fähigkeit von infizierten Lymphozyten durch die Poren der Filter zu wandern war teilweise beeinträchtigt, jedoch war das Ergebnis statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die Fähigkeit der Zellen durch Endothelzellbarrieren zu wandern drastisch reduziert. Nach Infektion adhärierten die Leukozyten stärker auf den Endothelzellen. Bei dieser Adhäsion von PBMCs an Endothelzellen kam es trotz Infektion zur Ausbildung von sogenannten „transmigratory cups“ oder docking- Strukturen. Dieser enge Zell-Zell-Kontakt hatte zur Folge, dass die MV-Infektion vom Lymphozyten auf die Endothelzelle übertragen wurde. Die MV-Hüllproteine wurden auf der apikalen und basolateralen Seite infizierter Endothelzellen exprimiert wie anhand von Aufnahmen mit dem konfokalen Mikroskop am Beispiel des H-Proteins gezeigt werden konnte. Titrationen ergaben, dass das Virus auf beiden Seiten der Zellen freigesetzt wurde. Desweiteren wurde bestätigt, dass auch für polarisierte Endothelzellen die auf Tyrosin basierenden Transportsignale verantwortlich sind für die basolaterale Virusfreisetzung. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass das Virus mit Hilfe der Infektion und der bipolaren Virusfreisetzung über Endothelzellbarrieren
Die Juvenile Idiopathische Arthritis ist eine der häufigsten Ursachen von Gelenkbeschwerden im Kindesalter. Die Pathogenese der Erkrankung ist bisher wenig verstanden. Da sich jedoch bei einigen Subtypen der JIA Antinukleäre Antikörper (ANA) nachweisen lassen, liegt eine Beteiligung von B-Lymphozyten nahe. Mittels einer Kombination aus phänotypischer Zuordnung bestimmter B-Zell Differenzierungsstadien sowie Einzelzellsortierung, Amplifikation und Sequenzierung des rearrangierten Immunglobulingens individueller B-Zellen wurde der Frage nach klonaler Verwandschaft unterschiedlich differenzierter B-Zell Stadien und Selektion innerhalb des Gelenkes nachgegangen.
Beim Zigarettenrauchen als der häufigsten Form des Tabakkonsums stellt das respiratorische Epithel des oberen und unteren Aerodigestivtraktes das primäre Kontaktorgan der zyto- und genotoxischen Inhaltsstoffe dar. Nikotin, das Hauptalkaloid des Tabaks, ruft nicht nur eine starke Abhängigkeit hervor, sondern kann in Anbetracht früherer Studien auch zum Tabak assoziierten Krebsrisiko beitragen. Neben tumorproliferativen Effekten wie etwa der Angioneogenese, der Zellproliferation oder einer Apoptoseinhibition ist die Rolle der tumorinitiierenden Wirkung von Nikotin durch eine direkte Schädigung der DNA noch unzureichend untersucht. Ziele dieser experimentellen Arbeit waren deshalb, Nikotin induzierte DNA-Schäden an frisch isolierten sowie rekultivierten humanen Lymphozyten mit Hilfe des alkalischen Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Comet) Assays darzustellen, den Nachweis dieser Schäden durch Koinkubation mit dem Reparaturenzyminhibitor Aphidicolin (APC) zu sensitivieren sowie oxidativ geschädigte Basen durch die Formamidopyrimidin-Glykosylase (Fpg) aufzuzeigen. Durch Koinkubation mit Epibatidin, einem Subtyp spezifischen und kompetitiven Agonisten am nikotinergen Acetylcholinrezeptor (nAChR), wurde die Rolle der rezeptorvermittelten Mechanismen Nikotin induzierter DNA-Schäden an Lymphozyten und nasalen Mukosazellen untersucht. Auch der Frage, ob Rauchen zu einer erhöhten basalen Schädigung an nasalen Mukosazellen führe, wurde nachgegangen. Nach der Zellisolierung der humanen nasalen Schleimhautzellen und peripheren Lymphozyten erfolgte zum Ausschluss zytotoxischer Effekte jeweils vor und nach der einstündigen Fremdstoffinkubation mit Nikotin (1 µM bis 1000 µM), APC (2,5 µg/ml), Epibatidin (1 µM bis 100 µM) und MMS (100 µM) die Bestimmung der Zellvitalität mit dem Trypanblau-Ausschlusstest. Durch Inkubation mit Fpg nach der Lyse zellulärer Membranen erfolgte die Augmentation oxidativ geschädigter Basen. Potentielle DNA-Schäden in Form von Einzelstrangbrüchen und alkalilabilen Stellen der DNA wurden mit dem Comet Assay erfasst. An frisch isolierten Lymphozyten konnte nach ein-stündiger Inkubation mit Nikotin ab 100 µM ein signifikanter DNA-Schaden festgestellt werden. Mit dem Einsatz von Fpg kam es ab 10 µM Nikotin zu einem signifikanten Anstieg der DNA-Fragmentierung. An rekultivierten Lymphozyten konnte nach Kryokonservierung bei einstündiger Inkubation mit Nikotin bereits ab 1 µM eine signifikante DNA-Schädigung nachgewiesen werden, die sich ebenfalls bei Koinkubation mit APC ab 1 µM darstellte. Durch Koinkubation von Nikotin (1000 µM) mit Epibatidin in aufsteigender Konzentration konnte an frisch isolierten Lymphozyten nur in einer Konzentration (10 µM) die Nikotin induzierte DNA-Fragmentierung gesenkt werden. Hierbei zeigte Epibatidin selbst einen DNA-Schaden in niedriger Konzentration (1 µM und 10 µM). An nasalen Mukosazellen konnte der Nikotin induzierte DNA-Schaden durch die Koinkubation mit Epibatidin nicht gesenkt werden. Auch an nasaler Mukosa rief Epibatidin ab 1 µM einen signifikanten DNA-Schaden hervor. Bezüglich einer Einflussgröße durch das Rauchen auf die Ergebnisse im Comet Assay konnte kein Unterschied der basalen als auch der durch Nikotin induzierten DNA-Fragmentierung zwischen der Gruppe der Raucher und Nichtraucher festgestellt werden. Nikotin verursachte bereits bei einer einstündigen Expositionsdauer DNA-Schäden an humanen Lymphozyten und nasalen Mukosazellen. Der Nachweis oxidativ geschädigter Basen an Lymphozyten zeigt auf eine Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Nikotin hin. Die Aktivierung des homomeren α7 nAChR durch Nikotin soll hierbei eine wichtige Rolle als Auslöser der intrazellulären Signaltransduktion der Radikalbildung spielen. Epibatidin als ein starker Agonist am α7 Rezeptor führte bereits in geringen Konzentrationen zu einer signifikanten DNA-Fragmentierung. Bei fehlender Reparatur dieser DNA-Schäden und einer ausbleibenden Elimination der geschädigten Zelle können diese Mutationen akkumulieren und zur Tabak assoziierten Krebsentstehung beitragen. Eine Substitutionstherapie mit Nikotin zur Raucherentwöhnung muss bei solchen Ergebnissen äußerst kritisch betrachtet werden.
Analyse der ontogenetischen Veränderungen in B-Zell-Subpopulationen im Kindes- und Erwachsenenalter
(2011)
B-Lymphozyten sind die zellulären Träger der humoralen Immunität des adaptiven Immunsystems. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei Immundefekten und Autoimmunprozessen. In dieser Arbeit sollen Entwicklungsveränderungen der peripheren B-Zell-Populationen von der Kindheit bis zum Erwachsenenalter charakterisiert und altersabhängige Referenzwerte generiert werden. In einer durchflusszytometrischen Analyse wurden dafür sowohl relative als auch absolute Häufigkeiten für naive B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen, Transitionalzellen, Plasmablasten und CD21 low CD38 low B-Zellen untersucht. Die meisten B-Zell-Subpopulationen zeigen spezifische ontogenetische Veränderungen.
Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten.